賴鵬華，單曉梅，盧大為，李鵬程，何寬其

濕熱應(yīng)激和習(xí)服對(duì)小鼠氣道黏液分泌的影響*

賴鵬華△，單曉梅，盧大為，李鵬程，何寬其

（廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系 ，福建廈門361102）

目的:通過觀察高溫高濕環(huán)境暴露下小鼠氣道黏液分泌相關(guān)蛋白在不同時(shí)間段的變化，探討應(yīng)激和習(xí)服在濕熱環(huán)境中對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的作用。方法:45只BABL/c小鼠隨機(jī)分成5組（n=9）:對(duì)照組、濕熱1組、濕熱2組、濕熱3組、濕熱4組。對(duì)照組普通環(huán)境飼養(yǎng)，7 d后處死。其余各組置入氣候箱接受濕度（95±5）%，溫度（33± 0.5）℃的高溫高濕刺激，第12小時(shí)處死為濕熱1組，第24小時(shí)處死為濕熱2組，第4天處死為濕熱3組，第7天處死為濕熱4組。免疫組化法檢測(cè)小鼠肺黏蛋白5AC（MUC5AC）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、水通道蛋白1（AQP1）、水通道蛋白5（AQP5）蛋白表達(dá)。結(jié)果:把小鼠置入高溫高濕環(huán)境后，小鼠肺組織在12 h時(shí)AQP5增高，在24 h時(shí)MUC5AC、EGFR的蛋白表達(dá)增高，與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第7天，MUC5AC蛋白表達(dá)水平顯著低于正常組（P＜0.05）；其余時(shí)間段，MUC5AC、EGFR、AQP5蛋白表達(dá)均與正常組無明顯差異。AQP1蛋白表達(dá)在濕熱各組均與正常組無差異，與濕熱1組、濕熱2組比較，濕熱3組、濕熱4組表達(dá)則減弱（P＜0.05）。結(jié)論:濕熱應(yīng)激可引起小鼠氣道黏液高分泌，持續(xù)處于該環(huán)境則可能產(chǎn)生一系列更復(fù)雜的反應(yīng)。

濕熱；應(yīng)激；習(xí)服；黏液高分泌；小鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.020

現(xiàn)代流行病學(xué)顯示，不僅寒冷、干燥與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率、死亡率密切相關(guān)，高溫、潮濕亦影響其發(fā)病率、死亡率。據(jù)報(bào)道流行性感冒在我國(guó)北方流行高峰一般在冬季，南方地區(qū)全年則有2個(gè)峰，分別在12月份和7月份［1］。在泰國(guó)，溫暖多雨的南部流感發(fā)生率亦高于北部、中部等地區(qū)［2］。氣道黏液由水、黏蛋白（mucin）、脂類及無機(jī)鹽等組成，具有維持氣道濕化、協(xié)助氣道上皮細(xì)胞功能、預(yù)防感染和清除環(huán)境異物的作用，是呼吸道重要的防御機(jī)制之一。但是研究發(fā)現(xiàn)氣道黏液高分泌（mucus hypersecretion，MH）會(huì)導(dǎo)致氣道黏液粘稠度增高，氣道阻力增加，影響?zhàn)ひ旱那宄?，容易引起病原菌在呼吸道的駐留和增殖，加重感染，是氣道慢性炎性病變的共同特征，與慢性支氣管炎、哮喘、支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺疾病等密切相關(guān)［3］。因此，本研究擬通過氣候模擬，觀察比較濕熱環(huán)境應(yīng)激及繼發(fā)習(xí)服對(duì)小鼠氣道黏液分泌的影響，以期探討濕熱應(yīng)激和習(xí)服在濕熱環(huán)境中對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)BABL/c小鼠45只，4周齡，體重18 ～20 g，由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):11400700052964。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

MUC-5AC抗體（ABCAM公司，批號(hào):ab3649）、EGFR抗體（ABCAM公司，批號(hào):ab2430）、AQP1抗體（ABCAM公司，批號(hào):ab15080）、AQP5抗體（ABCAM公司，批號(hào):ab104751），人工氣候箱（寧波賽福儀器有限公司，PRX-1000B），恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，GNP-9080），顯微鏡（奧林巴斯CX41）、轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（徠卡RM2016）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模方法

