王學(xué)成 馬 萌 吳煜琪 牛學(xué)英 張亞平 王曉冬 陳 雪*

1(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系， 江蘇 南通 226001)2(南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，江蘇 南通 226001)

人Muse細(xì)胞體外誘導(dǎo)為神經(jīng)前體細(xì)胞的研究

王學(xué)成1馬 萌1吳煜琪1牛學(xué)英1張亞平2王曉冬1陳 雪1*

1(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系， 江蘇 南通 226001)2(南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，江蘇 南通 226001)

探討成人骨髓來(lái)源的Muse細(xì)胞體外誘導(dǎo)為神經(jīng)前體細(xì)胞的技術(shù)方法。從健康成人骨髓中分離出骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hBMSCs)，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)從中篩選出Muse細(xì)胞，采取免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色和qPCR技術(shù)鑒定Muse細(xì)胞的多能干細(xì)胞特性；通過(guò)神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)Muse細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞(Muse-NPCs)，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色和qPCR技術(shù)鑒定其神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況。從hBMSCs中分選出約0.58%的Muse細(xì)胞，Muse細(xì)胞表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-3、Nanog和Oct4，其mRNA表達(dá)水平均高于hBMSCs(P<0.01)；誘導(dǎo)后的Muse-NPCs表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、βIII-tubulin，其mRNA表達(dá)水平均高于hBMSCs及Muse 細(xì)胞(P<0.01)。從成人骨髓中成功分離出具有多能干細(xì)胞特性的Muse細(xì)胞，用體外誘導(dǎo)形成Muse-NPCs，可為今后細(xì)胞治療修復(fù)神經(jīng)損傷提供新的種子細(xì)胞。

Muse細(xì)胞；神經(jīng)前體細(xì)胞；流式細(xì)胞儀分選術(shù)；骨髓

引言

神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量死亡，僅存的極少量神經(jīng)干細(xì)胞無(wú)法足量補(bǔ)充丟失的神經(jīng)組織細(xì)胞，且受損的神經(jīng)元再生能力也相對(duì)較弱，因此有必要對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞治療[1-3]。干細(xì)胞因其具有多向分化和自我復(fù)制能力，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細(xì)胞治療中。目前，已報(bào)道的干細(xì)胞種類較多，但都有各自的局限性。

1)成體定向干細(xì)胞：分化能力較為局限，難以實(shí)現(xiàn)跨胚層分化，而神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)本身取材較為困難[4-5]。

2)胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)：是能誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有細(xì)胞類型的全能干細(xì)胞，但由于倫理學(xué)問(wèn)題和致瘤性而備受爭(zhēng)議[6-7]。

3)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)：添加外源性基因可能有致瘤的副作用，且目前還沒(méi)有明確的檢測(cè)和消除方法[8-9]。

4)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)：成分復(fù)雜，分化為神經(jīng)組織細(xì)胞的比例較低[10-11]。

2010年，Dezawa等發(fā)現(xiàn)一種來(lái)源于間充質(zhì)組織的多能干細(xì)胞，全稱為多系分化持續(xù)應(yīng)激細(xì)胞(multilineage differentiating stress enduring cells，Muse cells)，它具有階段特異性胚胎抗原-3(stage specific embryonic antigen-3，SSEA-3)與CD105表達(dá)雙陽(yáng)性的特征，表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物，具有自我更新能力以及三胚層分化潛能，是新發(fā)現(xiàn)的具有臨床應(yīng)用前景的干細(xì)胞[12]。本研究擬從成人骨髓中分離出骨髓基質(zhì)細(xì)胞(human bone marrow stromal cells, hBMSCs)，利用流式細(xì)胞儀分選技術(shù)從中篩選出Muse細(xì)胞，探討體外誘導(dǎo)Muse細(xì)胞形成神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells，NPCs)的方法并對(duì)其進(jìn)行鑒定，以期為細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供新的種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成人骨髓由南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科提供，經(jīng)學(xué)校倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(南通大學(xué)倫理審查(科研2013-013))，受試者簽署本人知情同意。DMEM/F12、α-MEM、FBS、B27、PS雙抗溶液(Gibco公司)，Histopaque-1077、poly-HEMA、EGF(Sigma公司)，CD105-PE抗體、SSEA-3-FITC抗體(eBioscience公司)，Nestin-FITC抗體、βIII-tubulin-FITC抗體、Oct4-FITC抗體、Nanog-FITC抗體(Millipore公司)，bFGF(Abcam公司)，MethoCult(Stemcell公司)，QIAcube(QIAGE公司)、cDNA Synthesis試劑盒(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 hBMSCs的分離和培養(yǎng)

