袁培根，薛彬彬，林 碧，趙喜越，周 森，胡 一，包財盈，林麗娜

N rf2/ARE通路介導右美托咪定減輕肢體缺血/再灌注損傷中的作用*

袁培根，薛彬彬，林 碧，趙喜越，周 森，胡 一，包財盈，林麗娜△

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 ，浙江 溫州325000）

目的:觀察Nrf2/ARE通路在右美托咪定（DEX）預處理減輕大鼠肢體缺血/再灌注損傷中的作用。方法: 28只成年雄性SD大鼠隨機分為4組（n=7）:假手術組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、I/R+右美托咪定預處理組（DEX組）、I/R+DEX+阿替美唑組（Atip組）。Atip組在麻醉后腹腔一次性給予Atip（250μg/kg）和DEX（25μg/ kg），Sham組和I/R組在麻醉后腹腔給予相應體積生理鹽水 ，DEX組給予相應體積DEX和生理鹽水，30min后單側股部切口，無創(chuàng)動脈夾夾閉股動脈，側支循環(huán)用橡皮筋以恒定張力結扎，缺血3 h后去除動脈夾及橡皮筋，開放2 h后，取大鼠血清測乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）；取部分腓腸肌，測量丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）以及Western blot檢測胞核核因子E2相關因子2（Nrf2）、胞漿HO-1蛋白 ；免疫組化檢測胞核Nrf2、胞漿HO-1蛋白和光鏡觀察骨骼肌形態(tài)；同時切取少量腓腸肌進行濕干比檢測。結果:與Sham組相比，I/R組濕干比、MDA、LDH、CK、Nrf2、HO-1蛋白表達明顯升高（P＜0.05），SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與I/R組相比 ，DEX組濕干比、MDA、LDH、CK明顯降低（P＜0.05），SOD、Nrf2、HO-1蛋白表達顯著增多（P＜0.05）；與DEX組相比，Atip恰能扭轉DEX的這種作用，Atip組各指標與DEX組有顯著差異（P＜0.05）。結論:Nrf2蛋白存在于大鼠的骨骼肌中并且DEX可以通過α2受體上調核內Nrf2水平，使Nrf2下游的HO-1保護蛋白增多，起到抗氧化的作用。

缺血/再灌注損傷；氧化應激；核因子E2相關因子2；右美托咪定；大鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.016

肢體缺血再灌注損傷（leg ischemia/reperfusion， LI/R）在臨床上比較常見，如腹主動脈手術、斷肢再植、遠端血管重建術以及長時間應用止血帶等都會造成一定程度的LI/R［1，2］。眾所周知，恢復缺血組織的血流灌注是必要的措施，然而隨后產生的這種再灌注損傷不容忽視［3］。因此，尋找有效的治療手段來預防或減輕缺血再灌注損傷具有重要意義。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種新型的高選擇性α2受體激動藥，除在抗交感和鎮(zhèn)靜方面的優(yōu)勢外 ，近年已有報道證實在心［4］、腎［5］、肺［6］等重要器官的缺血再灌注損傷中具有保護作用。并且DEX對心［7］和腎［8］的保護作用與Nrf2/ARE通路有著密切的關系 ，雖然Nrf2自身無抗氧化的作用［9］，但Nrf2可以啟動抗氧化因子來調節(jié)氧化應激反應（oxidative stress response，ROS）從而達到器官保護的作用。阿替美唑（atipamezole，Atip）為α2受體的拮抗劑，能夠阻斷DEX通過α2發(fā)揮作用，使DEX的藥理作用消失、來驗證DEX與α2受體的關系。因此，我們建立缺血再灌注模型，驗證DEX減輕LI/R的作用是通過Nrf2/ARE通路發(fā)揮效能的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠28只，SPF級，體重280 ～320 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器及試劑

低溫離心機、酶標儀（Thermo公司）；垂直電泳系統(tǒng)（BIO-RAD）；顯微鏡（日本Olympus）；免疫組化試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）；肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；胞漿胞核蛋白提取試劑盒（普利萊基因技術有限公司）；小鼠抗大鼠Nrf2單克隆抗體、兔抗大鼠HO-1單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗IgG、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠二抗 IgG（英國Abcam公司）；核內參 TBP和胞漿內參 β-action、（Bioworld Technology，Inc）；BCA Protein Assay Kit （Thermo公司）；右美托咪定注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。