將45只小鼠普通環(huán)境下（溫度22℃～24℃，相對(duì)濕度65%）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組（n=9）:對(duì)照組、濕熱1組、濕熱2組、濕熱3組、濕熱4組。每組小鼠單籠飼養(yǎng)。對(duì)照組繼續(xù)室溫下飼養(yǎng)，第7天處死。其余4組小鼠均置于人工氣候箱接受高溫高濕刺激，人工氣候箱設(shè)置為濕度（95±5）%，溫度（33±0.5）℃。置入氣候箱后第12小時(shí)處死濕熱1組，第24小時(shí)處死濕熱2組，第4天處死濕熱3組，第7天處死濕熱4組。

1.4 標(biāo)本采集及預(yù)處理

采用急性大失血法處死小鼠后迅速開胸，取右肺中葉用生理鹽水清洗后浸入10%中性甲醛中固定24 h，脫水、包埋制成蠟塊、切片。

1.5 免疫組化法檢測(cè)小鼠肺組織 MUC5AC、EGFR、AQP1、AQP5蛋白表達(dá)

采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素（SP）染色法，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，用3%過氧化氫除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，檸檬酸緩沖液，高壓修復(fù)3 min，10%血清37℃封閉0.5 h。余步驟按試劑說明書進(jìn)行，并用Image Pro Plus 6.0圖像系統(tǒng)分別計(jì)量黏蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、水通道蛋白1（aquaporin 1，AQP1）、AQP5蛋白陽性表達(dá)（棕黃色）的累積光密度（integrated optical density，IOD），每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)視野（×400），取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺組織MUC5AC的蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，置入氣候箱后第24小時(shí)，即濕熱2組小鼠肺組織MUC5AC蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P ＜0.05），第7天，即濕熱4組表達(dá)減弱（P＜0.05），第12小時(shí)和第4天，即濕熱1組和濕熱3組則無明顯變化。與第24小時(shí)比較，對(duì)照組和其余時(shí)間段表達(dá)均減弱（P＜0.05，表1，圖1）。結(jié)果表明在置入濕熱環(huán)境初期氣道黏蛋白分泌增加，在24 h達(dá)高峰，隨后逐漸恢復(fù)正常，到第7 d甚至出現(xiàn)黏蛋白分泌減少現(xiàn)象。

Fig.1 Immunohistochemistry analysisofMUC5AC protein expression in lungs ofmice（DAB×400）

2.2 肺組織EGFR的蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，置入氣候箱后第24小時(shí)，即濕熱2組小鼠肺組織EGFR蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05，表1，圖2），其余3組則表達(dá)無明顯增強(qiáng)。與第24小時(shí)比較，第4天、第7天，即濕熱3組、濕熱4組表達(dá)均減弱（P＜0.05）。結(jié)果表明在置入濕熱環(huán)境初期，EGFR變化與MUC5AC變化趨勢(shì)一致，即第24小時(shí)變化最明顯。

Fig.2 Immunohistochemistry analysis of EGFR protein expression in lungs ofmice（DAB×400）EGFR:Epidermal growth factor recepter

2.3 肺組織AQP1的蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，置入氣候箱高溫高濕刺激小鼠肺組織AQP1蛋白表達(dá)變化均不顯著。與第12小時(shí)，即濕熱1組比較，第4天、第7天，即濕熱3組、濕熱4組表達(dá)減弱（P＜0.05）。與第24小時(shí)比較，第7天表達(dá)亦減弱（P＜0.05，表1，圖3）。結(jié)果提示，在置入濕熱環(huán)境后7天內(nèi)AQP1變化不顯著。

Fig.3 Immunohistochemistry analysis of AQP1 protein expression in lungsofmice（DAB×400）AQP1:Aguaporin 1

2.4 肺組織AQP5的蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，置入氣候箱后第12小時(shí)，即濕熱1組AQP5增強(qiáng)（P＜0.05，表1，圖4）；其余時(shí)間段則表達(dá)無明顯變化。與第12小時(shí)比較，第24小時(shí)、第4天、第7天AQP5表達(dá)均減弱（P＜0.05）。結(jié)果顯示AQP5在置入濕熱環(huán)境初期，即第12小時(shí)變化最明顯，可能因其負(fù)性調(diào)節(jié)作用，MUC5AC在此時(shí)變化不明顯。

Fig.4 Immunohistochemistry analysis of AQP5 protein expression in lungsofmice（DAB×400）AQP5:Aguaporin 5

