肖 敏，屈小虎，李長西，呂聚坪，史 楊，謝克儉

AdipoRon對2型糖尿病小鼠的治療及其可能的肝臟機制*

肖 敏，屈小虎，李長西，呂聚坪，史 楊，謝克儉△

（溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學與生命科學學院 ，浙江溫州325035）

目的:觀察口服脂聯(lián)素受體激動劑（AdipoRon）對2型糖尿病小鼠的治療效果及對肝臟的影響。方法:40 只SPF級雄性C57/BL6小鼠隨機分為正常對照組和實驗組，實驗組給予高糖高脂飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素建立二型糖尿?。═2DM）小鼠模型，隨機分為模型對照（DM）組，低劑量AdipoRon治療（DM+L）組，高劑量AdipoRon治療（DM+H）組（n=10）。檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的變化；HE染色鏡下觀察肝細胞形態(tài)學變化；實時定量熒光PCR法檢測肝臟中肝糖類相關(guān)基因（PEPCK）的表達。結(jié)果:與DM組小鼠比較，DM+H組和DM+L組小鼠ALT、AST、ALP、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）水平均降低（P＜0.05）；與DM組小鼠比較，DM+H組小鼠和DM+L組小鼠血清游離脂肪酸（FFA）濃度顯著下降（P＜0.05），而肝組織葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-P）活性DM+L組小鼠顯著下降，DM+H組小鼠無顯著差異；與DM組小鼠比較，DM+H組小鼠肝組織磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）mRNA表達顯著降低（P＜0.05），而DM+L組小鼠無顯著差異。結(jié)論:給予AdipoRon治療的小鼠血糖降低，ALT、AST、ALP的水平及G-6-P和PEPCK的表達下降，表明AdipoRon對2型糖尿病具有顯著的治療效果，對糖尿病小鼠肝臟有一定的保護作用。

2型糖尿??；脂聯(lián)素受體激動劑；肝細胞損傷；小鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.002

胰島素敏感性降低即胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)。胰島素敏感組織的葡萄糖攝取量減少和胰島β細胞功能降低是2型糖尿病的特征性病理生理學改變。目前發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體激動劑AdipoRon作為脂聯(lián)素受體激動劑具有抗糖尿病生物學活性。研究［1］表明脂聯(lián)素受體激動劑（AdipoRon）通過多條信號通路，加快了肌肉組織中游離脂肪酸的氧化和葡萄糖的轉(zhuǎn)運 ，實現(xiàn)增加脂肪酸的β氧化、改善胰島素抵抗［2］和抗炎等生物學作用。同時在肝臟中增強脂肪氧化，從而降低脂質(zhì)合成發(fā)揮抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠骨骼肌組織中AdipoRon通過結(jié)合AdipoR1/2，可抑制體內(nèi)的糖異生，促進脂肪代謝［3，4］。本研究通過檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、甘油三酯（triglyceride，TG）、葡萄糖（glucose，GLU）、游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G-6-P）等一系列指標，觀察肝組織HE染色形態(tài)，實時定量熒光PCR分析磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 （phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPCK）mRNA等基因產(chǎn)物表達，旨在探究AdipoRon對肝臟組織抗損作用的影響，為臨床治療2型糖尿病提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SPF級雄性C57BL/6小鼠40只，體重20 g，購自中國科學院上海實驗動物中心。

1.1.2 實驗儀器:博士醫(yī)生TD-4252血糖測試儀（日本京都），全自動生化分析儀（日本日立公司），CT15RE型臺式微量高速離心機（日本日立公司），NanoDrop 2000核酸蛋白分析儀（Thermo），S1000TMThermal Cycler梯度PCR儀（Bio-Rad），Multifuge XIR臺式高速大容量冷凍離心機（Thermo），CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系（Bio-Rad）

