汪 燕，馮 皓，余炳偉，吳春銀，王小晴，王 軍，單體江

(1.肇慶市高要區(qū)林業(yè)局，廣東 肇慶 526100；2.華南農(nóng)業(yè)大學、廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642)

白千層葉片和果實揮發(fā)油化學成分及抗菌活性

汪 燕1，馮 皓2，余炳偉2，吳春銀2，王小晴2，王 軍2，單體江2

(1.肇慶市高要區(qū)林業(yè)局，廣東 肇慶 526100；2.華南農(nóng)業(yè)大學、廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642)

采用水蒸氣蒸餾法分別提取白千層葉片、果實中的揮發(fā)油，得率分別為1.446%、0.277%。通過GC-MS分析，從白千層葉片、果實中各檢測出31、28種成分，分別占二者揮發(fā)油總量的95.442%、92.460%。白千層葉片與果實揮發(fā)油中共有成分為8種，葉片揮發(fā)油中的主要成分為桉樹腦(48.372%)、鳳蝶醇(13.641%)、α-松油醇(10.004%)、蒎烯(6.411%)，而果實揮發(fā)油的主要成分為水菖蒲烯(35.475%)、蒎烯(14.828%)、鳳蝶醇(11.174%)、桉樹腦(7.541%)和D-檸檬烯(6.301%)。采用濾紙片擴散法測定白千層葉片、果實揮發(fā)油對桉樹青枯病菌等7種供試細菌的抑制活性，表明白千層葉片和果實揮發(fā)油對供試細菌均有一定的抑制作用，其中葉片揮發(fā)油對桉樹青枯病菌表現(xiàn)出較好的抑制活性。

白千層；揮發(fā)油；成分分析；抗菌活性

白千層(MelaleucaleucadendraLinn)為桃金娘科白千層屬(Melaleuca)常綠喬木，原產(chǎn)于澳大利亞東部的昆士蘭州和新南威爾士北部，高度可達40 m，樹皮薄如紙、多層[1-2]。20 世紀90 年代初，由于白千層枝葉蒸餾而得的茶樹油具有較好的抗菌活性和抗氧化活性，開發(fā)和應用前景廣闊，我國開始引進白千層，陸續(xù)在廣東、廣西、福建、海南、云南、貴州等地大面積種植[2-4]。目前，國內(nèi)外雖然對于白千層揮發(fā)油的化學組成早有報道，但多集中于對其葉片揮發(fā)油及其抗菌活性的研究[1，5-6]，尚未見果實揮發(fā)油化學組成及其抗細菌活性的報道。曹維等[7]對廣東河源引種的互葉白千層揮發(fā)油成分及抗菌作用研究發(fā)現(xiàn)河源互葉白千層精油品質(zhì)優(yōu)良，對常見細菌有較好的抑制和殺滅作用，對皮膚無明顯刺激性。趙鑫等[8]發(fā)現(xiàn)互葉白千層揮發(fā)油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及白色念珠菌等具有一定的抗菌能力。然而白千層揮發(fā)油因地域分布不同而略有差異，且不同部位揮發(fā)油的化學成分和抑菌作用也往往具有一定的差異[9]。

本研究通過水蒸氣蒸餾法分別提取白千層葉片和果實中的揮發(fā)油，通過GC-MS分析和鑒定葉片和果實揮發(fā)油的化學組成，同時采用濾紙片擴散法測定了白千層葉片和果實揮發(fā)油對桉樹青枯病菌等7種供試細菌的抑制活性，闡明白千層葉片和果實揮發(fā)油在化合物種類和相對含量的差別，從而為白千層揮發(fā)油的綜合開發(fā)和利用以及農(nóng)林病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

白千層的葉片和果實均采自華南農(nóng)業(yè)大學校園，標本由華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院鄭明軒老師鑒定。

1.2 儀器與試劑

水蒸氣蒸餾裝置(北京永光明醫(yī)療儀器廠)；6890N-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)(美國安捷倫科技有限公司)；氯化鈉、無水乙醚、無水硫酸鈉、二氯甲烷等均為國產(chǎn)分析純(北京化學試劑公司)。

1.3 揮發(fā)油的提取

參照Lou等[10]的方法，分別采集白千層的葉片和果實，稱重后將其裝入水蒸氣蒸餾裝置，加入適量蒸餾水，待溫度升至100 ℃后連續(xù)蒸餾6 h，收集蒸出的揮發(fā)油，加入一定量的NaCl，用無水乙醚萃取3次，萃取液合并，加入無水硫酸鈉進行干燥，濃縮萃取液或讓無水乙醚自然揮發(fā)，4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 白千層葉片和果實揮發(fā)油化學組分的GC-MS分析

