張 余，劉英富，陳旭義，涂 悅，梁 冰，徐忠偉，趙永青

阿糖胞苷對大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的影響*

張 余1，劉英富4，陳旭義3，涂 悅3，梁 冰3，徐忠偉5，趙永青2△

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué) ，天津300193；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 ，3.腦系科 ，4.細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室 ，5.中心實(shí)驗(yàn)室 ，天津300162）

目的:探討在大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)過程中，阿糖胞苷對培養(yǎng)神經(jīng)元的影響。方法 :將新生24 h大鼠 ，分離出海馬組織 ，進(jìn)行原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng) ，再將細(xì)胞分為阿糖胞苷組和對照組 ，阿糖胞苷組加入1μmol/L阿糖胞苷 ，通過檢測神經(jīng)元特異性標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白-2（Map-2）計(jì)算培養(yǎng)神經(jīng)元的數(shù)量 ，通過臺盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞的存活率。結(jié)果:培養(yǎng)第7天 ，阿糖胞苷組神經(jīng)元數(shù)量為（11±3）個(gè) ，對照組為（10±4）個(gè) ，兩組無明顯差異；阿糖胞苷組神經(jīng)元細(xì)胞在培養(yǎng)第14天時(shí)存活率為74%，培養(yǎng)第21天時(shí)存活率為49%，而對照組神經(jīng)元14天時(shí)存活率為96%，21天存活率為88%，兩組神經(jīng)元存活率差異明顯。結(jié)論 :原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元時(shí)，阿糖胞苷對神經(jīng)元產(chǎn)量及形態(tài)影響不明顯 ，但是由于阿糖胞苷的毒性作用 ，明顯縮短神經(jīng)元的存活時(shí)間 ，影響長期培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率。

海馬神經(jīng)元；原代培養(yǎng) ；阿糖胞苷；大鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.007

海馬神經(jīng)元培養(yǎng)主要用于以細(xì)胞為基礎(chǔ)的各種腦區(qū)形態(tài)學(xué)和生理學(xué)研究［1］。在神經(jīng)元原代培養(yǎng)的過程中會發(fā)生一系列形態(tài)的變化，包括軸突發(fā)芽和生長，突起的分支，建立突觸。如對中樞神經(jīng)損傷的研究，給予一定的誘導(dǎo)因素能夠促進(jìn)海馬神經(jīng)元樹突棘的生長［2］，可用來觀察神經(jīng)元軸突生長情況［3］；突觸小泡可塑性研究 ，培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元用來進(jìn)行突觸遞質(zhì)的調(diào)控研究；通過海馬神經(jīng)元基因的改變及蛋白的差異表達(dá)的研究，對阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識有重要意義［4］等。如何成功培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，是進(jìn)行相關(guān)研究的基礎(chǔ)。目前進(jìn)行海馬神經(jīng)元培養(yǎng)的方法很多，其中阿糖胞苷是培養(yǎng)過程中一個(gè)常用的添加試劑。對于阿糖胞苷的使用，有的文獻(xiàn)報(bào)道在培養(yǎng)基中加入阿糖胞苷，有的在培養(yǎng)基中不加，同樣培養(yǎng)出了神經(jīng)元［5］，培養(yǎng)方法不統(tǒng)一 ，阿糖胞苷對培養(yǎng)神經(jīng)元的影響不明確。為了明確阿糖胞苷在神經(jīng)元原代培養(yǎng)中的實(shí)際價(jià)值，我們開展了此項(xiàng)研究工作。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生24 h內(nèi)的SD大鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑

Neurobasal培養(yǎng)基（Gibco），DMEM F12培養(yǎng)基（HyClone），多聚-D-賴氨酸（Sigma），PBS（中衫金橋），HBSS培養(yǎng)基（Gibco），2.5%胰酶（Gibco），青鏈霉素混合液（Solarbio），胎牛血清（HyClone），谷氨酰胺（HyClone），B-27生長因子（Gibco），阿糖胞苷（Sigma），一抗:兔抗微管相關(guān)蛋白2多克隆抗體（Abcam），二抗:山羊抗兔（Life technologies）。

1.3 培養(yǎng)板的預(yù)處理

培養(yǎng)前1天，6孔塑料培養(yǎng)板中放置蓋玻片，每孔加入0.1 g/L（PBS配置）多聚-D-賴氨酸2～3ml，包被24 h后用無菌PBS沖洗2次，在超凈臺中自然晾干待用。

1.4 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

新生24 h SD大鼠斷頭取腦，分離出海馬組織，放置在預(yù)冷的HBSS中。將含有組織的HBSS保留800μl，加入200μl 的2.5%的胰酶，37℃消化15min，每隔5min拿出來充分搖晃，消化完成后將組織小心轉(zhuǎn)移至接種培養(yǎng)基（DMEM F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗）的EP管中。轉(zhuǎn)移三管洗脫多余的胰酶，在接種培養(yǎng)基中用1ml槍頭輕輕吹打20次，放置5min，將上面懸浮液吸到1.5 ml EP管，1 000 r/min，離心5 min，去除上清，加2m l重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以4×105cells/well接種于6孔板中。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，3～4 h后換成神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基（Neurobasal培養(yǎng)基+2%B-27生長因子+ 0.25%谷氨酰胺+雙抗）。