1.1.3 實驗試劑:鏈脲佐菌素（購于上海恩美生物科技有限公司），AdipoRon（購于上海恩美生物科技有限公司），Trizol（invitrogen），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara），SYBR Green （Bio-Rad），PEPCK and actin Primers（上海生工設(shè)計）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立及分組 40只SPF級雄性C57/ BL6小鼠（適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為正常對照NC 組10只和實驗組30只，NC組給予常規(guī)飼料，實驗組給予高糖高脂飲食（常規(guī)飼料66.5%+20%紅糖+10%豬油+2.5%膽固醇+1%膽酸鹽）飼養(yǎng)。5周后，禁食12 h，腹腔注射1%鏈脲佐菌素40mg/kg誘導糖尿病模型，72 h后禁食4 h，斷尾取血測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）。血糖濃度 ＞11 mmol/L，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀證明糖尿病鼠模型誘導成功。正常對照組腹腔注射等容積檸檬酸鈉緩沖液。最終實驗組建模成功30只，分為模型對照（DM）組、低劑量AdipoRon治療（DM+L）組、高劑量AdipoRon治療（DM+H）組。

1.2.2 干預(yù)及標本采集 將AdipoRon溶于去離子水，DM+L組小鼠灌胃AdipoRon，劑量為1.25 mg/ kg，DM+H組小鼠灌胃AdipoRon，劑量為6.25 mg/ kg，每日1次，NC、DM組灌胃等量去離子水。干預(yù)10 d后，禁食4 h，斷尾取血測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）。摘眼球取血0.6 ml，分離上清于干凈的離心管中，保存于-4℃。取各組肝臟標本并編號，部分4%多聚甲醛固定，部分保存在-80℃。

1.2.3 生化指標測定 由全自動生化分析儀檢測各組血清中ALT、AST及ALP、TG、GLU的含量。

1.2.4 病理學觀察 取各組4%多聚甲醛固定的肝臟標本，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，制成5μm切片，HE染色。用ECTIPSE 50I顯微圖像處理系統(tǒng)觀察并采集圖像，觀察各組肝臟組織形態(tài)變化。

1.2.5 G-6-P和FFA含量的測定 ELISA試劑盒檢測小鼠肝組織G-6-P、FFA的水平。

1.2.6 肝組織糖代謝相關(guān)基因表達測定 采用Trizol一步法提取小鼠肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作遵照試劑盒說明書，用實時熒光定量PCR測定肝磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）mRNA表達，以β-actin為內(nèi)參。PEPCK上游引物:5'-TGA AAGGCCGCA CCA TGTAT-3'；PEPCK下游引物:5'-GCA CAG ATA TGC CCA TCC GA-3'。β-actin上游引物:5'-AAC AGT CCG CCT AGA AGC AC-3'；β-actin下游引物:5'-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC-3'。反應(yīng)體系20μl:SYBR Green（2×）10μl，10 μmol/L上下游引物各0.4μl，ddH2O 7.2μl，模板0.2 μl。反應(yīng)條件:95℃變性30 s；循環(huán)40次:95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸34 s；融解:95℃15 s，60℃1min，95℃15 s；冷卻:60℃15 s。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠生化指標比較

與NC組小鼠相比，DM組、DM+L組及DM+H小鼠 ALT、AST、ALP、TG、GLU水平均升高（P＜0.05），與DM組相比，DM+H組和DM+L組小鼠ALT、AST、ALP、TG、GLU水平均降低（P＜0.05，表1）。

Tab.1 Comparison of biochemical indices among the four groups（±s，n=10）

Tab.1 Comparison of biochemical indices among the four groups（±s，n=10）

NC:Normal control；DM:Diabetesmodel control；DM+L:Diabetesmodel controlwith low AdipoRon；DM+H:Diabetesmodel controlwith high AdipoRon；ALT:Alanine aminotransferase；AST:Aspartate aminotransferase；ALP:Alkaline phosphatase；TG:Triglyceride；GLU:Glucose*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs DM group

Group　ALT（U/L）　AST（U/L）　ALP（U/L）　TG（mmol/L）　GLU（mmol/L）NC　50.80±5.79　154.90±19.05　92.80±9.73　1.09±0.22　7.53±1.21 DM　92.00±13.97*　295.10±32.89*　164.90±15.15*　2.72±0.47*　20.83±2.61*DM+L　73.50±8.78#　226.70±21.44#　138.00±14.39#　1.96±0.16#　16.42±0.96#DM+H　60.90±15.65#　173.10±14.00*#　101.30±11.89#　1.48±0.26*#　11.05±0.86*#