白千層葉片和果實揮發(fā)油化學組分鑒定采用6890N-5975C GC-MS測定，色譜柱為DB-5(30 m×250 μm×0.25 μm)，無分流進樣，進樣量1 μL。升溫程序：起始溫度70 ℃，保持1 min；然后8 ℃·min-1上升到120 ℃，保持1 min；再以30 ℃·min-1上升到150 ℃，保持1 min；以5 ℃·min-1上升到175 ℃，保持0 min；然后1 ℃·min-1上升到180 ℃，保持0 min；最后5 ℃·min-1上升到240 ℃，保持0 min；離子源溫度230 ℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，載氣為He，流速1 mL·min-1，全掃描采集，質(zhì)譜檢測器(MSD)檢測。通過NIST(2011)譜庫檢索，與標準化合物的保留時間和質(zhì)譜圖作對比，確定待測成分。

1.5 白千層葉片和果實揮發(fā)油抗細菌活性的測定

供試菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，G+)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，G+)、桉樹青枯病菌(Ralstoniasolanacearum，G-)、番茄瘡痂病菌(Xanthomonasvesicatoria，G-)、黃瓜角斑病菌(Pseudomonaslachrymans，G-)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus，G+)、大腸桿菌(Escherichiacoli，G-)，以上菌株均由華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院森林保護教研室提供。

抗細菌活性的測定參照龔佑文[11]的方法，略有改進。供試細菌由于長期保存在-20 ℃下，在活性測定前，先用LB 平板進行活化培養(yǎng)(28 ℃，暗)48 h，然后挑取單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中搖培(28 ℃，暗，150 r·min-1) 24 h，將菌液濃度稀釋到108cfu·mL-1，備用。倒好平板后，用移液槍分別吸取50 μL菌液，用玻璃棒涂板。用鑷子夾取直徑6 mm的無菌的濾紙片放在白千層葉片和果實揮發(fā)油中浸泡20 min，取出瀝干后置于帶菌平板中，在37 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)24 h后用尺子量取抑菌圈的大小，設置溶劑對照和陽性對照(硫酸鏈霉素)，每皿放3張濾紙，每個處理重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 白千層葉片、果實揮發(fā)油化學成分

通過水蒸氣蒸餾法提取白千層葉片、果實中的揮發(fā)油，得率分別為1.446%、0.277%(以鮮重為基礎)，說明白千層葉片中揮發(fā)油的含量遠高于其果實。白千層葉片、果實揮發(fā)油總離子流色譜圖見圖1、圖2。通過GC-MS分析，在白千層葉片揮發(fā)油中共鑒定出31種成分，占總相對含量的95.442%，主要成分是桉樹腦(48.372%)、鳳蝶醇(13.641%)、α-松油醇(10.004%)、蒎烯(6.411%)，其相對含量之和為78.428%；在果實揮發(fā)油中共鑒定出28種成分，占總相對含量的92.460%，主要成分為水菖蒲烯(35.475%)、蒎烯(14.828%)、鳳蝶醇(11.174%)、桉樹腦(7.541%)和D-檸檬烯(6.301%)，其相對含量之和為75.319%。白千層葉片、果實揮發(fā)油組成成分及其相對含量見表1。

圖1 白千層葉片精油總離子流色譜圖圖2 白千層種子精油總離子流色譜圖

從表1還可看出，白千層葉片與果實揮發(fā)油的組成成分有明顯區(qū)別，二者相同的組分只有8種，分別是蒎烯、莰烯、苯甲醛、桉樹腦、1-石竹烯、δ-杜松烯、(-)-α-芹子烯和鳳蝶醇。在白千層葉片揮發(fā)油中，含量最高的組分是桉樹腦(48.372%)，而在果實揮發(fā)油中其含量卻只有7.541%；α-松油醇在葉片揮發(fā)油中的含量為10.004%，而在果實揮發(fā)油中卻沒有發(fā)現(xiàn)。果實揮發(fā)油中含量最高的水菖蒲烯，其含量高達35.475%，而在葉片揮發(fā)油中卻尚未檢測到；其次，白千層葉片揮發(fā)油中檸檬烯的含量為4.881%，而在果實揮發(fā)油中為D-檸檬烯，其含量為6.301%。通過以上分析可知，白千層葉片和果實中都含有種類豐富的揮發(fā)油，但化學組成有一定的差異，因此在白千層揮發(fā)油生產(chǎn)過程中，要根據(jù)不同的需求，采集不同的部位進行提取。

表1 白千層葉片和種子精油成分及含量

表1(續(xù))

*：“-”為未檢測到。

2.2 白千層葉片和果實揮發(fā)油抗菌活性檢測

白千層葉片、果實揮發(fā)油對7種供試細菌的抑制活性見圖3，葉片、果實揮發(fā)油對供試細菌均表現(xiàn)出一定的抑制活性，這與曹維等[7]、趙鑫等[8]的研究結(jié)果基本一致，說明白千層葉片和果實揮發(fā)油具有廣譜的抑菌作用。從整體來看，白千層葉片揮發(fā)油的抑菌活性明顯強于果實揮發(fā)油，且對革蘭氏陰性菌的抑制作用要好于革蘭氏陽性菌。白千層葉片揮發(fā)油對番茄瘡痂病菌的抑制活性最強，抑菌圈直徑為(19.8 ± 0.9)mm，明顯強于陽性對照硫酸鏈霉素(抑菌圈直徑(10.5 ± 0.5)mm)；其次是桉樹青枯病菌，抑菌圈直徑為(17.1 ± 0.9)mm。白千層果實揮發(fā)油對番茄瘡痂病菌和大腸桿菌表現(xiàn)出較好的抑制活性，但與陽性對照硫酸鏈霉素相差不大。