1.5 神經(jīng)元分組及產(chǎn)量、存活率觀察

培養(yǎng)24 h后在阿糖胞苷組中加入阿糖胞苷1μmol/L，作用24 h后繼續(xù)用神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)。對照組未處理，繼續(xù)用神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)。第7天鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，對培養(yǎng)神經(jīng)元進(jìn)行觀察、計(jì)算。分別于第14天、21天 ，用0.25%胰酶消化貼壁的神經(jīng)元，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化、吹散細(xì)胞，以9∶1加入濃度為0.4%臺盼藍(lán)，3min用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，計(jì)算神經(jīng)元細(xì)胞存活率［6］。細(xì)胞存活率=未藍(lán)染細(xì)胞/（藍(lán)染細(xì)胞+未藍(lán)染細(xì)胞）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 神經(jīng)元免疫熒光鑒定

棄培養(yǎng)基，10%的多聚甲醛固定15～20min，PBS洗滌3 次 ，每次2min。含0.5%Tritonx-100的PBS溶液透化處理20 min，此目的是破細(xì)胞膜，讓抗體進(jìn)入，PBS洗3次，每次2 min。含5%BSA孵育20min。滴加稀釋后的一抗，4℃過夜孵育。復(fù)溫30min，PBS洗3次，每次2 min。滴加稀釋過的二抗，37℃避光孵育40 min。PBS洗3次，每次5 min。滴加DAPI鋪滿玻片，室溫10min。PBS洗3次，每次5min。甘油封片。熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 軸突長度測量方法

對熒光結(jié)果進(jìn)行神經(jīng)元軸突測量，利用Image Pro Plus6.0軟件的跟蹤測量功能，沿細(xì)胞體邊緣突起起點(diǎn)向軸突末端準(zhǔn)確描繪出整個(gè)突起，軟件自動(dòng)標(biāo)出數(shù)值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0及GraphPad Prism 5.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1 阿糖胞苷對神經(jīng)元生長情況的影響

相差顯微鏡下觀察到神經(jīng)元培養(yǎng)3～4 h貼壁，貼壁的細(xì)胞胞體圓亮；培養(yǎng)6～8 h，神經(jīng)元長出突起；培養(yǎng)12 h，神經(jīng)元長出3～4個(gè)突起；培養(yǎng)24 h，突起生長明顯，其中有1-2個(gè)長于其他突起，此為神經(jīng)元軸突；培養(yǎng)第3～4 d，神經(jīng)元軸突樹突生長都很明顯；培養(yǎng)第7天，神經(jīng)元軸突樹突成熟，狀態(tài)良好，阿糖胞苷組神經(jīng)元生長情況與對照組比較無明顯差異（圖1）。

Fig.1 Comparison of the growth of cultured 7 d neurons（×200）A:Cytarabine group；B:Controlgroup

2.2 阿糖胞苷對神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)以及軸突長度的影響

Map-2免疫熒光染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)第7天，阿糖胞苷組神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)與對照組比較無明顯差異，阿糖胞苷組神經(jīng)元軸突長度（58.11±15.52）μm與對照組（57.29±16.34）μm比較無明顯差異（圖2、圖3）。

Fig.2 Resultsof immunofluorescence staining ofMap-2 neurons in cultured 7d neurons（×100）A:Cytarabine group；B:Controlgroup

Fig.3 Comparison of axon length in cultured 7 d neurons

2.3 阿糖胞苷對神經(jīng)元存活率的影響

新生24 h SD大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第14天，加入阿糖胞苷處理24 h，臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示:阿糖胞苷組神經(jīng)元存活率（74.28±6.83）%與對照組（96.17±3.56）%之間有顯著性差異（P＜0.01）；培養(yǎng)第21天 ，阿糖胞苷組存活率（49.32± 5.47）%與對照組（88.29±4.71）%之間有顯著性差異（P＜0.01），表明阿糖胞苷處理24 h對培養(yǎng)第14天和第21天的海馬神經(jīng)元的存活率有影響。

2.4 阿糖胞苷對神經(jīng)元產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)第7天，分別選取兩組光鏡200倍，每組5個(gè)視野，觀察結(jié)果顯示 :阿糖胞苷組神經(jīng)元數(shù)量（11±3）個(gè)與對照組（10±4）個(gè)比較 ，差異無顯著性（圖4）。