1.3 動物模型的建立與分組

實驗動物隨機分為四組（n=7）:假手術組（Sham組）、肢體缺血再灌注組（I/R組）、I/R+右美托咪定預處理組（DEX組）、I/R+右美托咪定+阿替美唑預處理組（Atip組）。Atip組:缺血前30 min同時腹腔注射阿替美唑（250μg/kg）和右美托咪定（25μg/kg）；其它3組在相同時間點給予相應DEX或者相應體積生理鹽水。取SPF級大鼠稱重，25%的烏拉坦和10%的水合氯醛1∶1混合液5ml/kg腹腔注射麻醉，待大鼠眼睫毛反射和刺激下肢反射消失后，右下肢股部切口分離股動、靜脈，用無創(chuàng)動脈夾夾閉，穿過動靜脈用橡皮筋以恒定張力環(huán)扎該側肢體，Sham組僅行股動靜脈分離術不夾閉。觀察到大鼠該側肢體由紅潤色變成暗紫色，說明缺血成功，夾閉3 h后松開動脈夾及橡皮筋恢復血供，開放2 h后將大鼠取血致死并迅速取骨骼肌留作檢測。

1.4 腓腸肌濕/干重比值（W/D）測定

切取腓腸肌，即刻稱取濕重，然后置于55℃恒溫干燥箱中至恒重即為干重，用濕重與干重的比值來反應腓腸肌的水腫程度。

1.5 HE染色觀察骨骼肌形態(tài)

腓腸肌置于10%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（hematoxylineosin staining，HE）染色，光鏡下觀察腓腸肌組織形態(tài)變化。

1.6 骨骼肌MDA/SOD檢測

準確稱取組織重量，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清并分成2份待測，其中用于SOD檢測的一份再用生理鹽水稀釋20倍，取樣50μl測定。

1.7 血清LDH、CK檢測

將大鼠血漿37℃水浴5min后，3 000 r/min、4℃離心后取上清，按照試劑盒說明書檢測。

1.8 Western blot檢測腓腸肌Nrf2和HO-1的蛋白表達

依照試劑盒說明書分別提取胞漿和胞核蛋白，用BCA法測定各自濃度。蛋白在10%SDS-PAGE中室溫電泳分離，Nrf2（300 mA、70 min）、HO-1（300 mA、50min）濕轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加Nrf2（稀釋度1∶2 000）、HO-1（稀釋度1 ∶500）、β-action（稀釋度1∶5 000）和TBP（稀釋度1∶500）一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入生物素標記的相應二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學發(fā)光法覆蓋條帶，暗室中顯影、定影，將膠片沖洗后晾干。膠片掃描后，用Image J測定各目的條帶的吸光度（A）值，并以目的蛋白和相應內參的吸光度值比值表示目的條帶相對強度。

1.9 免疫組化檢測腓腸肌Nrf2和HO-1的蛋白含量表達

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，抗原修復，血清封閉，滴加Nrf2和HO-1一抗及酶標記二抗，孵育，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水透明封片。顯微鏡下觀察陽性顯色為棕黃色。陰性對照以PBS代替一抗。每只動物各選2張切片分析，隨機選取互不重疊視野5個，在400倍顯微鏡下觀察拍照。胞漿HO-1蛋白應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行光密度量化分析；胞核Nrf2蛋白進行陽性細胞評分:陽性細胞數(shù)＜5%為0分；陽性細胞數(shù)5%～25%為1分；陽性細胞數(shù)26%～50% 為2分；陽性細胞數(shù)51%～75%為3分；陽性細胞數(shù)＞75%為4分。

1.10 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)應用SPSS 20統(tǒng)計軟件處理，計量資料進行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊則采用LSD法進行兩兩比較，方差不齊者采用Dunnet't檢驗。

