李正秋，　劉蘭香，　劉云花

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臨床研究

兩種不同方法檢測(cè)兒童肺炎支原體感染的對(duì)比分析

李正秋，劉蘭香，劉云花

目的 比較血清肺炎支原體抗體ELISA檢測(cè)和間接血凝試驗(yàn)法，探討肺炎支原體感染實(shí)驗(yàn)室診斷的高性價(jià)比方法。方法2013年12月至2015年1月湖南省兒童醫(yī)院兒科收治住院的支氣管肺炎患兒352例，取患兒呼吸道分泌物及血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)和間接血凝試驗(yàn)，并且對(duì)血清進(jìn)行分離培養(yǎng)，以分離培養(yǎng)作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，比較ELISA檢測(cè)和間接血凝試驗(yàn)的診斷效果。結(jié)果間接血凝實(shí)驗(yàn)法的靈敏度為97.5%(159/163)，顯著高于ELISA檢測(cè)法86.5%(141/163)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ELISA檢測(cè)法的特異度為91.5%(173/189)，顯著高于間接血凝法70.9%(134/189)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ELISA檢測(cè)法診斷效率為89.2%，Kappa指數(shù)為0.782，間接血凝試驗(yàn)法診斷效率為83.2%，Kappa指數(shù)為0.670。兩組方法診斷效率相近，Kappa指數(shù)呈中高度一致。結(jié)論ELISA檢測(cè)和間接血凝實(shí)驗(yàn)法各有優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)室可按照臨床診斷要求選擇合適的方法進(jìn)行檢測(cè)。

肺炎支原體；分離培養(yǎng)；血清學(xué)；免疫；兒童

兒童肺炎支原體感染往往起病緩慢，病程持續(xù)長(zhǎng)短不一，其致病微生物為肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia，MP)，是一種介于細(xì)菌和病毒之間的微生物，菌體大小為0.2～0.3 μm，且呈高度多形性[1]，在顯微鏡下難以鑒定。且其癥狀、體征無(wú)特異性，患兒胸片尚難以與其他致病原所致感染進(jìn)行區(qū)分，因而臨床上常常漏診或誤診，尤其是當(dāng)病情控制不佳時(shí)，因漏診、使用的抗生素?zé)o效而導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥常常危及患兒生命。兒童對(duì)MP普遍易感，尤其是免疫功能發(fā)育不全或低下的患兒常常出現(xiàn)反復(fù)感染，為避免錯(cuò)用、濫用抗生素，MP的實(shí)驗(yàn)室檢查的重要性不言而喻。現(xiàn)臨床上的病原學(xué)診斷有兩大類，一是直接病原體檢測(cè)，依賴分離培養(yǎng)和PCR法鑒定MP-DNA，其中分離培養(yǎng)和鑒定被認(rèn)為是感染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[2]；二是血清學(xué)檢測(cè)，如采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)MP-IgM，間接血凝試驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IgM、IgG等。本研究擬將間接血凝試驗(yàn)與ELISA檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，為相關(guān)臨床決策及醫(yī)療實(shí)踐提供參考。

1　資料與方法

1.1臨床資料2013年12月至2015年1月湖南省兒童醫(yī)院兒科收治住院的支氣管肺炎患兒352例，其中男200例，女152例；年齡6個(gè)月至12歲；其主要癥狀為“發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促、伴或不伴有流涕”，主要體征為“肺部能聞及中、細(xì)濕性啰音”，X線胸片提示肺紋理增強(qiáng)、片狀或斑塊狀陰影等改變。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》中支氣管肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn)(1)符合支氣管肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡6個(gè)月至12歲；(3)患兒家屬知情同意。

1.4排除標(biāo)準(zhǔn)(1)不固定在本院治療或中途轉(zhuǎn)院、轉(zhuǎn)診者；(2)原發(fā)性或繼發(fā)性的免疫缺陷疾病者。

1.5偏倚的控制嚴(yán)格納入對(duì)象的選擇標(biāo)準(zhǔn)，取得患兒及家屬的合作，提高診療依從性，可采用雙份樣本的方法，及時(shí)對(duì)照，對(duì)技術(shù)人員進(jìn)行培訓(xùn)，按儀器設(shè)備要求的環(huán)境條件操作，完善質(zhì)量控制措施。多次復(fù)發(fā)的患兒只計(jì)入一次樣本。

