邵娟　李敏才　吳基良

437100 咸寧，湖北科技學院糖尿病及心腦血管病重點實驗室

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·基礎研究·

氯沙坦對華法林誘導的大鼠血管鈣化的作用研究

邵娟李敏才吳基良

437100 咸寧，湖北科技學院糖尿病及心腦血管病重點實驗室

目的觀察氯沙坦對華法林誘導的大鼠血管鈣化模型的影響，并探討其可能的作用機制。方法28只5周齡雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組：對照組(C)、模型組(M)、模型+低劑量氯沙坦組(M+L)、模型+高劑量氯沙坦組(M+H)(每組7只)。造模成功后取各組大鼠主動脈進行HE染色和茜素紅染色，觀察血管壁形態(tài)學變化和鈣鹽沉積情況。實時熒光定量PCR檢測縫隙連接蛋白(Cx43)mRNA表達，Western blot檢測絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Cx43和基質(zhì)Gla蛋白(MGP)表達情況。結(jié)果華法林能夠誘導大鼠血管鈣化模型。與對照組比較，模型組Cx43 mRNA和蛋白表達顯著上調(diào)(3.98±0.65比1.06±0.31，P<0.01；1.91±0.45比1.03±0.07，P=0.029)，MAPK家族中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)活性顯著增加(1.40±0.19比1.04±0.04，P=0.032)，MGP表達顯著下降(0.19±0.07比1.00±0.02，P<0.01)。與模型組比較，兩種劑量氯沙坦干預組Cx43 mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào)(2.28±0.47比3.98±0.65，P=0.021；1.07±0.24和0.64±0.24比1.91±0.45，P=0.047和0.013)，ERK活性顯著降低(0.76±0.04和0.69±0.09比1.40±0.19，均為P<0.01)，MGP表達顯著增加(0.45±0.08和0.83±0.10比0.19±0.07，P=0.013和P<0.01)。結(jié)論氯沙坦可以抑制華法林誘導的大鼠血管鈣化，可能與下調(diào)Cx43表達及ERK活性，增加MGP表達有關。

氯沙坦；血管鈣化；縫隙連接蛋白43；細胞外信號調(diào)節(jié)MAP激酶類；基質(zhì)Gla蛋白

Fund program：National Science Foundation of China (No.81270355); National Science Foundation of Hubei Province (No.2014CFB211)

血管鈣化是許多心血管疾病普遍存在的病理改變，是心腦血管事件發(fā)生率和死亡率顯著增加的重要危險因素[1]。既往認為血管鈣化是一個被動的鈣磷沉積于血管壁的過程，近年來研究表明血管鈣化是一個與骨發(fā)育類似的、主動的可調(diào)控的生物學過程[2]。其中血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向成骨細胞表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化的中心環(huán)節(jié)[3]。多條信號通路及細胞因子共同參與了該病理過程，但具體的調(diào)控機制尚不清楚。

氯沙坦是一種血管緊張素Ⅱ的1型受體(AT1R)阻斷劑，能阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，從而發(fā)揮一系列生理效應。已有研究表明，阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)能夠降低動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎病等疾病的發(fā)病率和死亡率[4-5]。有報道稱，氯沙坦可以抑制高脂飼料誘導的新西蘭兔動脈粥樣硬化及血管鈣化[6]。本研究旨在華法林誘導的大鼠血管鈣化模型基礎上，觀察氯沙坦對血管鈣化的影響，并探討可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

5周齡雄性SD大鼠28只，80～100 g(清潔級)，購自武漢大學實驗動物中心(合格證號：NO.42000500004280)。

1.2主要試劑

華法林和氯沙坦購自Maya試劑公司，茜素紅購自Sigma，抗Cx43抗體購自Abcam公司，抗MGP抗體購自Santa Cruz公司?？筂APK抗體及抗GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司。Trizol試劑(北京艾德萊生物)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia，USA)，SYBR Premix Ex TaqTM(Takara，Japan)，PCR擴增引物由擎科生物公司合成。普通PCR儀(Bio-Rad，USA)，752紫外分光光度計(上海舜宇恒科學儀器有限公司)，7900熒光定量PCR儀(ABI，USA)。