Tab.1 Comparision ofMUC5AC，EGFR，AQP1，AQP5 protein expression in different times

3 討論

黏蛋白只占?xì)獾鲤ひ嚎偭康?%，但卻是決定氣道黏液彈性、粘性最主要的成分。MUC5AC則為最主要的分泌型蛋白，在氣道上皮的杯狀細(xì)胞中高度表達(dá)，也是病理性增加的主要黏蛋白表型［4］。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）與其配體TGF-α結(jié)合后，可使受體同源或異源二聚化或寡聚化，激活其酪氨酸激酶 ，使下游信號(hào)分子酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化［5］，進(jìn)一步促發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，EGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在黏蛋白合成過程中起到主要的調(diào)節(jié)作用 ，香煙煙霧［6］、過敏原［7］、氧化應(yīng)激［8］、細(xì)胞因子［9］等能通過磷酸化的EGFR將細(xì)胞外信號(hào)傳到下游信號(hào)分子，啟動(dòng)MUC5AC轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致黏蛋白合成、分泌增加。EGFR酪氨酸激酶抑制劑則能阻斷EGFR配體的誘導(dǎo)作用，從而阻斷大鼠氣道上皮MUC5AC分泌增加和杯狀細(xì)胞增生［10］。水通道蛋白（AQP）是小分子跨膜蛋白，主要參與滲透壓驅(qū)動(dòng)下水的轉(zhuǎn)運(yùn)，有時(shí)也轉(zhuǎn)運(yùn)小分子甘油。AQP1在整個(gè)肺血管網(wǎng)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜高表達(dá)，AQP5在肺泡I型細(xì)胞和支氣管粘膜下腺中漿液腺泡上皮細(xì)胞的頂質(zhì)膜高表達(dá)。AQP5還是引起氣道高反應(yīng)的目標(biāo)基因之一［11］。一系列研究顯示AQP1、AQP5表達(dá)與MUC5AC表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，如陳智鴻等［12］研究顯示，在卵白蛋白致敏后，MUC5AC在AQP5敲除鼠中表達(dá)比野生型小鼠更豐富。熊本強(qiáng)等［13］實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著臭氧應(yīng)激的氣道高反應(yīng)大鼠肺組織AQP1 mRNA和蛋白水平表達(dá)的下降，黏液分泌量明顯增多，MUC5AC的表達(dá)也增多。

應(yīng)激是機(jī)體對(duì)外界或者內(nèi)部的各種異常刺激（創(chuàng)傷、環(huán)境溫度劇烈變化、饑餓疲勞等）所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和［14］，應(yīng)激原的作用過度強(qiáng)烈將導(dǎo)致機(jī)體正常穩(wěn)態(tài)被破壞、疾病的發(fā)生，甚至生命的終結(jié)。習(xí)服，又稱“服習(xí)”，指本來對(duì)某種氣候不適應(yīng)的動(dòng)物，因反復(fù)或較長(zhǎng)期處于該動(dòng)物生理所能忍受的氣候環(huán)境中，逐漸引起生理機(jī)能的變化，使原來因氣候應(yīng)激失常的生理指標(biāo)和生產(chǎn)性能，逐漸趨于正常或有所恢復(fù)，而能習(xí)慣于這種氣候環(huán)境［15］。大量流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)表明:應(yīng)激容易引起感染［16］、消化道潰瘍［17］、心血管?。?8］、精神?。?9］等。而通過持續(xù)暴露于不良環(huán)境的習(xí)服訓(xùn)練則有助于應(yīng)對(duì)環(huán)境變化所帶來的不良反應(yīng)，目前此研究被廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、國(guó)防醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。如濕熱環(huán)境下體能習(xí)服訓(xùn)練能夠顯著增強(qiáng)心血管功能和肌肉運(yùn)動(dòng)能力［20］。機(jī)體產(chǎn)生習(xí)服的時(shí)間各異，與所接觸應(yīng)激原的程度和時(shí)間相關(guān)，邱仞之等觀察結(jié)果顯示在高溫高濕環(huán)境下第7～14天可達(dá)習(xí)服狀態(tài)［21-23］，故本研究以7 d為觀察時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示高溫高濕環(huán)境應(yīng)激早期，AQP5作為氣道高反應(yīng)的易感基因之一，積極反應(yīng)，分泌增加，應(yīng)對(duì)環(huán)境驟變可能帶來的黏液高分泌，但高溫高濕環(huán)境持續(xù)存在，應(yīng)激過于強(qiáng)烈導(dǎo)致小鼠肺組織EGFR蛋白表達(dá)水平上調(diào)，從而誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)隨之上調(diào)，黏液分泌增加。置于濕熱環(huán)境24 h后，MUC5AC、EGFR、AQP5的蛋白表達(dá)水平均逐漸下降，提示持續(xù)置于高溫高濕環(huán)境，健康小鼠能迅速適應(yīng)，產(chǎn)生習(xí)服，各項(xiàng)指標(biāo)逐漸恢復(fù)正常。但習(xí)服只能短暫緩解應(yīng)激帶來的劇烈變化，若長(zhǎng)期處于惡劣環(huán)境而無任何干預(yù)措施，機(jī)體可能產(chǎn)生一系列更為復(fù)雜的病理反應(yīng)，而非單純良性反應(yīng)。如本研究所示小鼠置于濕熱環(huán)境后第7天MUC5AC蛋白表達(dá)水平下降至低于正常水平，提示黏液逐漸有分泌不足的趨勢(shì)，這與季麗萍等［24］研究顯示小鼠在45℃高溫環(huán)境的耐熱時(shí)間有隨習(xí)服天數(shù)的增加而減少的趨勢(shì)相似。

