吳向陽(yáng)，朱伯淞，韓志湘，王春柳，梁世偉，陳文卉，崔蘊(yùn)晗

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇　鎮(zhèn)江　212013）

遠(yuǎn)紅外Hg2+熒光探針的研制及其在生物成像中的應(yīng)用

吳向陽(yáng)，朱伯淞，韓志湘，王春柳，梁世偉，陳文卉，崔蘊(yùn)晗

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

基于Hg2+誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)硫酯“關(guān)-開(kāi)”環(huán)原理，設(shè)計(jì)合成了一種簡(jiǎn)便的羅丹明101內(nèi)硫酯（1）熒光探針?lè)肿硬⒂糜诃h(huán)境水樣中汞離子的定量檢測(cè)及活細(xì)胞內(nèi)汞離子熒光成像檢測(cè).結(jié)果表明：在測(cè)試體系中加入汞離子，探針?lè)肿?（10 μmol/L）溶液熒光顯著增強(qiáng)，當(dāng)加入等當(dāng)量的汞離子時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了68倍，溶液的顏色也從無(wú)色變?yōu)榱朔奂t色；探針?lè)肿?（10 μmol/L）對(duì)0.1～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)的汞離子響應(yīng)呈線性關(guān)系，R2=0.994 9，檢出限為0.04 μmol/L.選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：探針?lè)肿?對(duì)汞離子有較高的選擇性和較高的靈敏度；探針?lè)肿?可成功用于細(xì)胞內(nèi)汞離子的熒光成像可視化檢測(cè).

遠(yuǎn)紅外；熒光探針；羅丹明101內(nèi)硫酯；Hg2+；熒光成像；生物成像

汞離子是一類痕量存在即可對(duì)人畜造成嚴(yán)重危害的高毒元素，可以造成大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)甚至是腎臟的損傷［1-2］.因此，開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)便的Hg2+檢測(cè)方法并應(yīng)用于環(huán)境和生物樣品中Hg2+的檢測(cè)具有重要的意義.與傳統(tǒng)技術(shù)相比，熒光探針技術(shù)具有高靈敏性、高選擇性和快速分析的特點(diǎn)，尤其是其可利用熒光成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)分析物的可視化檢測(cè)［3-5］.

羅丹明類染料因其杰出的光譜性質(zhì)，如大的摩爾消光系數(shù)、高的熒光量子產(chǎn)率、良好的光學(xué)穩(wěn)定性和長(zhǎng)波長(zhǎng)處的激發(fā)和發(fā)射，而被廣泛應(yīng)用在激光染料、熒光標(biāo)記等生物研究中［6-7］.更重要的是，具有螺環(huán)結(jié)構(gòu)的羅丹明衍生物因在可見(jiàn)光區(qū)無(wú)激發(fā)和發(fā)射而具有在生物應(yīng)用中提供零熒光背景的可能；而其開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)在大于500 nm處具有很強(qiáng)的吸收和熒光發(fā)射［8］.自從1997年Czarnik率先利用羅丹明的這種“關(guān)-開(kāi)”環(huán)前后光學(xué)性質(zhì)發(fā)生顯著差異的性質(zhì)設(shè)計(jì)出檢測(cè)Cu2+的熒光探針以來(lái)，基于該機(jī)理而發(fā)展出來(lái)的熒光探針?lè)脚d未艾［9-12］.

利用Hg2+的親硫性和硫原子的親核性，羅丹明B內(nèi)硫酯和羅丹明6G內(nèi)硫酯及其衍生物被用來(lái)檢測(cè)Hg2+，并表現(xiàn)出很好的選擇性和靈敏度［13-15］.與羅丹明B和羅丹明6G相比，羅丹明101的最大發(fā)射波長(zhǎng)達(dá)到了遠(yuǎn)紅外區(qū)（＞600 nm），在此區(qū)域可有效避免生物分子體內(nèi)自身的背景熒光干擾，更適合于生物樣品中Hg2+熒光成像檢測(cè).目前，僅有幾個(gè)羅丹明101的Cu2+、Zn2+和HOCl熒光探針報(bào)道［16-19］，而識(shí)別Hg2+的羅丹明101熒光探針未見(jiàn)報(bào)道.鑒于此，本文設(shè)計(jì)、合成了羅丹明101內(nèi)硫酯（化合物1）并成功用于活細(xì)胞內(nèi)Hg2+熒光成像可視化檢測(cè).

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

所用試劑包括：1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙酸乙酯、二氯甲烷、硫化鈉、無(wú)水硫酸鎂，均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；100-200目柱層析硅膠，青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；無(wú)水1，2-二氯乙烷，加入氫化鈣回流后蒸餾得到；其它溶劑不經(jīng)純化直接使用；實(shí)驗(yàn)過(guò)程用水均為二次蒸餾水.