2 結果

2.1 各組骨骼肌濕/干重的比值

Sham組濕干重比值較??；與Sham組比較，I/R組骨骼肌濕干重比值明顯升高（P＜0.05）；與I/R組比較，DEX組濕干重比值降低（P＜0.05）；與DEX組比較，Atip組濕干重比值升高（P＜0.05，表1）。

2.2 各組腓腸肌形態(tài)變化

骨骼肌橫切面觀察到:Sham組，肌纖維呈多邊形結構規(guī)則排列，未見細胞腫脹，間質結構正常，血管周圍未見明顯炎癥細胞滲出；與Sham組比較，I/ R、Atip組，細胞排列不規(guī)則，染色明顯變淡、界限不清晰，細胞腫脹明顯，間質見彌散的紅細胞，血管周圍可見大量炎癥細胞浸潤，該兩組未見明顯差異；DEX組，細胞排列欠規(guī)則，細胞染色稍有變淡、界限欠清晰，間質偶見紅細胞，血管周圍有少量炎性細胞浸潤，但與I/R組相比有明顯好轉（圖1）。

Fig.1 Pathological changes in skeletalmuscle cells（HE×400）A:Sham group；B:I/R group；C:DEX group；D:Atip group；I/R:Ischemia/reperfusion；DEX:Dexmedetomidine；Atip:Atipamezole

2.3 各組大鼠骨骼肌MDA結果

與Sham組比較，I/R組MDA水平明顯升高（P ＜0.05）；與I/R組比較，DEX組MDA水平顯著降低（P＜0.05）；與DEX組比較，Atip組MDA水平升高（P＜0.05，表1）。

2.4 各組大鼠骨骼肌SOD結果

與Sham組比較，I/R組SOD活力明顯降低（P ＜0.05）；與I/R組比較，DEX組SOD活力顯著升高（P＜0.05）；與DEX組比較，Atip組SOD活力降低（P＜0.05，表1）。

Tab.1 Wet/dry ratio，MDA and SOD of skeletalmuscle（±s，n =7）

Tab.1 Wet/dry ratio，MDA and SOD of skeletalmuscle（±s，n =7）

I/R:Ischemia/reperfusion；DEX:Dexmedetomidine；Atip: Atipamezole；W/D:Wet/dry；MDA:Malondialdehyde；SOD:Superoxide dismutase*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；ΔP＜0.05 vs DEX group

Group　W/D　MDA（nmol/mg·prot）SOD（U/mg·prot）Δ Sham　4.33±0.42　5.47±0.88　234.82±16.48 I/R　5.27±0.38*　9.22±0.93*　136.00±14.52*DEX　4.63±0.40#　6.25±1.55#　185.05±11.26#Atip　5.31±0.69Δ　9.04±0.35Δ　144.18±11.67

2.5 各組血清LDH、CK的變化

與Sham組比較，I/R組LDH、CK水平顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，DEX組LDH、CK水平明顯降低（P＜0.05）；與DEX組比較，Atip組LDH、CK水平升高（P＜0.05，表2）。

Tab.2 Change of LDH and CK of serum（±s，n =7）

Tab.2 Change of LDH and CK of serum（±s，n =7）

I/R:Ischemia/reperfusion；DEX:Dexmedetomidine；Atip: Atipamezole；LDH:Lactic dehydrogenase；CK:Creatine kinase*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；ΔP＜0.05 vs DEX group

?

2.6 WB檢測骨骼肌Nrf2和HO-1蛋白的表達

Sham組胞核Nrf2、胞漿HO-1電泳條帶吸光度（A）值與內參TBP、β-actin電泳條帶吸光度（A）值的比值較??；與Sham組比較，I/R組胞核Nrf2、胞漿HO-1吸光度（A）值與內參吸光度（A）值的比值升高（P＜0.05）；與I/R組比較，DEX組胞核Nrf2、胞漿HO-1吸光度（A）值與內參吸光度（A）值的比值顯著升高（P＜0.05）；與DEX組比較，Atip組胞核Nrf2、胞漿HO-1吸光度（A）值與內參吸光度（A）值的比值明顯降低（P＜0.05，圖2、圖3）。