2.2 小鼠肝組織病理學檢查

光鏡觀察，NC組肝小葉結(jié)構(gòu)未見明顯異常，肝細胞索排列整齊，未見明顯脂肪變性及炎細胞浸潤；DM組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞明顯脂肪變性，肝細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量小空泡；DM+H組和DM+L組有不同程度的減輕（圖1，見彩圖頁Ⅰ）。

2.3 4組肝組織G-6-P和血清FFA濃度比較

與NC組小鼠相比，DM組小鼠肝組織G-6-P，血清FFA水平均顯著升高（P＜0.05）。與DM組小鼠相比，DM+H組和DM+L組小鼠血清FFA濃度顯著下降（P＜0.05），肝組織G-6-P濃度DM+H組小鼠顯著下降（P＜0.05），DM+L組無顯著差異 （表2）。

Tab.2 Comparison of average concentration ofG-6-P in liver and FFA in serum among four groups（±s，n =10）

Tab.2 Comparison of average concentration ofG-6-P in liver and FFA in serum among four groups（±s，n =10）

NC:Normal control；DM:Diabetesmodel control；DM+L: Diabetesmodel controlwith low AdipoRon；DM+H:Diabetesmodel control with high AdipoRon；G-6-P:Glucose-6-phosphatase；FFA:Free fatty acids*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs DM group

Group　G-6-P FFA NC　68.80±13.26　163.50±14.84 DM　84.70±10.04*　213.10±39.33*DM+L　78.10±10.22　153.70±17.61#DM+H　72.40±10.51#　159.90±17.44#

2.4 4組肝臟糖代謝相關(guān)酶mRNA表達水平變化

DM組小鼠肝組織PEPCK mRNA表達與NC組小鼠比較顯著升高（P＜0.05）。與DM組小鼠相比，DM+H組和DM+L組小鼠肝組織PEPCKmRNA表達顯著降低（P＜0.05），與DM+L組相比，DM+H組小鼠肝組織PEPCK mRNA表達無顯著差異（圖2）。

3 討論

研究顯示，胰島素抵抗可導致脂肪細胞溶解加速，從而使血液中游離脂肪酸含量增加，超過線粒體β氧化鏈負荷，從而使脂肪酸積聚在肝臟，造成肝細胞脂肪變性。本實驗結(jié)果顯示，糖尿病小鼠表現(xiàn)高血糖、高血脂，血中AST、ALT升高，肝細胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常等病理特征，說明高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素已成功構(gòu)建2型糖尿病模型。

Fig.2 Comparison of PEPCK expression in the tissues among the four groupsNC:Normal control；DM:Diabetesmodel control；DM+L: Diabetesmodel controlwith low AdipoRon；DM+H:Diabetes model control with high AdipoRon；PEPCK:Phosphoenolpyruvate carboxylase

2013年，東京大學藥物研究所的Okada-Iwabu教授等對大量能夠結(jié)合并激動脂連素受體的小分子化合物進行了篩選。他們根據(jù)這些小分子化合物是否具有激活A(yù)MPK的能力，選出與脂連素作用相似的小分子化合物，并將其命名為AdipoRon。脂連素受體抑制劑AdipoRon對肌肉和肝臟的影響與脂連素（adiponectin，APN）的作用非常相似。脂聯(lián)素，又稱apM1、Acrp30、GBP21或Adiop，為脂肪組織分泌的脂肪因子，是一種脂肪組織特異性糖蛋白。1995年Scherer等［5］首先從鼠的脂肪細胞分離出來 ，當時命名為Acrp30；1996年Nakano等［6］在人脂肪細胞中得到Acrp30的類似物；1999年Arita等［7］將其命名為脂聯(lián)素，并建立了可測定人的血漿中脂聯(lián)素濃度的方法。研究表明，脂聯(lián)素對胰島有顯著的保護作用。此外，糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展也與脂聯(lián)素降低有密切關(guān)系，如大血管病變及早期腎病，其患者的血清脂聯(lián)素濃度明顯低于單純糖尿病患者。本實驗中，在注射AdipoRon后，血中相關(guān)指標ALT、AST、ALP、TG、GLU的水平下調(diào)，肝組織的G-6-P，PEPCK的表達下降，具有顯著的2型糖尿病治療效果。國外已有研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素在大鼠體內(nèi)可通過抑制PEPCK 和G-6-PmRNA表達，降低肝糖生成，減少肝糖輸出［8］。