取10例健康成人骨髓，每例2～3 mL于15 mL離心管中，加入3 mL Histopaque-1077分離液，利用密度梯度離心法和差速貼壁法[13]，收集hBMSCs，使用含15% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ mL接種于培養(yǎng)皿中，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀分選Muse細(xì)胞

取生長(zhǎng)良好的第3代hBMSCs，收集1×107個(gè)細(xì)胞到EP管中，加入150 μLCD105-PE/SSEA-3-FITC雙標(biāo)抗體稀釋液(1∶20/1∶20)，避光、靜置30 min，分別以PBS、CD105-PE(1∶20)、SSEA-3-FITC(1∶20)作為對(duì)照組；PBS洗滌兩遍；加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上樣，收集CD105/SSEA-3雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞；MC培養(yǎng)基(α-MEM+0.9% MethoCult+20% FBS)洗滌后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，接種于已預(yù)先用poly-HEMA包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d半量換液。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)Muse細(xì)胞增殖活力

對(duì)Muse細(xì)胞分別設(shè)0.5 h，1、2、4、6 d等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每點(diǎn)設(shè)重復(fù)孔6個(gè)，在預(yù)先用poly-HEMA包被的96孔板中，每孔加入180 μL、密度為2.5×104/mL的Muse細(xì)胞及20 μL CCK-8溶液，用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，置于酶標(biāo)儀上，在450 nm測(cè)定吸光度并收集數(shù)據(jù)。

收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Muse細(xì)胞球，吹打均勻至單細(xì)胞后移至15 mL離心管中，DMEM/F12洗滌后利用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM/F12+20 ng/mL EGF+20 ng/ mL bFGF+1% B27+1% PS)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ mL接種于培養(yǎng)皿中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色

為鑒定Muse細(xì)胞的多能干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況，用移液器吸取Muse細(xì)胞球至玻片上進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次10 min；4%多聚甲醛固定，37℃，30 min；PBS漂洗3次，每次10 min；封閉液封閉，37℃，1 h；分別加入下述一抗，小鼠抗Nanog-FITC抗體(1∶100)、小鼠抗Oct4-FITC抗體(1∶100)，4℃避光孵育過(guò)夜；PBS漂洗3次，每次10 min；DAPI封片液封片后于共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

為鑒定分化后的Muse-NPCs神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況，用移液器吸取分化培養(yǎng)7 d的細(xì)胞球至玻片上進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色。0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次10 min；4%多聚甲醛固定，37℃，30 min；PBS洗滌3次，每次10 min；封閉液封閉，37℃，1 h；分別加入下述一抗，小鼠抗Nestin-FITC抗體(1∶100)、兔抗β III-tubulin-FITC抗體(1∶400)，4℃避光孵育過(guò)夜；PBS洗滌3次，每次10 min；DAPI封片液封片后于共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 qPCR檢測(cè)

用QIAcube提取細(xì)胞總RNA，并于260/280 nm測(cè)定吸光度值，分析樣本純度的濃度。在熱循環(huán)儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(2720Thermal Cycler，ABI Gene Company Limited，美國(guó))上，按照RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒說(shuō)明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)和合成：SSEA-3，上游引物5′-GCC AGA ATG TCG GTG TTC AT-3′，下游引物5′-CTG CTG TGT CCT TGC CTG TA-3′；Nanog,上游引物5′-GCA ACC TGA AGA CGT GTG AA-3′，下游引物5′-CTC GCT GAT TAG CTC CAA C-3′；Oct4,上游引物5′-AGA AGG ATG TGG TCC GAG TG-3′，下游引物5′-GTG AAG TGA GCT CCC ATA-3′；Nestin,上游引物5′-CTG ACC CTG TTT CCT TGG AG-3′，下游引物5′-GAG ACT AGC GGC ATT CCT TG-3′；βIII-tubulin,上游引物5′-GCA AGG TGC GTG AGG AGT AT-3′，下游引物5′-GCG GAA GCA GAT GTC GTA G-3′。按下列條件反應(yīng)：預(yù)變性95℃，10 min；變性95℃，15 s；擴(kuò)增 60℃，60 s；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)在延伸階段采集熒光；PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行產(chǎn)物的溶解曲線分析，以確保PCR產(chǎn)物的特異性。各組目的基因均與對(duì)應(yīng)的參照基因進(jìn)行校正，然后使用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析和圖像生成均由Graphpad Prism 5 Demo系統(tǒng)完成，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。qPCR數(shù)據(jù)采用單因素的方差分析(one-way ANOVA)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差的齊性檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取各個(gè)樣品0.500 0 g，分別精確加入各個(gè)重金屬的對(duì)照品溶液，測(cè)定各個(gè)元素的加樣回收率，測(cè)定條件依照表1中的儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，4種重金屬元素的回收率在100.12%～100.57%之間。見表5。