2.7 免疫組化檢測骨骼肌Nrf2和HO-1蛋白的表達

免疫組化光鏡下顯示:Sham組Nrf2及HO-1蛋白呈低表達；與Sham組相比，I/R組Nrf2及HO-1蛋白表達明顯增多（P＜0.05）；與I/R組比較，DEX組兩蛋白的表達量進一步增多（P＜0.05）；與DEX組相比，Atip組兩蛋白表達量明顯降低（P＜0.05，表3，圖4、圖5，見彩圖頁Ⅴ）。

Fig.2 Protein expression of Nrf2 in the skeletalmuscle（±s，n =7）I/R:Ischemia/reperfusion；DEX:Dexmedetomidine；Atip: Atipamezole；Nrf2:NF-E2-related factor-2*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；ΔP＜0.05 vs DEX group

Fig.3 Protein expression of HO-1 in the skeletalmuscle（±s，n=7）I/R:Ischemia/reperfusion；DEX:Dexmedetomidine；Atip: Atipamezole；HO-1:*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；ΔP＜0.05 vs DEX group

3 討論

本實驗通過常用阻斷血管的方法成功制作了LI/R模型，進一步證實了DEX對LI/R有保護作用，這也與前人的研究相一致［10，11］。研究發(fā)現(xiàn)，在LI/R中，DEX可以通過α2受體上調核內Nrf2水平，啟動下游相關基因的表達起到保護作用，減輕肢體缺血再灌注所造成的損傷。

Tab.3 Nrf2、HO-1 expression in different groups detected by IHC-P

LI/R是臨床診療中不可忽視的問題，越來越多的證據(jù)證實到氧化應激（ROS）反應在缺血再灌注損傷中具有重要作用。ROS發(fā)生時，氧及其衍生的自由基具有極強的化學活性［12］，它通過與細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應，使細胞的完整性及選擇離子通透性功能遭到破壞，還可通過與膜的脂質過氧化反應改變膜的結合酶、受體和離子的脂質微環(huán)境，引起細胞內鈣超載，導致破壞，最終會出現(xiàn)脂質過氧化物的主要終代謝產物MDA蓄積，骨骼肌細胞中釋放出大量CK、LDH、SOD水平降低。

近年研究顯示Keapl/Nrf2/ARE/HO-1通路是細胞內重要的抗氧化及細胞毒防御機制之一，Nrf2是細胞調節(jié)抗氧化應激反應的重要轉錄因子［13］。通過上調此信號通路可誘導多種抗氧化酶及解毒酶，加速酶促反應，提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物質的表達水平，清除自由基等氧化物質，維持細胞內的氧化還原水平狀態(tài)，發(fā)揮細胞保護作用。靜息情況下Nrf2定位于細胞質中，其半衰期相對較短，在細胞質中與肌動蛋白結合蛋白Keapl結合，當受到來源于活性氧或親核劑的信號攻擊后，Nrf2從Keapl-Nrf2復合物中解離，Nrf2的半衰期明顯延長，然后穩(wěn)定狀態(tài)的Nrf2轉位進入細胞核，啟動ARE調控的II相解毒酶及抗氧化酶基因表達，如血紅素加氧酶（HO-1）、過氧化氫酶（CAT）等［14］，從而達到抗氧化的作用。主要有三條信號傳導通路參與氧化應激狀態(tài)下ARE介導的基因表達:蛋白激酶C（PKC）途徑；促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑；磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）途徑。有研究報道，PI3k/Akt-aPKC-Nrf2通路可以上調大鼠氣道上皮細胞的有利蛋白的表達［15］，對于DEX與該通路的聯(lián)系似乎也與PI3k/Akt途徑相關，GU等［8］證實經(jīng)DEX處理后，在培養(yǎng)的腎細胞中磷酸化的p-Akt表達增加，這種作用能夠明顯被α2受體阻滯劑（Atip）所逆轉，Atip可以阻滯DEX通過α2受體發(fā)揮作用，這就意味著DEX通過α2受體來激活PI3k/Akt通路。有文獻指出DEX對心肌缺血再灌注損傷也有保護作用，這也與其通過α2受體激活PI3k/Akt通路有關［7］。PI3k/ Akt通路在I/R中一般都會被激活，但不足以達到器官保護的作用。所以我們可以相信DEX通過該通路確實對I/R損傷發(fā)揮了一定的保護作用，而該通路恰是參與ARE介導基因表達的通路之一。同時我們通過檢測也發(fā)現(xiàn)，與Sham相比，I/R組Nrf2的核內水平以及HO-1表達增多，這說明機體自身可通過該通路來抵御ROS；而與I/R組相比，DEX組Nrf2核內表達顯著增多，同時下游HO-1蛋白的表達量也明顯增多，這說明在骨骼肌中，DEX確實可以上調Nrf2的核內表達，有利于下游有利基因HO-1等的表達。而與此同時DEX的這種上調作用會被Atip所拮抗，Atip組與DEX組相比有顯著性差異，這也說明了DEX是通過α2受體來發(fā)揮作用的，但其發(fā)揮作用是否通過PI3k/Akt調控ARE介導基因的表達我們并未證實。如果是這樣，從α2到Akt的磷酸化具體機制目前也不是十分清楚。但該研究足以證實我們的假設，DEX可以通過α2受體調控Nrf2/ ARE通路，使ARE介導的基因表達增加，達到抗氧化應激的作用。

