徐小軍，吳 莉，張桂蘭

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所 鄭州 450009； 2.中國(guó)科學(xué)院武漢植物園 武漢 430074）

西瓜是一種深受大眾歡迎的夏季水果，近年來(lái)，我國(guó)西瓜的種植面積不斷擴(kuò)大，但由于我國(guó)耕地面積有限，同時(shí)西瓜的經(jīng)濟(jì)效益高，在部分地區(qū)形成了基地化、設(shè)施化的栽培模式，這種長(zhǎng)期在同一地塊上連續(xù)種植西瓜的習(xí)慣導(dǎo)致西瓜產(chǎn)量、品質(zhì)下降及病害加劇，造成連作障礙。這種情況隨著連作茬數(shù)的增加而不斷加重，嚴(yán)重影響了西瓜的生產(chǎn)效益。連作障礙的一個(gè)重要原因是西瓜的自毒作用，即西瓜通過(guò)向環(huán)境中釋放化感物質(zhì)，影響后茬作物種子萌發(fā)和植物生長(zhǎng)的現(xiàn)象。研究表明，西瓜中起自毒作用的化感物質(zhì)主要包括植物分泌的有機(jī)酸、酚類(lèi)和萜類(lèi)化合物，其中有機(jī)酸，特別是酚酸是最主要的化感物質(zhì)[1]。土壤中的化感物質(zhì)影響了植物細(xì)胞的生理生化代謝[2-3]，改變了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[4]，進(jìn)而導(dǎo)致種子的生長(zhǎng)、萌發(fā)特性改變?；形镔|(zhì)還能通過(guò)影響土壤微環(huán)境改變微生物的結(jié)構(gòu)、組成和生理生化特性[5]，外源化感物質(zhì)的添加甚至能直接加重病害[6]。

在西瓜中，不同組織中化感物質(zhì)種類(lèi)和含量不同，化感作用強(qiáng)度也不同[7]。阿魏酸是西瓜中分泌的最重要的酚酸類(lèi)化感物質(zhì)之一，能顯著影響包括白藜、苜蓿等植物種子的萌發(fā)、幼苗的生長(zhǎng)以及抗氧化酶的活性[8-9]。同時(shí)，阿魏酸也是一種重要的藥用化合物，在動(dòng)物細(xì)胞中具有強(qiáng)抗氧化、抗炎癥的作用[10]，同時(shí)，阿魏酸在銅離子存在的條件下，能導(dǎo)致DNA斷裂[11]。阿魏酸處理大豆后，則會(huì)導(dǎo)致木醛糖、蔗糖和果糖含量升高,葡萄糖含量降低[12]，以及木質(zhì)素含量增加[13]，然而，阿魏酸對(duì)西瓜種子的影響機(jī)制，目前尚沒(méi)有系統(tǒng)報(bào)道，筆者擬在前人工作的基礎(chǔ)上，檢測(cè)阿魏酸對(duì)西瓜幼苗不同部位生長(zhǎng)及生理生化的影響，為深入探索阿魏酸對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為西瓜雜交種‘新優(yōu)16’，購(gòu)自新疆冰湖種業(yè)有限責(zé)任公司。阿魏酸以及其他分析用試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)處理 挑選西瓜種子，手工去除包衣后用1%（ω）次氯酸鈉溶液消毒5 min，之后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，用阿魏酸溶液（質(zhì)量濃度分別為 0、100、200、400、600、800、1000 mg·L-1）浸種后，挑選大小一致的種子，常溫下放置在鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，每皿10粒，每個(gè)處理設(shè)置4次重復(fù)。在培養(yǎng)皿中加入對(duì)應(yīng)濃度的阿魏酸溶液2 ml，將培養(yǎng)皿放置在25℃、相對(duì)濕度75%的條件下培養(yǎng)。每隔2 d加入0.5 ml相應(yīng)濃度的阿魏酸溶液，補(bǔ)足水分以保持吸水紙濕潤(rùn)，3 d更換一次吸水紙，保持培養(yǎng)皿清潔。培養(yǎng)7 d后取樣，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.2 種子萌發(fā)與生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 以幼根長(zhǎng)度達(dá)到5 mm作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn),每日觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)。萌發(fā)后4 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，7 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)。7 d取樣，將發(fā)芽的西瓜種子從下胚軸與根的連接處分成2部分，分別測(cè)定不同部分的鮮質(zhì)量與干質(zhì)量。按下面的公式計(jì)算西瓜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)（GI）和活力指數(shù)（VI）：

發(fā)芽勢(shì)（%）=前4d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100；

發(fā)芽率（%）=前7d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt）；活力指數(shù)（VI）=GI×S；

式中，Gt為在t日的種子發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽時(shí)間（天），S為幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)（芽長(zhǎng)度）。