肝臟是糖代謝重要的場所，肝細胞葡萄糖攝取、糖原合成等均需要胰島素介導，胰島素是PEPCK最重要的負性調(diào)節(jié)激素，PEPCK促糖異生，當胰島素抵抗時，肝糖異生的抑制作用降低，以及G-6-P調(diào)控著糖原的分解，出現(xiàn)胰島素抵抗時，胰島素對糖異生的關(guān)鍵酶抑制作用減弱，使G-6-P和PEPCK mRNA表達含量增加從而使血糖水平升高。肝臟PEPCK 和G-6-P決定著機體葡萄糖的穩(wěn)態(tài)，過度表達可擾亂整個糖脂穩(wěn)態(tài)，誘導葡萄糖失耐受與外周胰島素抵抗［9，10］。凌紅艷等人［11］也認為用高果糖和高脂飼料誘導的2型糖尿病大鼠模型PEPCK和G-6-P顯著高表達。鐘靈等人［12］同樣認為增強肝葡萄糖激酶G-6-P活性發(fā)揮降血糖作用。在本實驗中，熒光PCR結(jié)果提示給予AdipoRon治療的小鼠增加了肝臟IS胰島素敏感性，通過抑制PEPCK活性而抑制糖異生。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建模型并結(jié)合細胞觀察，研究相關(guān)指標變化，肝臟中肝糖類相關(guān)基因的表達的改變，證明AdipoRon作為以胰島素敏感性下降治療的新靶點開發(fā)出的特異藥物，將會有很高的臨床價值和應(yīng)用前景。

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AdipoRon for the treatment of type 2 diabetes in mice and its possible mechanism of the liver

XIAOMin，QU Xiao-hu，LIChangi，LV Ju-ping，SHIYang，XIE Ke-jian△
（Department of Biology，School of Laboratory Medicine and Life Science，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China）

【ABSTRACT】Objective:To observe the effectof AdipoRon for the treatmentof type 2 diabetes（T2DM）inmice and its effecton the liver. Methods:Fortymale C57/BL6mice（SPF）were randomly divided to normal control（NC）group and the experimentalgroup.To establish the T2DM micemodel，mice in the experimentalgroupwere fedwith high fatand high glucose，combinedwith intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ）in small doses，andmicewere further subdivided intomodel control（DM）group，model controlwith low AdipoRon（DM+L）group andmodel controlwith high AdipoRon（DM+H）group（n=10）.Serum indexes，such as levels of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP）were detected biochemically and themorphological changesof liver cellswere observedwith HE staining and expression of liver carbohydrate related gene（PEPCK）were determined by real-time fluorescence quantitative PCR（real time FQ-PCR）.Results:Comparedwithmice in the DM group，levelsof ALT，AST，ALP，triglyceride（TG），glucose（GLU）reduced in DM+L and DM+H group（P＜0.05）.Concentrations of serum free fatty acids（FFA）in DM+L and DM+H group reduced significantly（P＜0.05）.Besides，concentrations of liver glucose-6-phosphatase（G-6-P）in themice of DM+L group reduced significantly，while therewas no significant difference in the contentofG-6-Pbetween themiceof DM+H group and themice of DM group.Furthermore，the expression of the liver phosphoenolpyruvate carboxylase（PEPCK）in the DM+H group reduced significantly（P＜0.05）.Comparedwith the DM group no significant changewas found in the PEPCK expression between DM+L and DM group.Conclusion:The serum indexes such as levels of ALT，AST，ALP，TG，Glu，G-6-Pand PEPCK were all reduced in DM mice treatedwith AdipoRon，indicating the obvious protecting effectof AdipoRon on the liver in DM mice.

type 2 diabetes； adiponectin receptor excitomotor； liver cell injury； mice

R587.1

A

1000-6834（2016）03-198-04

2015年度浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計劃（實驗動物）項目（2015C37099）

2015-11-24

2016-02-14

Tel:13705883181；E-mail:xkj@wmu.edu.cn