1.6方法352例患兒同時(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)、間接血凝實(shí)驗(yàn)檢查MP-IgM檢測(cè)痰液MP。具體如下：

1.6.1MP培養(yǎng)[3]取所有患兒鼻咽拭子、痰液或支氣管分泌物。培養(yǎng)基中富含足量血清和新鮮酵母浸出液，接種后于37 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落。為提高診療效率，即全面充分利用樣本，避免反復(fù)取材，在進(jìn)行MP培養(yǎng)外，進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。

1.6.2間接血凝實(shí)驗(yàn)取患兒靜脈血2 mL置于采樣管內(nèi)，離心置于冰箱內(nèi)備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)取血清上清液，進(jìn)行間接血凝試驗(yàn)。試劑盒購(gòu)自日本富士MP檢測(cè)試劑盒(SERODIA——MYCOⅡ)，載體為明膠粒子，按試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。在微量滴定板或試管中進(jìn)行，將標(biāo)本倍比稀釋，稀釋倍率為1∶64，同時(shí)設(shè)不含標(biāo)本的稀釋液對(duì)照孔。在含稀釋標(biāo)本1滴的板孔(或試管)中，加入0.5%致敏紅細(xì)胞懸液1滴，充分混勻，置室溫1～2 h，即可觀察結(jié)果。凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈1圓點(diǎn)的為不凝集(-)。如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周圍。根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽(yáng)性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以抖凝集的孔為滴度終點(diǎn)。

1.6.3抗MP-IgM ELISA檢測(cè)方法嚴(yán)格根據(jù)ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，樣本稀釋液中含有IgG/RF吸附劑，要與血清標(biāo)本充分反應(yīng)時(shí)間超過(guò)20 min之后再進(jìn)行檢測(cè)。

1.7觀察指標(biāo)靈敏度、特異度、診斷指數(shù)、診斷效率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、漏診率、誤診率、可用度、約登指數(shù)、Kappa指數(shù)。診斷指數(shù)值越大，診斷試驗(yàn)的應(yīng)用價(jià)值也越大，當(dāng)診斷指數(shù)值≤1的試驗(yàn)應(yīng)淘汰；診斷效率值俞大，臨床應(yīng)用價(jià)值愈好，診斷效率值≤50%的試驗(yàn)應(yīng)予廢棄；患病率相同時(shí)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值越接近1，檢測(cè)方法的診斷價(jià)值越高；診斷性試驗(yàn)的可用度波動(dòng)在0～1之間，一般認(rèn)為，只有可用度≥0.5的試驗(yàn)才有利用價(jià)值；約登指數(shù)的取值范圍在(-1，+1)，越接近于+1，診斷的正確性越好；Kappa指數(shù)用于評(píng)價(jià)兩種檢驗(yàn)方法的兩次檢驗(yàn)結(jié)果的一致性，即可重復(fù)性檢驗(yàn)，是評(píng)價(jià)可靠性的指標(biāo)之一，一般認(rèn)為Kappa指數(shù)>0.8則可靠性很好，0.4～0.8表明可靠性中高度一致，<0.4則提示該實(shí)驗(yàn)或檢測(cè)方法的可靠性較差。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1間接血凝實(shí)驗(yàn)法的診斷效果分析見(jiàn)表1。

表1　間接血凝實(shí)驗(yàn)法診斷的效果分析(n)

表1結(jié)果表明，間接血凝實(shí)驗(yàn)的靈敏度為97.5%(159/163)，特異度為70.9%(134/189)，診斷指數(shù)為168.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為74.3%(159/214)，陰性預(yù)測(cè)值為97.1%(134/138)，漏診率為2.5%，誤診率為29.1%，可用度70.49%，約登指數(shù)68.4%。

2.2ELISA檢測(cè)法診斷的效果分析見(jiàn)表2。

表2　ELISA檢測(cè)法診斷的效果分析(n)

表2結(jié)果表明，ELISA檢測(cè)法的靈敏度為86.5%(141/163)，特異度為91.5%(173/189)，診斷指數(shù)為178.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89.8%(141/157)，陰性預(yù)測(cè)值為88.7%(173/195)，漏診率為13.5%，誤診率為8.5%，可用度78.07%，約登指數(shù)78.0%。