2 結(jié)果

2.1 Muse細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)

根據(jù)Muse細(xì)胞SSEA-3和CD105雙陽(yáng)性的細(xì)胞表型特征，利用流式細(xì)胞儀從hBMSC中分選出約0.58%的Muse細(xì)胞(見圖1(a))。將分選出的Muse細(xì)胞接種于poly-HEMA包被的24孔板中，懸浮培養(yǎng)1 d后單個(gè)細(xì)胞開始聚集，形成細(xì)胞集落，并且迅速分裂增殖，3～5 d后形成Muse細(xì)胞球，球體透亮，大小均勻，折光性強(qiáng)，懸浮生長(zhǎng)(見圖1中(b)和(c))。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)Muse細(xì)胞增殖能力，連續(xù)監(jiān)測(cè)0.5 h，1、2、4、6 d的細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)2 d后細(xì)胞增殖迅速，光鏡下觀察細(xì)胞球逐漸增大(見圖2(a)～(c))，增殖曲線顯示1周內(nèi)細(xì)胞處于持續(xù)增殖中(見圖2(d))。

圖1 Muse細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。(a)流式細(xì)胞儀分選Muse細(xì)胞；(b)Muse細(xì)胞光鏡圖；(c) 子圖(b)中方框的局部放大Fig.1 Separation and culture of Muse cells. (a) Flow cytometry sorting of Muse cells; (b) Muse cell cluster under light microscope; (c) The magnification of the box in (b)

圖2 CCK-8法檢測(cè)Muse細(xì)胞增殖情況。(a)～ (c) 培養(yǎng)1、2、3 d后的Muse細(xì)胞光鏡圖；(d)CCk-8法檢測(cè)Muse細(xì)胞的增殖曲線Fig.2 Proliferation assay of Muse cells by using CCK-8. (a) ～ (c) Muse cells were cultured for 1, 2, 3 d, respectively; (d) Proliferation curve of Muse cells by using CCK-8

圖3 Muse細(xì)胞多能干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色。(a) Nanog的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色；(b) Nanog免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色后的DAPI染色；(c) (a)和(b)的疊加圖；(d) Oct4的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色；(e) Oct4免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色后的DAPI染色；(f) (d)和(e)的疊加圖Fig.3 Immunocytochemical staining of pluripotent stem cell markers in Muse cells. (a) Immunocytochemical staining of Nanog; (b) Staining of DAPI after immunocytochemical staining of Nanog; (c) Merged micrograph of (a) and (b); (d) Immunocytochemical staining of Oct4; (e) Staining of DAPI after immunocytochemical staining of Oct4; (f) Merged micrograph of (d) and (e)

圖4 Muse細(xì)胞多能干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平檢測(cè)(人胚胎干細(xì)胞(ESCs)HN4作為陽(yáng)性對(duì)照；* 與hBMSCs相比，P<0.01；#與Muse細(xì)胞相比，P<0.01)Fig.4 Relative mRNA level of pluripotent stem cell markers in Muse cells(Human embryonic stem cells (ESCs) HN4 as positive control,* vs hBMSCs, P<0.01;# vs Muse cells, P<0.01)

2.2 Muse細(xì)胞的鑒定

為鑒定Muse細(xì)胞的多能干細(xì)胞特性，利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色和qPCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示Muse細(xì)胞的多能干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog、Oct4的表達(dá)均為陽(yáng)性(見圖3)。qPCR技術(shù)檢測(cè)mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示Muse細(xì)胞的SSEA-3、Nanog和Oct4的mRNA表達(dá)水平均明顯高于hBMSCs(P<0.01)(見圖4)。

2.3 Muse細(xì)胞的體外誘導(dǎo)及鑒定

利用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)Muse細(xì)胞分化，2d后可見單個(gè)Muse細(xì)胞開始懸浮生長(zhǎng)，增殖分裂，聚集成球，細(xì)胞球透亮，邊緣清晰。