1.2.3 種子生理生化指標(biāo)測(cè)定 種子發(fā)芽7 d后，將其分為根部和莖部（包括下胚軸及其以上部位），測(cè)定各個(gè)部分的生理生化指標(biāo)。超氧陰離子自由基、丙二醛（MDA）含量以及抗氧化保護(hù)酶類(lèi)包括過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等的活性均參照李合生的方法[14]進(jìn)行。苯丙氨酸解氨酶的活性參照賓金華等的方法[15]進(jìn)行，總酚含量利用福林酚法[16]測(cè)定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Excel 2011處理，不同處理之間的數(shù)據(jù)差異顯著性分析利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。濃度間的差異顯著性分析采用Duncan多重比較法，顯著水平設(shè)定為P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸對(duì)西瓜種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響

前人研究結(jié)果表明，酚酸類(lèi)化感物質(zhì)能顯著降低西瓜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。在本研究中，不同濃度阿魏酸處理后，西瓜種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均為100%。對(duì)照處理中，發(fā)芽指數(shù)為（20.00±0.58），當(dāng)質(zhì)量濃度為 100～1 000 mg·L-1阿魏酸處理后，發(fā)芽指數(shù)在（18.06±2.02）到（19.50±1.04）之間變化，且與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異（數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異，未顯示）。阿魏酸顯著改變了西瓜種子的活力指數(shù)和各部分的正常生長(zhǎng)，且在100～1000 mg·L-1范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，西瓜種子生長(zhǎng)受到的影響也越大（圖1）。阿魏酸100 mg·L-1處理后，雖然種子的活力指數(shù)、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)受到顯著抑制，但莖鮮質(zhì)量與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異，莖干質(zhì)量以及根干質(zhì)量較對(duì)照稍有增加，根鮮質(zhì)量則顯著增加。說(shuō)明低濃度阿魏酸能促進(jìn)根部物質(zhì)積累。這與前人報(bào)道的低濃度下化感物質(zhì)能促進(jìn)種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)相似，但在本研究中，低濃度阿魏酸主要促進(jìn)根部代謝物質(zhì)累積。隨著阿魏酸處理濃度增高，植物生長(zhǎng)顯著受到抑制，且處理間存在顯著差異，其中根部受到的影響最大，當(dāng)濃度達(dá)到1 000 mg·L-1時(shí)，根長(zhǎng)為對(duì)照的20%，莖長(zhǎng)為對(duì)照的35%，根干質(zhì)量為對(duì)照的64%，莖干質(zhì)量略高于對(duì)照（表1）。

2.2 阿魏酸對(duì)西瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

不同濃度的阿魏酸均能加快西瓜根和莖中超氧陰離子自由基的產(chǎn)生速率，且根中自由基的產(chǎn)生速率顯著高于莖中（圖2a），與此相對(duì)應(yīng)，當(dāng)阿魏酸質(zhì)量濃度超過(guò)200 mg·L-1時(shí)，西瓜幼苗細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化加劇，且細(xì)胞受到傷害的程度隨著處理濃度的增加而加大。阿魏酸質(zhì)量濃度為200 mg·L-1時(shí)，MDA積累與對(duì)照相比增加50%，當(dāng)阿魏酸質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 mg·L-1時(shí)，MDA含量則增加了1倍左右，且根部MDA含量均高于莖部（圖2b）。

圖1 不同濃度阿魏酸處理7d后，發(fā)芽西瓜種子的表型（部分）

表1 阿魏酸對(duì)西瓜種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響

圖2 阿魏酸對(duì)膜質(zhì)過(guò)氧化（a）及超氧陰離子產(chǎn)生速率（b）的影響

MDA和超氧陰離子的產(chǎn)生是植物細(xì)胞受到氧化脅迫的顯著特征，為了抵御受到的氧化脅迫，植物能利用抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)清除自由基，降低膜的透性。西瓜種子經(jīng)過(guò)阿魏酸處理后，根部和莖部CAT活性顯著上升，當(dāng)阿魏酸質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 mg·L-1時(shí)，CAT活性最高，與對(duì)照相比提高了5倍左右，根中的 CAT 活性比莖高（圖 3a）。100～400 mg·L-1阿魏酸處理后，POD活性逐步升高，當(dāng)超過(guò)600 mg·L-1時(shí)，則POD活性逐漸下降。與莖相比，根中POD活性隨阿魏酸濃度上升快，下降也快（圖3b）。與POD的變化類(lèi)似，當(dāng)阿魏酸質(zhì)量濃度高于200 mg·L-1后，SOD活性逐漸下降，且根中SOD活性下降速率比莖更快（圖3c）。以上結(jié)果表明，阿魏酸對(duì)西瓜幼苗的影響是系統(tǒng)性的，不但引起根的響應(yīng)，也導(dǎo)致莖內(nèi)酶系統(tǒng)發(fā)生改變，但同時(shí)也表明，對(duì)阿魏酸最敏感的器官是根。

