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        惡性腹腔積液中卵巢癌腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物的免疫細(xì)胞化學(xué)分析

        2016-09-15 01:29:22張海燕姜海嬌祝迪李建華呂慶杰
        關(guān)鍵詞:腹水卵巢癌上皮

        張海燕姜海嬌祝 迪李建華呂慶杰

        (1遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院,2沈陽(yáng)化工研究院有限公司,3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,4中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科,沈陽(yáng) 110004)

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        惡性腹腔積液中卵巢癌腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物的免疫細(xì)胞化學(xué)分析

        張海燕1姜海嬌2祝 迪3李建華3呂慶杰4*

        (1遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院,2沈陽(yáng)化工研究院有限公司,3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,4中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科,沈陽(yáng) 110004)

        目的 探討在惡性腹腔積液中卵巢癌細(xì)胞的多種標(biāo)志物表達(dá)情況及分子生物學(xué)意義。方法 選取惡性腹腔積液中卵巢癌患者102例,采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞角蛋白7(Cell Keratin 7,CK7)、卵巢癌相關(guān)抗原(Ovarian Cancer Antigen,CA-125)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)、鈣網(wǎng)膜蛋白(Calretinin,CR)、C-erbB-2、雌激素受體(estrogen receptor,ER)及孕激素受體(progesteron receptor,PR)表達(dá)。結(jié)果 102例發(fā)生惡性腹腔積液的卵巢癌患者中,98例經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化療1~2個(gè)療程,手術(shù)組織病理證實(shí)為上皮性卵巢癌,26例發(fā)生大網(wǎng)膜或腹膜轉(zhuǎn)移,其中卵巢癌相關(guān)標(biāo)記物CK7陽(yáng)性表達(dá)率為95.1%,CA-125的陽(yáng)性表達(dá)率為88.2%,CEA的陽(yáng)性表達(dá)率為7.8%;CR的陽(yáng)性表達(dá)率為25.5%,但在發(fā)生轉(zhuǎn)移的卵巢癌細(xì)胞中全部表達(dá);與預(yù)后相關(guān)的C-erbB-2的陽(yáng)性表達(dá)率為30.4%,ER和PR的陽(yáng)性表達(dá)率分別為50.9%和42.1%。結(jié)論 根據(jù)各標(biāo)志物蛋白表達(dá)情況,不僅可以診斷卵巢癌細(xì)胞并且也可以初步評(píng)估其轉(zhuǎn)移情況和惡性程度,并對(duì)臨床治療和預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。

        惡性腹腔積液;卵巢癌;CK7;CA-125

        卵巢癌是最常見(jiàn)的婦科腫瘤之一,也是引起婦科腫瘤死亡的主要原因,上皮性卵巢癌約占卵巢惡性腫瘤的85%,腹水是上皮性卵巢癌常見(jiàn)體征,也是晚期的表現(xiàn)之一[1]。腹水常常是由于盆腔及腹腔轉(zhuǎn)移,組織學(xué)分級(jí)差,淋巴轉(zhuǎn)移等因素有關(guān),腹水中常伴有癌細(xì)胞的脫落[2-3],因此當(dāng)對(duì)腹水進(jìn)行脫落細(xì)胞的病理檢測(cè)時(shí),就需要對(duì)其中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行診斷及鑒別診斷,并對(duì)轉(zhuǎn)移特征、惡性程度與預(yù)后等臨床特征進(jìn)行初步判斷。

        細(xì)胞角蛋白7(cell keratin 7,CK7)在卵巢和肺等上皮呈陽(yáng)性表達(dá),而在胃腸道上皮陰性,可作為鑒別診斷指標(biāo)[4],與卵巢癌相關(guān)抗原(ovarian cancer antigen,CA-125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)聯(lián)合可共同診斷卵巢癌細(xì)胞[5]。鈣網(wǎng)膜蛋白(calretinin,CR)是診斷間皮瘤的有用的標(biāo)志[6],通過(guò)檢測(cè)其在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)可來(lái)了解卵巢癌的轉(zhuǎn)移特征。在上皮性卵巢癌中C-erbB-2過(guò)表達(dá)比例越高,則臨床分期越晚,且其生物學(xué)行為和預(yù)后就越差。雌激素受體(estrogen receptor,ER)和孕激素受體(progesteron receptor,PR)的檢測(cè)有助于指導(dǎo)臨床治療[7]。本研究對(duì)卵巢癌惡性腹腔積液中CK7、CA-125、CEA、calretinin,CR、C-erbB-2等腫瘤細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物及有助于了解其惡性程度和預(yù)后的ER和PR進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè),從而為卵巢癌的診斷、轉(zhuǎn)移、預(yù)后的判斷及其治療的指導(dǎo)提供參考依據(jù)。