3 結(jié)論與討論

本研究對白千層葉片、果實揮發(fā)油中的化學成分進行分析，并首次報道白千層揮發(fā)油對桉樹青枯病菌、黃瓜角斑病菌和番茄瘡痂病菌的抑制活性。近年來，植物揮發(fā)性有機化合物在生態(tài)系統(tǒng)及醫(yī)療保健中的作用日益受到重視。α-蒎烯、β-蒎烯和檸檬烯等萜烯類化合物可增強空氣的清新感，同時可以調(diào)節(jié)人體的神經(jīng)系統(tǒng)，對人體具有保健作用[12-14]；檸檬烯、石竹烯等成分具有一定的抗菌、抗炎作用[15]。白千層作為我國華南地區(qū)常見的園林綠化樹種，其葉片富含蒎烯、檸檬烯等多種揮發(fā)性成分，對城市公園、園林綠化以及森林浴場、森林保健中心等的建設具有重要的意義。試驗結(jié)果表明，白千層葉片揮發(fā)油不僅化學成分的種類多于果實揮發(fā)油，而且對病原細菌的抑制活性也明顯強于果實揮發(fā)油。桉樹腦和α-蒎烯均具有鎮(zhèn)痛、抑菌殺菌等作用[16-18]，桉樹腦在葉片揮發(fā)油中的含量高達48.372%，可能與葉片揮發(fā)油具有較強的抗菌活性有關(guān)。白千層葉片揮發(fā)油對番茄瘡痂病菌和桉樹青枯病菌具有相對較強的抑制活性，因此可直接利用白千層葉片揮發(fā)油來防治農(nóng)林病害；同時在造林時可將白千層與桉樹混交，以降低桉樹青枯病菌對桉樹的危害。植物揮發(fā)油通常是協(xié)同增強劑，當它們與標準藥物聯(lián)合用藥時，其產(chǎn)生的聯(lián)合效應強于個體效應，并產(chǎn)生增強的抗菌活性[19]。白千層葉片和果實對供試細菌均表現(xiàn)出一定的抑制活性，在生物防治上具有重要意義，如能作為協(xié)同增強劑，可有效降低抗生素的使用量，防止細菌耐藥性的產(chǎn)生。此外，白千層揮發(fā)油也具有一定的抗氧化活性[4]，對于白千層揮發(fā)油的綜合開發(fā)和利用具有重要意義。

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Chemical Composition and Antibacterial Activity of Volatile Oil from the Leaves and Fruits ofMelaleucaleucadendra

WANG Yan1，F(xiàn)ENG Hao2,YU Bingwei2，WU Chunying2，WANG Xiaoqing2，WANG Jun2，SHAN Tijiang2

(1.ZhaoqingGaoyaoForestryBureau，Zhaoqing526100，Guangdong，China；2.SouthChinaAgriculturalUniversity，GuangdongKeyLaboratoryforInnovativeDevelopmentandUtilizationofForestPlantGermplasm，Guangzhou510642，Guangdong，China)

The volatile oil were extracted by hydro-distillation with the yield of 1.446% and 0.277% respectively on fresh weight basis from the leaves and fruits ofMelaleucaleucadendra.The chemical compositions of essential oil were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).Thirty-one components were identified from the volatile oil of the leaves and twenty-eight components in the fruits，which accounted for 95.442% and 92.460%of total contents of the two tested samples.There were only a total of 8 common components in volatile oil from the leaves and fruits ofMelaleucaalternifolia.Eucalyptol (48.372%)，selinenol (13.641%)，α-terpineol (10.004%) and pinene (6.411%) were the major compounds in the leaves，and calarene (35.475%)，pinene (14.828%)，selinenol (11.174%)，eucalyptol (7.541%) andD-limonene (6.301%) were the major compounds in the fruits.The in vitro antibacterial activities of the volatile oils on seven bacteria were investigated by filter paper diffusion method.The volatile oil extracted from leaves shows better antibacterial activities onRalstoniasolanacearumthan fruits oil.

Melaleucaleucadendra；volatile oil；chemical constituents；antibacterial activity

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.04.002

2015-11-02；

2016-04-28

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目(2015KJCH043)；廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項目(2014KQNCX034)

汪燕(1983—)，女，湖北黃岡人，肇慶市高要區(qū)林業(yè)局林業(yè)工程師，碩士，從事營林生產(chǎn)及科技推廣工作。E-mail：wangyan_003@163.com。

單體江，華南農(nóng)業(yè)大學講師。E-mail：tjshan@scau.edu.cn。

S763.1；O657.63

A

1002-7351(2016)04-0008-05