所用儀器包括：Lumina型熒光分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo fisher scientific公司產(chǎn)品；UV-2400型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；INOVA-400型核磁共振儀，美國(guó)Varian公司產(chǎn)品；PB-10型精密pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品；AxioObserverA1型倒置熒光顯微鏡，德國(guó)CarlZeiss公司產(chǎn)品.

1.2羅丹明101內(nèi)硫酯（化合物1）的合成

化合物1的合成路線如圖1所示.在25 mL圓底燒瓶中，將122 mg（0.25 mmol）羅丹明101溶解于5 mL 1，2-二氯乙烷中，逐滴加入0.5 mL三氯氧磷（不少于5min）.回流反應(yīng)4h后，冷卻至室溫.旋除溶劑，加入3 mL飽和Na2S溶液，室溫下攪拌過(guò)夜.反應(yīng)后溶液用乙酸乙酯多次萃取，無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾.旋除溶劑得到的粗產(chǎn)物以硅膠柱柱層析（二氯甲烷為淋洗劑）分離，得到淡黃色固體53 mg，產(chǎn)率為41.9%.

圖1　化合物1的合成路線Fig.1　Synthesis routine of compound 1

1.3性能測(cè)試與表征

（1）熒光光譜測(cè)量：汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液由pH=7.40 Tris-HCl緩沖溶液逐級(jí)稀釋10 mmol/L HgCl2儲(chǔ)備液得到.將1.0 mL 20 μmol/L的探針?lè)肿?溶液分別和1.0 mL 0.2～40 μmol/L的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，此時(shí)測(cè)試體系中探針?lè)肿?的濃度為10 μmol/L，汞離子濃度為0.1～20 μmol/L.使用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm的條件下記錄565～750 nm范圍內(nèi)上述溶液的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度變化.

（2）紫外光譜測(cè)量：使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)（1）中混合溶液在300～660 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，得到紫外吸收曲線.

（3）酸堿耐受性實(shí)驗(yàn)：分別用pH 3～9的緩沖溶液稀釋汞離子儲(chǔ)備液至20 μmol/L.將1.0 mL 20 μmol/ L的探針?lè)肿?溶液和1.0 mL上述用不同pH值緩沖溶液稀釋的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度，得出pH對(duì)探針響應(yīng)的影響曲線.探針?lè)肿?自身酸堿耐受性實(shí)驗(yàn)中只加入不同pH值的緩沖溶液，不加入汞離子進(jìn)行測(cè)量.

（4）響應(yīng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)：使用熒光分光光度計(jì)，TimeS-can模式下設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，掃描時(shí)間間隔為30 s，測(cè)定1.0 mL 20 μmol/L探針?lè)肿?溶液中加入1.0 mL 20 μmol/L汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液后在發(fā)射波長(zhǎng)620 nm處熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線.

（5）選擇性實(shí)驗(yàn)：在1.0 mL 20 μmol/L探針?lè)肿?溶液中分別加入1.0 mL 20 μmol/L的不同金屬離子溶液，測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)為620 nm處的熒光強(qiáng)度.

（6）競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)：在1.0 mL 20 μmol/L探針?lè)肿?溶液中加入0.5 mL 40 μmol/L的除汞離子外的金屬離子溶液，然后再加入0.5 mL 40 μmol/L的汞離子，測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)為620 nm處的熒光強(qiáng)度.

（7）細(xì)胞成像試驗(yàn)：肝癌細(xì)胞（Humanhepatoma G2，HepG2）培養(yǎng)借鑒于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)ATCCHB-8065，通過(guò)含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）的完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng).使用倒置熒光顯微鏡拍攝加入汞離子前后的細(xì)胞熒光成像.

2 　結(jié)果與討論

2.1化合物1的合成與表征

化合物1由羅丹明101首先在POCl3作用下生成羅丹明101酰氯；然后不經(jīng)任何處理，直接與硫化鈉飽和溶液發(fā)生關(guān)環(huán)反應(yīng)即可得到.該方法合成步驟簡(jiǎn)單、目標(biāo)化合物產(chǎn)率高.其1HNMR、13CNMR及MS表征如下：

2.2光譜性質(zhì)

圖2所示為探針?lè)肿?（10 μmol/L）在測(cè)試體系中對(duì)0，0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20 μmol/L Hg2+響應(yīng)的熒光光譜圖.