        材料和方法

        1 臨床樣本

        收集2011到2014年中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科、附屬盛京醫(yī)院病房及門(mén)診的惡性腹腔積液共1387例,引起腹水的病變包括炎癥,結(jié)核,胃腸道腫瘤轉(zhuǎn)移,間皮瘤等,取其未接受過(guò)治療的102例卵巢癌患者惡性腹腔積液作為研究對(duì)象,其中98例后經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化療1~2個(gè)療程,經(jīng)臨床檢查及術(shù)后組織病理和免疫化學(xué)染色診斷為上皮性卵巢癌,其中26例發(fā)生大網(wǎng)膜或腹膜轉(zhuǎn)移。102例中,年齡從21至78歲,平均年齡為55歲。

        2 液基細(xì)胞薄層檢測(cè)技術(shù)(ThinPrep Cytology Test,TCT)

        收集新鮮腹水25ml左右,室溫下2000r/min離心5min,棄去上清液,加入清洗液再次離心后,棄去上清液,取底層沉淀細(xì)胞與保存液混合后,機(jī)器Thinprep5000自動(dòng)制片,并進(jìn)行染色和鏡下診斷。

        3 切片制備與HE染色

        TCT常規(guī)制片,診斷后,每份標(biāo)本收集新鮮腹水200ml左右,室溫下,2000r/min離心5min,取細(xì)胞沉渣,經(jīng)95%乙醇固定12h后梯度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋,切片,HE染色后,鏡下觀察,篩選切片。

        4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色與結(jié)果判定

        切片常規(guī)脫蠟、脫水、高溫高壓法抗原修復(fù)后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)EnVision法染色(具體染色步驟按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行),用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

        結(jié)果判定:免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞必須具備細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,陽(yáng)性顆粒定位好,著色明顯高于背景的特點(diǎn),顯微鏡下表現(xiàn)為胞膜、胞漿或胞核的棕褐色或褐色顆粒著色。

        結(jié) 果

        惡性腹腔積液經(jīng)TCT及HE鏡下初步診斷為可疑瘤細(xì)胞(圖1A,1B),并進(jìn)行卵巢癌組織的HE及CA-125的免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步驗(yàn)證(圖2A,2B)。

        表1 惡性腹腔積液中卵巢癌細(xì)胞的CK7、CA-125、CEA、CR、C-erbB-2、ER及PR的表達(dá)率Table 1 The positive expression rate of CK7、CA-125、CEA、CR、C-erbB-2、ER and PR from the malignant ascites of ovarian cancer patients

        圖1 卵巢癌患者惡性腹腔積液中細(xì)胞的組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色。A,惡性腹腔積液TCT涂片中卵巢癌細(xì)胞巴氏染色;B:,同例惡性腹腔積液的石蠟包埋切片HE染色中的卵巢癌細(xì)胞;C,同例惡性腹腔積液中卵巢癌細(xì)胞的CK7免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá);比例尺,50μmFig.1 The histological and immunocytochemical staining of the cells from malignant ascites fluids of ovarian cancer patient.A,HE staining of TCT sample cells from malignant ascites fluids of ovarian cancer;B,HE staining of ovarian cancer cells from malignant ascites fluids of the same case;C,The positive expression of CK7 immunocytochemical staining in the cells from malignant ascites fluids of the same patient case;scale bar,50μm