對(duì)細(xì)胞球神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示Nestin、β III-tubulin表達(dá)均為陽(yáng)性(見圖5)，qPCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞Nestin、β III-tubulin mRNA的表達(dá)水平均明顯高于hBMSCs和Muse細(xì)胞(P<0.01)(見圖6)。

上述結(jié)果說(shuō)明，Muse細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)后分化為Muse-NPCs，具有神經(jīng)干細(xì)胞的相應(yīng)特征。

圖5 Muse-NPCs的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色。(a) Nestin的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色；(b) Nestin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色后的DAPI染色；(c) (a)和(b)的疊加圖；(d) β Ⅲ-tubulin的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色；(e) β Ⅲ-tubulin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色后的DAPI染色；(f) (d)和(e)的疊加圖Fig.5 Immunocytochemical staining of neural stem cell markers in Muse-NPCs. (a) Immunocytochemical staining of Nestin; (b) Staining of DAPI after immunocytochemical staining of Nestin; (c) Merged micrograph of (a) and (b); (d) Immunocytochemical staining of βⅢ-tubulin; (e) Staining of DAPI after immunocytochemical staining of βⅢ-tubulin; (f) Merged micrograph of (d) and (e)

圖6 Muse-NPCs神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平檢測(cè)(* 與hBMSCs相比，P<0.01；# 與Muse細(xì)胞相比，P<0.01)Fig.6 Relative mRNA level of neural stem cell markers in Muse-NPCs(* vs hBMSCs, P<0.01; # vs Muse cells, P<0.01)

3 討論

Muse 細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是首次明確報(bào)道在天然單細(xì)胞水平上具有自我更新能力和多能干細(xì)胞特性的成體干細(xì)胞，它具有以下特征：

1)有應(yīng)激耐受力；

2)表現(xiàn)為SSEA-3 和CD105 雙陽(yáng)性；

3)單細(xì)胞能形成細(xì)胞球，表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物；

4)可以自我更新；

5)能分化為3個(gè)胚層的細(xì)胞；

6)在裸鼠體內(nèi)不形成畸胎瘤[14]。

Muse細(xì)胞克服了ESCs、iPSCs、NSCs 及其他成體定向干細(xì)胞在體內(nèi)移植治療中的許多不足之處。例如，與ESCs相比，Muse細(xì)胞的臨床應(yīng)用可以實(shí)現(xiàn)自體移植，不存在倫理學(xué)問(wèn)題；與iPSCs相比，Muse細(xì)胞可以從天然組織來(lái)源中獲得，不具有致瘤性；與NSCs相比，Muse細(xì)胞廣泛存在于間充質(zhì)組織中，如骨髓、皮膚、脂肪組織等，分離和獲取更為便捷等。Muse細(xì)胞的這些特點(diǎn)，使它作為種子細(xì)胞在臨床應(yīng)用研究中具有更獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Muse細(xì)胞CD105和SSEA-3表達(dá)雙陽(yáng)性的特性，利用流式細(xì)胞儀從BMSCs中篩選出Muse細(xì)胞，在單個(gè)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后，開始迅速增殖并形成細(xì)胞球，其形態(tài)類似于ESCs的胚狀體；并表達(dá)多能干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物，如Nanog、Oct4、SSEA-3、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等；但不表達(dá)其他干細(xì)胞的標(biāo)志物，如造血干細(xì)胞(CD34)、皮膚前體細(xì)胞(Snai1)、血管周細(xì)胞(CD146)和內(nèi)皮前體細(xì)胞(CD31)等[15-16]；且其SSEA-3、Nanog、Oct4的mRNA水平明顯高于hBMSCs。前期實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Muse細(xì)胞球轉(zhuǎn)移至明膠培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)時(shí)，分化的細(xì)胞可表達(dá)3個(gè)胚層的標(biāo)志物：內(nèi)胚層標(biāo)志物α-fetoprotein、中胚層標(biāo)志物α-SMA和外胚層標(biāo)志物NF-M。這些結(jié)果證明，Muse細(xì)胞與骨髓、真皮等間充質(zhì)中的已知干細(xì)胞不同，是新的具有較強(qiáng)多向分化潛能的干細(xì)胞。