圖2　探針?lè)肿?對(duì)Hg2+響應(yīng)的熒光光譜Fig.2　Fluorescence spectra of probe 1 response to Hg2+

由圖2可知，加入Hg2+之前，測(cè)試體系中探針?lè)肿?自身熒光強(qiáng)度較弱；加入Hg2+之后，體系隨著Hg2+濃度的增加，其熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng).這表明Hg2+的加入誘導(dǎo)了探針?lè)肿?發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)，從而增大了體系的共軛，使得體系熒光明顯增強(qiáng).當(dāng)加入等當(dāng)量的汞離子（10 μmol/L）時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的倍數(shù)達(dá)68倍；但繼續(xù)增加汞離子濃度，熒光增強(qiáng)的數(shù)值F/F0上升不明顯.探針?lè)肿?（10 μmol/L）對(duì)0.1～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)的汞離子響應(yīng)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（R2=0.994 9），檢出限為0.04 μmol/L.同時(shí)還可觀察到溶液熒光發(fā)生明顯改變，由無(wú)熒光變?yōu)殚冱S色強(qiáng)熒光.

圖3所示為探針?lè)肿?（10 μmol/L）與0，0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20 μmol/L汞離子反應(yīng)后的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖.

圖3　探針?lè)肿訉?duì)汞離子響應(yīng)的紫外光譜Fig.3　UV spectra of probe 1 response to Hg2+

由圖3可以看出，探針?lè)肿?本身在大于500 nm處幾乎無(wú)吸收；隨著汞離子加入，吸收光譜發(fā)生顯著的改變，在584 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰且隨著汞離子濃度上升逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明探針?lè)肿?在Hg2+加入后誘導(dǎo)了羅丹明101內(nèi)硫酯的開(kāi)環(huán).同時(shí)溶液的顏色由無(wú)色變?yōu)樽霞t色.

在測(cè)試體系中固定探針?lè)肿?和Hg2+的總濃度為20 μmol/L，通過(guò)連續(xù)改變二者之間的摩爾比，繪出Job’s plot曲線，如圖4（a）所示.可以看出，二者之間的摩爾比為0.5時(shí)，吸收強(qiáng)度最大，表明汞離子與探針?lè)肿?之間的絡(luò)合比為1∶1.同時(shí)，探針?lè)肿?與汞離子結(jié)合后的產(chǎn)物通過(guò)ESI質(zhì)譜分析得到了一個(gè)743.32的質(zhì)荷比信號(hào)，對(duì)應(yīng)于［1+HgCl］+的質(zhì)荷比.基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文提出了探針?lè)肿?與汞離子的可能結(jié)合模式如圖4（b）所示.

圖4　探針?lè)肿?和Hg2+的Job′s plot曲線及其可能結(jié)合方式Fig.4　Job′s plot curve and proposed binding model of probe 1 with Hg2+

2.3pH影響

探針?lè)肿拥乃釅A耐受性是熒光探針性能的一個(gè)重要指標(biāo).在測(cè)試體系中，考察了探針?lè)肿?（10 μmol/ L）加汞前后在pH=3~9范圍內(nèi)的熒光性能，結(jié)果如圖5所示.

圖5　　pH對(duì)探針響應(yīng)Hg2+的影響Fig.5　Effect of pH on response to Hg2+of probe 1

由圖5可以看出，在620 nm處，探針?lè)肿?本身在pH=4~8范圍內(nèi)不受pH影響，而加入10 μmol/L Hg2+后，其在pH=5~8范圍內(nèi)不受pH變化的影響，表明該探針工作pH范圍較寬且可以在生理pH范圍內(nèi)檢測(cè)Hg2+，具有應(yīng)用在生物系統(tǒng)內(nèi)的潛力.

2.4響應(yīng)時(shí)間

圖6所示為探針?lè)肿?對(duì)Hg2+的時(shí)間響應(yīng)曲線.

圖6　探針?lè)肿优cHg2+響應(yīng)的時(shí)間曲線Fig.6　Time dependent fluorescence intensity changes of probe 1 in prescence of Hg2+

由圖6可以看出，探針?lè)肿?對(duì)Hg2+表現(xiàn)出了快速響應(yīng)的能力（小于30 s），說(shuō)明探針?lè)肿?對(duì)汞離子具有極高的靈敏度.

2.5選擇性

選擇性優(yōu)劣也是熒光探針很重要的一個(gè)指標(biāo).固定汞離子和其他金屬離子的濃度均為10 μmol/L，分別考察了探針?lè)肿?對(duì)Hg2+和其他金屬離子的響應(yīng)識(shí)別效果，如圖7所示.由圖7可見(jiàn)，只有加入Hg2+時(shí)，探針?lè)肿?的熒光強(qiáng)度有顯著增強(qiáng)（68倍）.Ag+的加入只能引起溶液熒光強(qiáng)度的微弱增強(qiáng)（小于3倍）.這表明探針?lè)肿?對(duì)汞離子具有很好的選擇性.

競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)被用于研究探針?lè)肿?對(duì)汞離子響應(yīng)的實(shí)際應(yīng)用可能性，結(jié)果如圖8所示.