表1、表2可知，間接血凝實(shí)驗(yàn)法的靈敏度為97.5%(159/163)，顯著高于ELISA檢測(cè)法86.5%(141/163)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.54，P<0.05)；ELISA檢測(cè)法的特異度為91.5%(173/189)，顯著高于間接血凝法70.9%(134/189)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.38，P<0.05)。

2.3間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)法和ELISA檢測(cè)法的可靠性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。

表3　間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)法和ELISA檢測(cè)法的可靠性檢驗(yàn)

表3結(jié)果表明，間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)法和ELISA檢測(cè)法診斷效率相近，兩種檢測(cè)方法Kappa指數(shù)呈中高度一致。

3　討論

近年來(lái)，兒童MP流行有抬頭趨勢(shì)，流行年份可達(dá)30%，其一年四季均可發(fā)病，發(fā)病的高峰在每年的6～10月[3]。由MP造成的感染，因其發(fā)病隱匿，臨床癥狀及體征、X線表現(xiàn)與其他病原微生物所致的感染并無(wú)特異性，常需依賴于兒科醫(yī)師根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)做出判斷，故不符合循證醫(yī)學(xué)時(shí)代的發(fā)展要求。其多臟器、多系統(tǒng)并發(fā)癥，如腎炎、關(guān)節(jié)炎、心肌炎、免疫性溶血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累產(chǎn)生的腦膜炎、腦疝等往往危及患兒生命，產(chǎn)生嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。故能在早期確診MP感染，有針對(duì)性的使用大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，是極其重要的環(huán)節(jié)之一[4]。

MP感染的確診依賴于MP的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，感染性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)是病原體的分離和培養(yǎng)，其可以結(jié)合藥敏實(shí)驗(yàn)[5]，更能對(duì)抗生素的臨床使用提供科學(xué)參考。但由于MP的培養(yǎng)條件挑剔且生長(zhǎng)緩慢，其敏感度不高，故而限制了其臨床使用范圍。血清學(xué)方法現(xiàn)階段有冷凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、間接血凝實(shí)驗(yàn)、ELISA檢測(cè)IgM、IgG等。冷凝集試驗(yàn)因其非特異性不高，其他病原體的感染仍能提示有陽(yáng)性結(jié)果(如呼吸道合胞病毒、腺病毒感染、衣原體感染等)，因而臨床上目前僅為初篩實(shí)驗(yàn)，目前已被棄用；間接血凝試驗(yàn)是以紅細(xì)胞為載體(本法使用明膠粒子作為改良載體)，與待檢樣品中的抗體相結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，依據(jù)此來(lái)判斷感染與否，本法采用的日本富士MP檢測(cè)試劑盒(SERODIA——MYCOⅡ)技術(shù)成熟，價(jià)格成本不高，且陽(yáng)性率較高，因而使用廣泛。其主要檢測(cè)的血清抗體為抗MP-IgM。本法敏感度較培養(yǎng)法高，但特異度有待商榷，故而易出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況，從而造成誤診。近年來(lái)耐紅霉素支原體菌株的出現(xiàn)，提示與臨床實(shí)踐中過(guò)度使用抗生素有關(guān)，因此依據(jù)本法在進(jìn)行抗生素選用時(shí)，要注意結(jié)果假陽(yáng)性的可能，應(yīng)對(duì)照細(xì)菌耐藥實(shí)驗(yàn)輔助決策。此外尚有ELISA法檢測(cè)血清IgM、IgG，葉新明[6]研究指出感染MP的患兒往往血清中IgM出現(xiàn)較早且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)(在血清中維持在10～16周左右)，該法在MP感染中的早前診斷往往較有臨床意義，但血清IgG則出現(xiàn)時(shí)間晚，免疫應(yīng)答慢，因而該法僅能提供回顧性診斷[7]，同時(shí)血清特異性抗體IgM常常與患兒的年齡、發(fā)育情況、炎癥反應(yīng)程度等有關(guān)，為提高診斷準(zhǔn)確性，往往需要雙份血清抗體滴度4倍及以上方有意義[8]，這無(wú)疑增加了取樣的難度，同時(shí)準(zhǔn)確的結(jié)果同樣與取樣的時(shí)機(jī)密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，直接應(yīng)用P1蛋白和P30蛋白的單克隆抗體通過(guò)ELISA方法從患者分泌物、血清中可直接檢測(cè)到MP特異性抗原[1,8]，該法特異度、敏感度均高，且不受患者自身免疫應(yīng)答的影響，出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況較普通血清學(xué)方法為小，越來(lái)越受到科研工作者的關(guān)注，但該法僅運(yùn)用在科學(xué)研究領(lǐng)域，尚未推廣到臨床使用，且其成本較之ELISA檢測(cè)抗體法顯然要大，能否納入醫(yī)保制度尚需進(jìn)一步研究。