1.3大鼠血管鈣化模型建立及實驗分組

參照文獻[7]建立大鼠血管鈣化模型，28只5周齡雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為4組，每組各7只：對照組(C組)、模型組(M組)、模型+低劑量氯沙坦組(M+L組)、模型+高劑量氯沙坦組(M+H組)。C組：普通飼料喂養(yǎng)，給予和模型組等容量生理鹽水皮下注射；M組：每天早上8點給予華法林(15 mg/100 g)和維生素K1(1.5 mg/100 g)皮下注射1次，晚上8點第2次給予華法林(15 mg/100 g)皮下注射，持續(xù)2周；M+L組：在模型組基礎上于第2周每天早上9點給予氯沙坦(1 mg/100 g)皮下注射持續(xù)1周；M+H組：在模型組基礎上于第2周每天早上9點給予氯沙坦(2 mg/100 g)皮下注射持續(xù)1周。在第1次給予華法林皮下注射前24 h及48 h，所有大鼠分別給予維生素K1(1.5 mg/100 g)皮下注射1次預防出血。待造模完成后處死大鼠取主動脈，收集標本于-80℃冰箱保存或甲醛固定。

1.4HE染色

取大鼠主動脈血管，4%中性甲醛固定，石蠟包埋連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、脫水后行蘇木素-伊紅染色(HE染色)，于顯微鏡下觀察拍照。

1.5茜素紅染色

取大鼠主動脈血管，4%中性甲醛固定，石蠟包埋連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，用1%茜素紅染色10 min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察其形態(tài)特征。

1.6實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

按Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA，采用752紫外分光光度計對RNA濃度進行測定。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明，以合成的cDNA為模板進行qRT-PCR反應。Cx43引物序列：Cx43上游引物為5′-TGCTCCTCACCAACGGCTCCACT-3′，下游5′-GCGCTGTAGTTCGCCCAGTTTT-3′； 以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH上游引物5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。逆轉(zhuǎn)錄條件：94℃ 4 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30個循環(huán)；72℃ 4 min，4℃ 4 min。qRT-PCR反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。實驗重復3次，根據(jù)2-△△Ct法計算相對表達量并進行統(tǒng)計。

(2)第二階段。經(jīng)過專業(yè)組織的基本技能比賽、專業(yè)技能比賽和指導教師的篩選，挑選優(yōu)秀學生進入電信學院科技創(chuàng)新中心、名師工作室、技能競賽等團隊，學院提供專門的場地并劃撥專項經(jīng)費進行扶持，由專業(yè)骨干教師指導團隊學生、帶領他們參加國家、省、市級技能競賽或完成企業(yè)合作項目開發(fā)，其他學生則準備專業(yè)技能考證。

1.7Western blot檢測

將主動脈從-80℃冰箱中取出置于冰上勻漿提取總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。樣品通過8%SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加一抗(Cx43 1∶8 000、GAPDH 1∶1 000，MAPK 1∶1 000，MGP 1∶300)稀釋液，4℃孵育過夜；經(jīng)洗滌后，用HRP標記的二抗稀釋液(1∶5 000)室溫孵育1 h，以ECL發(fā)光試劑盒顯影；圖像分析軟件掃描條帶灰度值，計算蛋白表達相對定量，實驗重復3次。

1.8統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果

2.1氯沙坦對華法林和維生素K1誘導的血管鈣化的影響

HE染色的形態(tài)學特征：VSMCs排列紊亂，血管壁結(jié)構(gòu)松散、厚度增加、彈性降低，部分管壁中層斷裂，這些都是血管鈣化的典型病變。經(jīng)鈣化特異性染色——茜素紅染色后，模型組中部分血管區(qū)域呈現(xiàn)深紅色條紋樣鈣鹽沉積特征。表明華法林和維生素K1聯(lián)合應用能夠誘發(fā)血管鈣化。經(jīng)過氯沙坦處理后發(fā)現(xiàn)血管壁結(jié)構(gòu)形態(tài)和鈣鹽沉積情況均明顯減輕(圖1、2)。

2.2氯沙坦對主動脈Cx43 mRNA及蛋白表達的影響

縫隙連接是存在于相鄰細胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，基本組成單位是連接蛋白(connexin，Cx)，在VSMCs及成骨細胞中存在著豐富的縫隙連接，主要表達Cx43。有研究發(fā)現(xiàn)，Cx43能調(diào)控成骨樣細胞分化及骨形成過程[8-9]。在本實驗中，qRT-PCR結(jié)果表明，與對照組比較，模型組Cx43 mRNA表達水平顯著性增高；兩種劑量氯沙坦干預組Cx43 mRNA表達水平較模型組均不同程度降低，且高劑量氯沙坦處理組降低更明顯(圖3)。Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組Cx43蛋白表達水平顯著增高；兩種劑量氯沙坦處理組Cx43蛋白表達水平較模型組均顯著降低，且高劑量組降低更顯著(圖4)。