圖3 阿魏酸對(duì)西瓜幼苗抗氧化酶CAT（a）、POD（b）和SOD（c）酶活性的影響

2.3 阿魏酸對(duì)西瓜種子幼苗PAL活性和總酚含量的影響

阿魏酸不但能引起西瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)的變化，而且能改變苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，增加植物中總酚含量。質(zhì)量濃度100～400 mg·L-1的阿魏酸處理后，西瓜幼苗根部和莖部PAL活性隨著濃度的增高而逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)阿魏酸質(zhì)量濃度高于600 mg·L-1后，PAL 活性急劇下降，1 000 mg·L-1阿魏酸處理后，PAL活性顯著低于對(duì)照（圖4a）。與此同時(shí)，西瓜幼苗莖部總酚物質(zhì)含量與對(duì)照相比，隨著處理濃度的增加僅略有增加，但西瓜幼苗根中總酚含量則顯著增加，且在阿魏酸質(zhì)量濃度0～1 000 mg·L-1的范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度越高，總酚含量越大（圖 4b）。

圖4 阿魏酸對(duì)西瓜種子幼苗PAL活性（a）及總酚含量（b）的影響

3 討論

本研究結(jié)果表明，阿魏酸通過(guò)干擾正常的生理代謝，影響幼苗正常的生長(zhǎng)發(fā)育。一般而言，低濃度化感物質(zhì)促進(jìn)植物生理生化代謝及生長(zhǎng)，而高濃度化感物質(zhì)則表現(xiàn)為抑制作用或沒(méi)有作用[17-18]，在本研究中，阿魏酸質(zhì)量濃度為100～1 000 mg·L-1時(shí)均顯著抑制了根和上胚軸的伸長(zhǎng)，未觀察到促進(jìn)作用，這可能由于本研究中阿魏酸質(zhì)量濃度相對(duì)較高，也可能是由于阿魏酸與其他化感物質(zhì)的作用機(jī)制不同而導(dǎo)致的。

不同濃度阿魏酸處理下，西瓜幼苗的生理生化響應(yīng)不同。當(dāng)阿魏酸質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，根和莖的超氧陰離子含量增加，同時(shí)，抗氧化酶SOD、POD、CAT均顯著增加，膜質(zhì)過(guò)氧化程度沒(méi)有顯著的變化，說(shuō)明此時(shí)植物已經(jīng)開(kāi)始啟動(dòng)細(xì)胞中的各種保護(hù)機(jī)制。但當(dāng)阿魏酸質(zhì)量濃度超過(guò)600 mg·L-1后，雖然CAT活性持續(xù)升高，但POD和SOD活性逐漸降低，說(shuō)明在該質(zhì)量濃度下，阿魏酸處理已造成不可逆?zhèn)?，?dǎo)致植物的抗氧化系統(tǒng)無(wú)法提供保護(hù)。這與甜瓜在高濃度阿魏酸作用下的反應(yīng)類(lèi)似[19]。同時(shí)，不同的生化指標(biāo)對(duì)阿魏酸的響應(yīng)也存在顯著差異，在抗氧化酶系統(tǒng)中，CAT反應(yīng)最為敏感，并且在很大程度上與阿魏酸的使用濃度有密切關(guān)系，因此，可作為阿魏酸的生物測(cè)試指標(biāo)之一。

阿魏酸嚴(yán)重影響根和莖的伸長(zhǎng)，并降低根和莖的鮮質(zhì)量以及根的干質(zhì)量，其中胚根長(zhǎng)度的變化幅度最大，同時(shí)，生理生化指標(biāo)變化的結(jié)果也表明根部的變化更加劇烈，說(shuō)明阿魏酸對(duì)胚根的影響更顯著，這與前人利用有機(jī)酸化感物質(zhì)研究其他植物的結(jié)果類(lèi)似[20-22]。普遍認(rèn)為，西瓜根是直接接觸、吸收和感受化感物質(zhì)的器官，更容易受到傷害，而地上部分主要靠根部吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滿(mǎn)足需要，只有當(dāng)根受害達(dá)到一定程度，水分和養(yǎng)分不能正常供給時(shí)，地上部分才表現(xiàn)出受害癥狀。在本研究中，利用化感物質(zhì)直接浸泡種子，根和莖都一直接觸阿魏酸，在處理的這7 d中，營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源為子葉。阿魏酸顯著降低了根和莖的鮮質(zhì)量和根的干質(zhì)量，但莖的干質(zhì)量沒(méi)有受到顯著的影響，甚至略有增加（表1），說(shuō)明在種子萌發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中，阿魏酸可能影響了種子中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分配，優(yōu)先供應(yīng)上部葉片，這可能是導(dǎo)致植物根更易受影響的另一個(gè)重要原因。

水稻中的研究表明，苯丙氨酸解氨酶（PAL）是莽草酸途徑和次生代謝途徑的分支點(diǎn)，酚酸類(lèi)物質(zhì)在植物中是通過(guò)苯基丙酮途徑合成的?；形镔|(zhì)合成的關(guān)鍵酶是PAL[23]，同時(shí)，化感物質(zhì)的合成也受POD的調(diào)控[24]，在本研究中，阿魏酸在較低濃度下（＜600 mg·L-1）顯著提高了 PAL 活性，也顯著提高了POD活性，從而增加西瓜根系中酚酸類(lèi)物質(zhì)含量，并將化感物質(zhì)分泌出來(lái)，導(dǎo)致自毒化感物質(zhì)的種類(lèi)增多，濃度增大，進(jìn)一步抑制根的生長(zhǎng)與伸長(zhǎng)。