綜上所述，濕熱刺激能使健康小鼠產(chǎn)生急性應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致氣道粘液分泌增加，其機(jī)理可能與EGFR對(duì)MUC5AC的誘導(dǎo)作用、AQP5對(duì)MUC5AC的負(fù)性調(diào)節(jié)相關(guān)。若持續(xù)置于濕熱環(huán)境，小鼠能迅速產(chǎn)生習(xí)服，氣道黏液分泌降至正常。但若習(xí)服時(shí)間過長(zhǎng)，則可能出現(xiàn)糾枉過正現(xiàn)象，其具體機(jī)理和意義尚待進(jìn)一步研究。

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Influence of hot-hum id stress and acclimation on airway mucus production in lungs ofmice

LAIPeng-hua△，SHAN Xiao-mei，LU Da-wei，LIPeng-cheng，HE Kuan-qi
（Department of Medical College，Xiamen University，Xiamen 361102，China）

【ABSTRACT】Objective:To study the change of airwaymucus secretion under a high temperature and humidity environment，and explore the effects of hot-humid stress and acclimation on themorbidity andmortality of respiratory disease.Methods:Forty-five BABL/cmicewere random ly divided into five groups:normalgroup，hot-humid group I，hot-humid group II，hot-humid group III，hot-humid group IV，with 9 mice in each group.Mice in normal group were continuously placed in the common environment and sacrificed after 7 days.Mice in other groupswere housed in a temperature-and-humidity-controlled environment（33℃±0.5℃，95%±5%）.Mice in hot-humid group I，hot-humid group II，hot-humid group IIIand hot-humid group IVwere sacrificed after 12 hours，24 hours，4 days，7 days respectively.The protein expression ofmucin 5AC（MUC5AC）、epidermal growth factor receptor（EGFR）、aquaporin 1（AQP1）and aquaporin 5（AQP5）in lung were tested by immunohistochemisty.Results:After housed in a high temperature and humidity environment，immunohistochemisty revealed a significant increase of AQP5 12 h later，MUC5AC and EGFR 24 h later，comparedwith normalgroup（P＜0.05）.Therewas a significant decreaseof MUC5AC 7 d later，compared with normalgroup（P＜0.05）.Therewas no significant difference in MUC5AC，EGFR and AQP5 expression among allgroupsatother time points.Therewasno differenceof AQP1 in humid heatgroups，comparedwith normalgroup，buta significantdecrease in humid heat IIIand IV groups，comparedwith humid heat Iand IIgroups.Conclusion:These findings indicate thathot-humid stress inducesmucus hypersecretion in airways，whichmay be related to theup-regulation of EGFR and down-regulation of AQP5 inMUC5AC.Although acclimationmitigates above-mentioned response，a series ofmore complex responsesmay be induced if still in the hot-humid environment.

hot-humid； stress； acclimation； mucus heypersecretion

R188.8

A

1000-6834（2016）03-266-04

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013J05123）

2015-11-30

2016-02-01

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