A：對照組；B：模型組；C：模型+低劑量氯沙坦組；D：模型+高劑量氯沙坦組圖1　大鼠主動脈HE染色(×100)

A：對照組；B：模型組；C：模型+低劑量氯沙坦組；D：模型+高劑量氯沙坦組圖2　大鼠主動脈茜素紅染色(×100)

與對照組比較，aP<0.01 ；與模型組比較，bp<0.05 圖3　qRT-PCR檢測主動脈Cx43 mRNA表達(n=7)

與對照組比較，aP<0.01 ；與模型組比較，bP<0.05 圖4　Western blot 檢測主動脈Cx43蛋白表達(n=7)

2.3氯沙坦對主動脈MAPK蛋白表達的影響

MAPK是一類細胞信號調(diào)節(jié)激酶，MAPK信號途徑對調(diào)控細胞增殖及分化起關鍵作用，也是血管鈣化過程中一條重要的信號通路。Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組主動脈MAPK中的ERK信號磷酸化被激活，但未檢測到c-jun氨基末端激酶(JNK)及絲裂原活化蛋白激酶(P38)信號活化。兩種劑量氯沙坦干預組均能顯著降低ERK磷酸化水平，且高劑量組降低更明顯(圖5)。

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.01圖5　Western blot 檢測主動脈MAPK蛋白表達(n=7)

2.4氯沙坦對主動脈MGP表達的影響

MGP是體內(nèi)最重要的鈣化抑制物，MGP能夠與礦化物、鈣離子等結(jié)合抑制礦化物和鈣結(jié)晶的生長。MGP表達的減少常預示著VSMCs表型向成骨樣細胞表型的轉(zhuǎn)換，更易發(fā)生血管鈣化。在本實驗中，與對照組相比，模型組MGP的表達明顯下降；與模型組相比，兩種劑量氯沙坦干預組均能顯著增加MGP的表達，且具有一定劑量依從性(圖6)，提示氯沙坦有可能通過上調(diào)MGP的表達抑制大鼠血管鈣化的發(fā)生。

與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01圖6　Western blot檢測主動脈MGP表達(n=7)

3　討論

血管鈣化常涉及動脈內(nèi)彈力膜及中層彈性纖維鈣化，引起動脈變硬及管腔壓力增加。常見于動脈粥樣硬化、糖尿病和慢性腎病等疾病，與心血管疾病高發(fā)病率及死亡率密切相關[10]。近年來，許多研究表明血管鈣化是一個類似于骨形成的主動調(diào)節(jié)過程，VSMCs發(fā)生成骨樣細胞分化在其中起關鍵作用。華法林是維生素K的抑制劑，基質(zhì)Gla蛋白(matrix gla protein，MGP)是一種血管鈣化抑制因子，其活化需要通過以維生素K為輔因子的羧化作用。華法林通過拮抗維生素K而抑制MGP活化發(fā)揮其致動脈鈣化作用。我們使用華法林誘導大鼠主動脈血管鈣化，經(jīng)鈣化特異性茜素紅染色表現(xiàn)為內(nèi)彈力膜增厚，鈣鹽沉積和中層彈性纖維鈣化等形態(tài)學改變。經(jīng)氯沙坦處理后能明顯減輕血管鈣化情況。

在心血管系統(tǒng)中，心肌細胞及VSMCs間存在著豐富的縫隙連接，主要表達Cx43。Cx43也是成骨細胞中的主要連接蛋白，是細胞骨化的重要標記物。有研究表明，在機械應激引起的后縱韌帶骨化癥(OPLL)患者韌帶組織中，Cx43表達上調(diào)，從而促進了韌帶細胞的成骨樣分化[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在血管鈣化模型組中Cx43 mRNA及蛋白表達明顯上調(diào)，與前述研究一致，經(jīng)氯沙坦干預后Cx43表達均顯著下調(diào)。