        免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示,卵巢癌相關(guān)標(biāo)志物CK7表達(dá)陽(yáng)性(圖1C),CA-125陽(yáng)性部位為細(xì)胞膜(圖3A),表達(dá)率分別為95.1%和88.2%(表1);癌胚抗原(CEA)陽(yáng)性表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)(圖3C),其表達(dá)率相對(duì)較低,為7.8%(表1),所以對(duì)惡性腹腔積液中的卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行診斷時(shí),需要三者聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè),以提高診斷的準(zhǔn)確性。發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移的卵巢癌細(xì)胞,其間皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物(CR)全部陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性部位為細(xì)胞質(zhì)(圖3B),我們認(rèn)為卵巢癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的過(guò)程中發(fā)生了分子生物學(xué)的改變,使其更有利于自身的存活。卵巢癌預(yù)后參考指標(biāo)C-erbB-2、ER及PR也呈陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性部位定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞核(圖4),其表達(dá)率分別為30.4%、50.9%、42.1%(表1),C-erbB-2的表達(dá)說(shuō)明發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移的卵巢癌細(xì)胞具備一定的惡性程度。

        圖2 卵巢癌組織的HE染色(A)及CA-125的免疫組織化學(xué)染色(B)。比例尺,50μmFig.2 HE staining(A)and immunohistochemical staining of CA-125(B)in ovarian cancer tissue.Scale bar,50μm

        圖3 同例惡性腹腔積液中卵巢癌細(xì)胞的 CA-125(A)、CR(B)、CEA(C)膜漿的陽(yáng)性表達(dá)。比例尺,50μmFig.3 The positive expression of CA125(A),CR(B),CEA(C)from the cells in the malignant ascites fluids of the same patient case.Scale bar,50μm

        圖4 同例惡性腹腔積液中卵巢癌細(xì)胞的C-erbB-2(A)、ER(B)及PR(C)陽(yáng)性染色。比例尺,50μmFig.4 The expression of C-erbB-2(A)、ER(B)and PR(C)from the cells in malignant ascites fluids of the same patient case.Scale bar,50μm

        討 論

        卵巢癌患者易出現(xiàn)惡性腹腔積液,通過(guò)對(duì)惡性腹腔積液中腫瘤細(xì)胞的免疫化學(xué)分析,可有助于對(duì)腫瘤進(jìn)行診治和療效觀察。本研究對(duì)惡性腹腔積液中卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其上皮性標(biāo)志物CK7表達(dá)率高達(dá)95.1%,有研究表明,與轉(zhuǎn)移性卵巢癌相比,CK7在原發(fā)性卵巢癌中具有更高的表達(dá)率[8]。卵巢癌的腫瘤標(biāo)記物CA-125表達(dá)率也高達(dá)88.2%,CA-125是1983年由Bast等從上皮性卵巢癌抗原檢測(cè)出可被單克隆抗體OC125結(jié)合的一種糖蛋白,來(lái)源于胚胎發(fā)育期體腔上皮,在正常卵巢組織中不表達(dá),其診斷的敏感性較高,晚期卵巢癌患者的血清CA-125異常升高率達(dá)80%[9]。CK7與CA-125的聯(lián)合檢測(cè),對(duì)于惡性腹腔積液中,原發(fā)性卵巢癌的鑒別診斷具有重要參考價(jià)值,CEA是一種非特異性腫瘤標(biāo)志物,廣泛存在于消化系統(tǒng)腫瘤患者的體內(nèi),CEA在卵巢癌中可以表達(dá),但它不是卵巢癌的特異性腫瘤標(biāo)志物,在婦科惡性腫瘤的治療中也具有一定的參考價(jià)值,但因?yàn)殛?yáng)性率低,最好結(jié)合其它指標(biāo)來(lái)共同判斷腫瘤性質(zhì)[10],在本研究中也證實(shí)CEA陽(yáng)性率表達(dá)在卵巢癌細(xì)胞中較低,需要結(jié)合CK7與CA-125來(lái)一起判斷腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)。

        在本研究中,26例卵巢癌患者發(fā)生了腹腔轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞種植于大網(wǎng)膜或腹膜等處,其間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CR全部表達(dá),我們推測(cè)腫瘤細(xì)胞在新的病灶處生長(zhǎng)的過(guò)程中與周圍的間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了生物分子學(xué)特征上的融合,從而更有利于其在新的環(huán)境中生長(zhǎng)。此外,腫瘤細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,可能具備了間質(zhì)細(xì)胞的某些特性,從而更有利于自身的轉(zhuǎn)移,具體原因還需我們進(jìn)一步研究。但我們可以利用這一分子標(biāo)記的表達(dá),來(lái)評(píng)估卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況,進(jìn)而為治療提供參考。