綜上所述，我們的研究再次證實了DEX對肢體缺血再灌注損傷有保護作用，同時也第一次發(fā)現(xiàn)，DEX對LI/R的這種保護作用是通過α2受體上調Nrf2核內表達啟動有利基因達到保護作用的。本研究可以指導DEX在肢體等相關手術中的應用。

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Nrf2/ARE pathway mediates the reducing effect of Dexmedetom idine on ischem ia/reperfusion injury in skeletalmuscle

YUAN Pei-gen，XUEBin-bin，LIN Bi，ZHAO Xi-yue，ZHOU Sen，HU Yi，BAOCai-ying，LIN Li-na△
（The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China）

【ABSTRACT】Objective:To explore the role of Nrf2/ARE pathway in skeletalmuscle ischemia/reperfusion（I/R）injury preconditioning by dexmedetomidine（DEX）.Methods:Twenty-eight SD ratswere randomly divided into sham-operated（Sham group）、I/R group、I/R+DEX （DEX group）and I/R+DEX+Atipamezole（Atip group）.In the Atip group，Atip（250μg/kg）and DEX（25μg/kg）were injected together after anesthesia；In the Sham and I/R groups，the homologous salinewas also injected at the same time；In the DEX group，the homologous DEX and salinewere coinjected.After30minutes，the hind limb ischemiawas induced by clamping the common femoralartery and ligaturing collateral circulation.After 3 h of ischemia，the clamp and tourniquetwere removed and the rats underwent 2 h of reperfusion.Wemeasured plasma concentrations of lactate dehydrogenase（LDH）and creatine kinase（CK）.The gastrocnemiusmusclewas harvested and immediately stored at-80℃for the assessmentofmalondialdehyde（MDA）、superoxide dismutase（SOD）and Nrf2/HO-1 protein detected byWestern blot. The other sectionmusclewas stored in triformol for immunohistochemical and HE staining.Thewet/drywas also immediately detecting.Results:The levelsofwet/dry、MDA、LDH、CK、Nrf2 and HO-1werehigher（P＜0.05）while the levelof SODwas lower（P＜0.05）in the I/R group than those in sham group.The levels ofwet/dry、MDA、LDH、CK were significantly lower（P＜0.05）yet the levels of SOD and Nrf2/ HO-1 were significantly higher（P＜0.05）in DEX group than those in I/R group.However，Atip reversed the effectof DEX in Atip group，each of indicators had significant changes compared with those in the DEX group（P＜0.05）.Conclusion:Nrf2 protein was expressed in skeletalmuscle of rat and DEX could promote its level in nucleus byα-adrenergic receptor.The down-stream products of Nrf2 have the effect of antioxidant.

ischemia/reperfusion injury； oxidative stress； NF-E2-related factor-2； dexmedetomidine； rat

R364

A

1000-6834（2016）03-250-05

溫州市科技計劃項目（Y20140561）

2015-07-13

2015-11-10

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