MAPK是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括ERK、JNK和P38。研究證實MAPK信號途徑能將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至細胞及核內(nèi)，在細胞增殖、分化及凋亡過程中具有至關重要的作用。許多研究表明，ERK參與了調(diào)控VSMCs的成骨樣分化過程，但這一過程尚存在爭議。Ding等[11]研究表明，纖維連接蛋白能通過ERK信號途徑促進VSMCs的成骨樣分化。Wu等[12]研究表明，過表達Rap1A能增強ERK/P38磷酸化從而促進C2C12成骨樣分化。而Liu等[13]研究證實，硒通過抑制氧化應激及ERK激活抑制H2O2誘導的VSMCs鈣化。Liang等[14]研究證實，胃饑餓素能通過ERK信號途徑抑制VSMCs的成骨分化，且這種抑制作用具有時間和劑量依賴性。我們的研究表明，氯沙坦在抑制血管鈣化過程中抑制了ERK磷酸化水平，但未檢測到JNK及P38信號活化。

MGP是由平滑肌細胞及軟骨細胞合成的一種細胞外基質(zhì)蛋白，含有5個γ-羧谷氨酸(Gla)殘基，經(jīng)過以維生素K為輔因子的羧化酶羧化后與羥基磷灰石晶體具有高度親和力，可顯著抑制鈣鹽沉積及羥基磷灰石晶體，是一種強有力的抑制血管鈣化的因子。我們的研究表明，氯沙坦可以明顯上調(diào)MGP的表達，且具有一定的劑量依從性。提示我們氯沙坦可能通過上調(diào)MGP的表達抑制大鼠血管鈣化的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)氯沙坦在華法林誘導的血管鈣化過程中起抑制作用，這種作用可能是通過氯沙坦下調(diào)Cx43的表達及ERK活性，上調(diào)鈣化抑制因子MGP的表達，從而抑制VSMCs成骨樣分化來實現(xiàn)的，為血管鈣化的臨床防治提供了一個新思路。但本研究尚未涉及Cx43、ERK及MGP在氯沙坦抑制血管鈣化過程中的上下游關系。

利益沖突：無

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(本文編輯：譚瀟)

Effects of losartan on warfarin-induced vascular calcification in rats

ShaoJuan，LiMincai，WuJiliang

KeyLaboratoryonCardiovascular，CerebrovascularandMetabolicDiseaseofHubeiProvince，HubeiUniversityofScienceandTechnology，Xianning437100，ChinaCorrespondingauthor：LiMincai，Email：mincaili@163.com；WuJiliang，Email：xywjl@163.com

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of losartan regulating vascular calcification in rat vascular calcification models induced by warfarin.MethodsTwenty eight 5-week-old male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups：Control (C)，Model (M)，Model+Low losartan (M+L)，Model+High losartan (M+H).Vascular calcification was confirmed by HE and Alizarin Red staining to observe morphology and calcium deposition of vascular wall.The expression of Connexin43 (Cx43) mRNA was detected by real-time quantitative PCR.The expression of mitogen-activated protein kinase (MAPK)，Cx43 and Matrix Gla Protein (MGP) were analyzed by western blot.ResultsThe vascular calcification could be induced by warfarin in rats.Compared with C group，The expressions of Cx43 mRNA and protein in aorta in model group were up-regulated significantly (3.98±0.65vs.1.06±0.31，P<0.01；1.91±0.45vs.1.03±0.07，P=0.029).Meanwhile，the extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity was significantly increased (1.40±0.19vs.1.04±0.04，P=0.032) and the expression of MGP was significantly decreased (0.19±0.07vs.1.00±0.02，P<0.01).Compared with M group，the expression of Cx43 mRNA and protein of aorta in M+L and M+H group were down-regulated significantly (2.28±0.47vs.3.98±0.65，P=0.021；1.07±0.24 and 0.64±0.24vs.1.91±0.45，P=0.047 and 0.013) and ERK activity was significantly decreased (0.76±0.04 and 0.69±0.09vs.1.40±0.19，bothP<0.01).Meanwhile，the expression of MGP was significantly increased (0.45±0.08 and 0.83±0.10vs.0.19±0.07，P=0.013 andP<0.01).ConclusionsWarfarin-induced vascular calcification in rats could be suppressed by losartan.The mechanism may be related with inhibition of Cx43 expression and ERK activation，and increased MGP expression.

Losartan；Vascular calcification；Connexin 43；Extracellular signal-regulated MAP kinases；Matrix gla protein

李敏才，電子信箱：mincaili@163.com；吳基良，電子信箱：xywjl@163.com

10.3969/j.issn.1007-5410.2016.04.010

國家自然科學基金項目(81270355)；湖北省自然科學基金項目(2014CFB211)

2016- 03-07)