在體外將Muse細(xì)胞轉(zhuǎn)入到含有營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子的特定誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，超過(guò)90%的細(xì)胞都可以進(jìn)行定向的分化。例如，將Muse細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4和地塞米松的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后，90%以上的細(xì)胞分化成肝細(xì)胞，甲胎蛋白和人白蛋白表達(dá)陽(yáng)性；在骨或者脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，98%以上的細(xì)胞可以分別地分化為骨鈣蛋白或油紅O陽(yáng)性的細(xì)胞[14,17]。而在體內(nèi)研究中，近年來(lái)Muse 細(xì)胞作為種子細(xì)胞也被應(yīng)用于一些小鼠損傷模型的修復(fù)研究中，如骨骼肌退變、糖尿病性皮膚潰瘍、急性重癥肝炎等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Muse細(xì)胞在這些損傷組織中能順利和宿主組織整合，并分別向相應(yīng)胚層的細(xì)胞分化[18-20]。其中，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中，Yamauchi 等利用Muse細(xì)胞修復(fù)腦動(dòng)脈堵塞后局部缺血的中風(fēng)模型小鼠，發(fā)現(xiàn)其可以替代丟失的神經(jīng)元，整合至梗死的皮質(zhì)組織中，分化為神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，且小鼠在35天后有較為明顯的功能修復(fù)[21]。上述報(bào)道進(jìn)一步表明，Muse細(xì)胞在一定條件下可以向外、中、內(nèi)3個(gè)胚層細(xì)胞分化。

利用上述Muse細(xì)胞多向分化的功能特點(diǎn)，將其置于含有bFGF、EGF以及B27的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)[22]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)形成的細(xì)胞具有干細(xì)胞成球特性，懸浮生長(zhǎng)，增殖迅速，且表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin和βIII-tubulin。qPCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞Nestin、βIII-tubulin的mRNA表達(dá)水平均明顯高于hBMSCs和Muse細(xì)胞，說(shuō)明誘導(dǎo)后的Muse-NPCs具有典型的神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞表型特征。如果在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行體內(nèi)移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的話，或許可以通過(guò)提高種子細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化率來(lái)增強(qiáng)修復(fù)效果；與移植NPCs治療相比，Muse-NPCs的來(lái)源更為廣泛，分離和培養(yǎng)更加簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)操作也較為快捷方便，是具有更廣闊臨床應(yīng)用前景的種子細(xì)胞。

4 結(jié)論

本研究利用流式細(xì)胞分選術(shù)，從成人骨髓中篩選出Muse細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，體外誘導(dǎo)Muse細(xì)胞形成Muse-NPCs，對(duì)其神經(jīng)干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。今后，可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究Muse-NPCs在體外和體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中的修復(fù)效果，或許可為細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供新的種子細(xì)胞和有利的借鑒。

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Study on Induction of Human Muse Cells into Neural Precursor Cellsinvitro

Wang Xuecheng1Ma Meng1Wu Yuqi1Niu Xueying1Zhang Yaping2Wang Xiaodong1Chen Xue1*

1(DepartmentofHistologyandEmbryology,SchoolofMedicine,NantongUniversity,Nantong226001,Jiangsu,China)2(DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,Jiangsu,China)

The work explored approaches of inducing Muse cells derived from the adult bone marrow into neural precursor cellsinvitro. Human bone marrow stromal cells (hBMSCs) were separated and cultured from the healthy adult bone marrow. Then Muse cells were collected using the flow cytometry sorting. In order to observe the characteristics of the pluripotent stem cells, Muse cells were analyzed using immunocytochemical staining and qPCR assay. Afterward, neural inducing culture media was used to induce Muse cells into neural precursor cells (Muse-NPCs). The immunocytochemical staining and qPCR assay were used to observe the expression of the markers specific for the neural stem cell in Muse cells. Muse cells accounting for about 0.58% of hBMSCs were obtained that expressing the markers of the pluripotent stem cells: SSEA-3, Nanog and Oct4. Muse cells also showed significantly higher levels of mRNA of these markers comparing to hBMSCs (P<0.01). The induced Muse-NPCs expressed the markers of neural stem cells including Nestin and βIII-tubulin. Additionally, the levels of mRNA of these markers in Muse-NPCs was significantly higher than those in hBMSCs and Muse cells (P<0.01). In conclusion, Muse cells were successfully separated from adult bone marrow and then induced into Muse-NPCs in vitro, providing a new type of seed cells for the cell therapies in the nervous system.

Muse cells；neural precursor cells；flow cytometry sorting；bone marrow

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 02.013

2015-06-03， 錄用日期: 2015-12-28

國(guó)家自然科學(xué)基金(81350030，81501610)；江蘇省研究生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(CXZZ13-0871)

R318

A

0258-8021(2016) 02-0218-07

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: biosnow@163.com