Fig.4 Comparison of the yield of cultured 7 d neurons

3 討論

海馬神經(jīng)元是大腦皮質(zhì)顳葉海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞，負(fù)責(zé)記憶和空間認(rèn)知［7］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默病、海馬萎縮變性、神經(jīng)元細(xì)胞損傷所導(dǎo)致的記憶能力減退都與海馬神經(jīng)元的功能受損有關(guān)［8］。軸突是神經(jīng)元發(fā)育和再生的結(jié)構(gòu)，傳遞細(xì)胞體發(fā)出的神經(jīng)沖動(dòng)，對維持神經(jīng)元功能具有重要作用。軸突損傷后，長度縮短，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。測量軸突長度可以判斷神經(jīng)元極性的損傷程度，海馬神經(jīng)元可以作為研究神經(jīng)元極性的良好模型［9］。原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元周期短 ，影響因素相對單一，操作簡便，培養(yǎng)效率比較高［10］。目前 ，原代海馬神經(jīng)元的研究更為普遍，提高神經(jīng)元的純度和存活率至關(guān)重要，但在細(xì)胞培養(yǎng)方面，尤其是培養(yǎng)過程是否加入阿糖胞苷，實(shí)驗(yàn)方法并不統(tǒng)一。

阿糖胞苷是一種細(xì)胞周期特異性藥物，能夠作用于細(xì)胞有絲分裂S增殖期，是一類嘧啶類抗代謝藥物，進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)過脫氧胞苷激酶催化形成阿糖胞磷酸核苷，然后分別通過一磷酸和二磷酸嘧啶磷酸核苷轉(zhuǎn)化成阿糖胞三磷酸核苷，滲入到脫氧核糖核酸的核苷酸鏈中，阻止鏈的延長、引起鏈的斷裂和影響鏈的復(fù)制，從而抑制細(xì)胞DNA的聚合和合成，干擾細(xì)胞的增殖 ，抑制有絲分裂。文獻(xiàn)報(bào)道［11］應(yīng)用阿糖胞苷干擾白血病細(xì)胞DNA合成，可以殺死白血病細(xì)胞，從而治療不同類型的白血病。臨床上大劑量的阿糖胞苷可以治療兒童惡性淋巴瘤，對于中老年人原發(fā)性眼內(nèi)淋巴瘤，阿糖胞苷的輔助治療具有一定的療效［12］。實(shí)驗(yàn)研究在原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)中，阿糖胞苷可以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞增殖，但對正常培養(yǎng)細(xì)胞具有一定的毒性并且可以誘導(dǎo)其凋亡［13］，影響細(xì)胞存活時(shí)間［14］。本研究結(jié)果顯示，阿糖胞苷對培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元的生長、數(shù)量、形態(tài)以及軸突長度沒有影響 ，而培養(yǎng)14 d時(shí)，加入阿糖胞苷組神經(jīng)元存活率為74%，而對照組神經(jīng)元存活率為96%；培養(yǎng)21 d時(shí)，神經(jīng)元存活率為49%，而對照組則為88%，兩組比較差異有顯著性，說明隨著神經(jīng)元培養(yǎng)時(shí)間的延長，加入阿糖胞苷能夠降低神經(jīng)元細(xì)胞的存活率。

神經(jīng)元與其他細(xì)胞不同，是一類高度分化的終末細(xì)胞，不能再進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行有絲分裂。有些文獻(xiàn)采用阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞等可以分裂細(xì)胞的有絲分裂，對神經(jīng)元進(jìn)行純化處理。然而由于阿糖胞苷的神經(jīng)元毒性，使神經(jīng)細(xì)胞的存活率降低。針對這種情況，我們可以采用無血清培養(yǎng)液對神經(jīng)元進(jìn)行培養(yǎng)，因?yàn)闊o血清培養(yǎng)液本身可以抑制分裂細(xì)胞的增殖，只要掌握好首次換液的時(shí)間和注意事項(xiàng)，不需要對神經(jīng)元進(jìn)行特別的純化，阿糖胞苷的使用需謹(jǐn)慎。

綜上所述，加入阿糖胞苷對神經(jīng)元的產(chǎn)量及形態(tài)學(xué)改變沒有明顯作用，但降低了長時(shí)間培養(yǎng)的神經(jīng)元的存活率。隨著科學(xué)研究的不斷發(fā)展，由于原代培養(yǎng)的神經(jīng)元操作簡便，條件可控將得到廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)為原代海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)研究進(jìn)行了補(bǔ)充，為多種后續(xù)研究奠定良好基礎(chǔ)。

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hippocampal neurons；primary culture；cytarabine；rat

R363

A

1000-6834（2016）03-218-04

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZCZDGX00500）；天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（2013KZ134，2014KZ135）；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金項(xiàng)目（FYM201432）；武警后勤學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室開放基金（2015ZXKF01）；武警后勤學(xué)院博士啟動(dòng)金（WHB201514）

2015-10-29

2016-02-17

Tel:15022484780；E-mail:605993525@qq.com