        C-erbB-2為一種原癌基因,在多種人類腫瘤,特別是上皮性腫瘤,存在基因擴(kuò)增和蛋白的表達(dá)異常。有研究表明,在卵巢癌的組織中,從在C-erbB-2基因的過(guò)度表達(dá),從而是細(xì)胞異常增值,促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展,且其表達(dá)率在低分化癌中高于高分化癌,可見(jiàn)其與惡性程度相關(guān)[11-12]。本研究中C-erbB-2的表達(dá)率也有30.4%,這說(shuō)明腹水中的腫瘤細(xì)胞也具備高度惡性的特征,預(yù)示著不良預(yù)后。ER和PR也具有一定比例的表達(dá),在免疫組織化學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn),不同的卵巢癌組織學(xué)類型,ER和PR的表達(dá)具有一定的差異性,但發(fā)現(xiàn)PR的表達(dá)是預(yù)后較好的一個(gè)重要指標(biāo),同時(shí)ER和PR的表達(dá)是激素依賴性腫瘤對(duì)內(nèi)分泌治療敏感性好的依據(jù)[13]。

        卵巢癌惡性腹腔積液中的脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法簡(jiǎn)單、快速、患者痛苦小,是一項(xiàng)必不可少的重要檢查手段。癌細(xì)胞的檢測(cè)對(duì)鑒別良、惡性、分期、治療和預(yù)后等均有關(guān),但腹水中癌細(xì)胞的檢出率也可能受一些因素的影響,如臨床期別、組織學(xué)類型、腹腔轉(zhuǎn)移、腫瘤有無(wú)破潰、癌腫是否外生型等有關(guān)[14],卵巢癌腹水的液基細(xì)胞學(xué)與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合在疑難腹水鑒別診斷中可以起到關(guān)鍵作用,在我們的研究中,發(fā)現(xiàn)有部分病例的惡性腹腔積液中的卵巢癌細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)多種因子,這說(shuō)明腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生了多樣性的變化,多種抗體的聯(lián)合應(yīng)用可有助于鑒別診斷腺癌細(xì)胞的惡性程度,轉(zhuǎn)移情況及為治療與預(yù)后提供參考價(jià)值。

        [1]Pellicciotta I,Yang CP,Venditti CA,et al.Response to microtubule-interacting agents in primary epithelial ovarian cancer cells.Cancer Cell Int,2013,13(1):1-10.

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        Immunocytochemical analysis of markers for
        tumor cells from malignant ascites of ovarian cancer

        Zhang Haiyan1,Jiang Haijiao2,Zhu Di3,Li Jianhua3,Lv Qingjie4*
        (1Liaoning Research lnstitute of Family Planning,2Shenyang Research Institute Of Chemical Industry,3Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,4Department of Pathology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

        Objective To investigate the expression and biological significance of ovarian cancer cell markers from malignant ascites.Methods In 102 cases of malignant ascites of ovarian cancer,the expressions of CK7,CA-125,CEA,CR,C-erbB-2,ER and PR were detected by immunohistochemical staining.Results After 1-2 cycles of standard chemotherapy,surgical pathology confirmed epithelial ovarian cancer in 98 of the 102 cases,26 with omental or peritoneal metastasis.positive rates of CK7,CA-125,CEA,CR,C-erbB-2,ER,and PR were vespectively 95.1%,88.2%,7.8%,25.5%,30.4%,50.9%and 42.1%.Conclusion The protein expression of the markers can give a preliminary assessment of the degree of malignancy and metastasis of tumor cells,thus providing references for clinical treatment and prognosis.

        malignant ascites;ovarian cancer;CK7;CA-125

        R361+.3

        A

        10.16705/j.cnki.1004-1850.2015.06.

        2015-12-13 〔修回日期〕2016-03-26

        張海燕,女(1974年),漢族,副主任醫(yī)師

        (To whom correspondence should be addressed):lvqjie@163.com

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