圖7　探針?lè)肿?對(duì)不同金屬離子的選擇性Fig.7　Fluorescence responses of probe 1 to selected metal ions

圖8　探針?lè)肿?在不同金屬離子存在下對(duì)汞離子的響應(yīng)（競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)）Fig.8　Fluorescence response of probe 1 to Hg2+in prescence of other metal ions（competitive experiments）

由圖8可以看出，在10 μmol/L其他金屬離子存在的探針?lè)肿?（10 μmol/L）溶液中分別加入10 μmol/L Hg2+，均不影響汞離子的檢測(cè).以上結(jié)果均表明，本文設(shè)計(jì)的探針?lè)肿?對(duì)Hg2+具有非常顯著的選擇性，符合環(huán)境和生物中應(yīng)用的要求.

2.6汞離子的細(xì)胞內(nèi)熒光成像

為進(jìn)一步研究探針1在生物成像中的應(yīng)用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)Hg2+的熒光成像使用倒置顯微鏡拍照，如圖9所示.

圖9　HepG2細(xì)胞中，探針?lè)肿?與汞離子結(jié)合前后的成像圖Fig.9　Images of Hg2+in HepG2 cells with probe 1

圖9（a）為明場(chǎng)觀察到的HepG2細(xì)胞形態(tài)，首先用10 μmol/L探針?lè)肿?在37℃孵育30 min，熒光倒置成像顯微鏡幾乎觀察不到任何熒光，如圖9（b）所示；但當(dāng)其再與10 μmol/L HgCl2在PBS中孵育30 min后，可以觀察到非常強(qiáng)的熒光，如圖9（c）所示.從圖中可以看出細(xì)胞形態(tài)完好，表明探針毒性小，對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷.這表明熒光探針?lè)肿?可以用于活細(xì)胞內(nèi)Hg2+的可視化檢測(cè).

3 結(jié)論

通過(guò)“一鍋煮”方法簡(jiǎn)便合成了羅丹明101內(nèi)硫酯（探針?lè)肿?），并利用核磁共振氫譜（1H NMR）、核磁共振碳譜（13C NMR）和電噴霧離子源質(zhì)譜（ESI-MS）對(duì)其進(jìn)行了表征，考察了該化合物對(duì)汞離子識(shí)別的熒光、紫外性質(zhì)、pH影響、選擇性、靈敏度及活細(xì)胞內(nèi)熒光成像，研究表明：

（1）探針?lè)肿?對(duì)Hg2+響應(yīng)識(shí)別的線性濃度范圍寬（0.1～10 μmol/L），檢出限低（0.04 μmol/L）.

（2）加入Hg2+前后探針?lè)肿?溶液顏色變化明顯（無(wú)色到紫紅色），可以實(shí)現(xiàn)“裸眼”檢測(cè).

（3）探針?lè)肿?對(duì)Hg2+選擇性好、熒光增強(qiáng)倍數(shù)大（68倍），響應(yīng)速度快（小于30 s）.

（4）探針?lè)肿?與Hg2+結(jié)合的化學(xué)計(jì)量比為1∶1，二者反應(yīng)后形成了1-HgCl絡(luò)合物，質(zhì)譜驗(yàn)證了該結(jié)合模式.

（5）探針?lè)肿?對(duì)Hg2+識(shí)別酸堿耐受性強(qiáng)（pH為5～8），應(yīng)用前景好.

（6）結(jié)合熒光成像技術(shù)，探針?lè)肿?可用于肝癌細(xì)胞中Hg2+可視化檢測(cè).

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Preparation of far-red fluorescence probe for Hg2+and its application to bioimaging

WU Xiang-yang，ZHU Bo-song，HAN Zhi-xiang，WANG Chun-liu，LIANG Shi-wei，CHEN Wen-hui，CUI Yun-han
（School of Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu Province，China）

A facile probe 1（rhodamine 101 thiolactone）was synthesized，and applied to quantitatively detect the level of Hg2+in aqueous media and visualize its distribution in living cells via Hg2+-induced thiospirolactone ring-opening mechanism.The results show that probe 1 shows significant fluorescence enhancement，and reaches almost 68-fold when 1.0 equiv Hg2+was added to the test solution.In the meanwhile，the color of the test solution changes from colorless to pink.The proposed probe can be applied to monitor the level of Hg2+with a linear range covering from 0.1 to 10 μmol/L（R2=0.994 9）and the detection limit is 0.04 μmol/L.Selective and competitive experiments both suggested that probe 1 can detect Hg2+with high selectivity and sensitivity in comparison with other cations.Finally，the probe was successfully employed to visually detect Hg2+in living cells with the aids of fluorescent imaging technique.

far-red；fluorescent probe；rhodamine 101 thiolactone；Hg2+；fluorescent imaging；bioimaging

X820

A

1671-024（2016）04-0034-05

10.3969/j.issn.1671-024x.2016.04.005