間接血凝檢測(cè)和ELISA檢測(cè)的靈敏度度分別為97.5%(159/163)和86.5%(141/163)，與胡元生等[9]的研究結(jié)果相一致，此外在可靠性檢驗(yàn)中，兩種實(shí)驗(yàn)的Kappa指數(shù)均較高，提示分離培養(yǎng)法雖然陽(yáng)性率低、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，但其特異度、可靠性高，仍然是感染性疾病診斷的良好指標(biāo)之一。在直接檢測(cè)病原體方法中，尚有PCR法直接檢測(cè)MP-DNA法，該法敏感度高，有較高的約登指數(shù)，但要求的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備、環(huán)境條件、人員操作都較高，樣本不能被污染，且檢測(cè)花費(fèi)較高，按成本-效益法看不易推廣。血液生化學(xué)指標(biāo)同樣在MP感染的診斷中發(fā)揮重要作用，在檢測(cè)微生物學(xué)感染證據(jù)同時(shí)，關(guān)注血清降鈣素原與C反應(yīng)蛋白等指標(biāo)[10]，更能對(duì)病程進(jìn)行監(jiān)控，特別是為抗生素的療效提供臨床觀察依據(jù)。在MP感染中，血清降鈣素原與C反應(yīng)蛋白等指標(biāo)的變化提示出MP可能進(jìn)入血液循環(huán)，出現(xiàn)MP血癥的可能[11]，因而及時(shí)控制感染在MP感染中有重大意義。

本次研究采用的ELISA檢測(cè)和血凝檢測(cè)法，成本低，對(duì)儀器設(shè)備等硬性條件要求不高、操作易于標(biāo)準(zhǔn)化，人員要求低、對(duì)技術(shù)人員加強(qiáng)培訓(xùn)也有利于質(zhì)量控制，更有利于在廣大基層醫(yī)療推廣普及。ELISA檢測(cè)和間接血凝實(shí)驗(yàn)法各有優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)室可以按照臨床診斷要求選擇合適的方法進(jìn)行檢測(cè)。

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(本文編輯：劉穎)

A comparative analysis of two different methods for detection of Mycoplasma pneumoniae infection in children

LIZhengqiu，LIULanxiang，LIUYunhua.

DepartmentofNuclearMedicine，HunanChildren'sHospital，Changsha410007，China.

ObjectiveTo compare the serum Mycoplasma pneumoniae antibody ELISA test with indirect blood coagulation test method, and to explore the high cost-effective method in laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection.MethodsTotally 352 cases of bronchial pneumonia in children hospitalized in Department of Paediatrics of Children's Hospital of Hunan Province from December 2013 to January 2015 were included, and respiratory secretions and serum were made ELISA and indirect hemagglutination test, and serum was isolated and cultured. The separate culture was regarded as the gold standard for the detection. ELISA and indirect hemagglutination test were compared on diagnosis effect.ResultsThe sensitivity of indirect hemagglutination test method was 97.5%(159/163), significantly higher than that of ELISA(86.5%,141/163)(P<0.05); The specificity of ELISA method for the detection was 91.5%(173/189), significantly higher than indirect hemagglutination method(70.9%,134/189), the difference being statistically significant(P<0.05). The diagnostic efficiency of ELISA detection method was 89.2%, the Kappa index being 0.782; the diagnostic efficiency of indirect hemagglutination method was 83.2%, and the Kappa index was 0.670. The diagnostic efficiency of the two methods was similar, and the Kappa index was in a high degree of consistency.ConclusionELISA test and indirect blood coagulation test method have their own advantage, so the laboratory can choose the appropriate method according to the clinical diagnosis.

Mycoplasma pneumonia；Separate culture；Serology；Immune；Children

410007 湖南 長(zhǎng)沙，湖南省兒童醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科

李正秋(1975-)，男，副主任技師。研究方向：免疫學(xué)檢測(cè)與小兒內(nèi)分泌的體外檢測(cè)

李正秋，E-mail：535106686@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2016.04.017

R725.6

A

1674-3865(2016)04-0423-04

2016-03-17)