王 真，趙廷昌，楊玉文，關(guān) 巍 ，胡 俊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 呼和浩特 010019； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所·植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193）

瓜菜細(xì)菌性病害的防治手段單一，造成了大多數(shù)病原細(xì)菌對(duì)抗生素及銅制劑產(chǎn)生耐藥性。早在1962年美國(guó)佛羅里達(dá)州就發(fā)現(xiàn)了番茄瘡痂病菌的田間鏈霉素耐藥菌株[1]，之后有關(guān)植物病原細(xì)菌耐藥性的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。向平安等檢測(cè)了7株不同來(lái)源（中國(guó)）的辣椒瘡痂病菌（Xanthomonas vesicatoria），發(fā)現(xiàn)4株辣椒瘡痂病菌具有較高的鏈霉素耐受性[2]。Shenge等調(diào)查了來(lái)自坦桑尼亞番茄產(chǎn)區(qū)的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病原菌（Xanthomonas campestrispv.vesicatoria），發(fā)現(xiàn)所有菌株對(duì)銅制劑均有較高的耐受性[3]。

病原細(xì)菌對(duì)抗生素或銅制劑較強(qiáng)的適應(yīng)性和耐受性，為瓜菜類(lèi)致病細(xì)菌的防治帶來(lái)挑戰(zhàn)。病原細(xì)菌的耐藥機(jī)制多種多樣，而外排泵的發(fā)現(xiàn)，開(kāi)啟了人類(lèi)認(rèn)識(shí)病原細(xì)菌的新篇章。依賴(lài)于能量的外排泵最早在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)[4]。1983年George和Levy首次報(bào)道了細(xì)菌的外排泵可以增強(qiáng)其多耐抗生素的能力[5]。之后在Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa中發(fā)現(xiàn)的以耐藥結(jié)節(jié)分化家族（resistance-nodulation-division family，RND）為代表的多耐藥外排泵[6-10]成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。RND多耐藥外排泵對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥性貢獻(xiàn)很大，生物信息學(xué)分析表明RND外排泵廣泛存在于瓜菜作物病原細(xì)菌中。瓜菜作物RND外排泵不僅可以外排抗生素、抗菌素等有害物質(zhì)，還可以被逆境激活，參與細(xì)菌侵染植物的整個(gè)過(guò)程[11-13]。但相關(guān)研究較少，具體機(jī)制還不明確。鑒于此，筆者綜述了病原細(xì)菌RND外排泵的結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)菌/植物互作過(guò)程中外排泵的作用及抑制劑等方面的研究進(jìn)展，以期為瓜菜作物病原細(xì)菌耐藥性的研究提供參考。

1 RND外排泵家族的結(jié)構(gòu)與功能

RND家族是一類(lèi)三聚體外排泵，包含有內(nèi)膜蛋白（IMP），位于周質(zhì)的膜融合蛋白（MFP）和外膜蛋白（OMP）[14]。這3類(lèi)蛋白貫穿于細(xì)菌的2層膜，協(xié)同完成細(xì)菌內(nèi)有害物質(zhì)的外排（圖1）?？筛鶕?jù)其外排底物的不同將RND外排泵家族分為兩類(lèi)，一類(lèi)是疏水性或者兩親性的外排泵（HAE-RND）[15]；另一類(lèi)是重金屬外排泵（HME-RND）。HAE-RND家族包括 AcrAB、MexAB-OprM、MexEF-OprN、MdtAB和MdtEF等系統(tǒng)，HME-RND家族目前報(bào)道的僅有CusCFBA系統(tǒng)[16]。這2類(lèi)外排泵廣泛存在于瓜類(lèi)和蔬菜病原細(xì)菌中，筆者以AcrAB和CusCFBA為代表介紹外排泵的結(jié)構(gòu)與功能。

1.1 AcrAB-TolC外排系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能

E.coli的Acr外排家族系統(tǒng)是RND外排泵研究的模型系統(tǒng)。Acr外排家族系統(tǒng)包括外膜通道TolC、膜內(nèi)的次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB以及位于周質(zhì)連接內(nèi)外膜的通道蛋白AcrA。AcrB-AcrA-TolC外排泵可轉(zhuǎn)運(yùn)多種結(jié)構(gòu)不同的抗生素，賦予了細(xì)菌廣譜的抗生素耐藥性。

圖1 AcrABZ-TolC外排泵模型[16]

在E.coli中，位于周質(zhì)的AcrA與細(xì)胞內(nèi)膜通過(guò)氨基端脂質(zhì)修飾連接在一起，其結(jié)構(gòu)域包括周質(zhì)膜區(qū)域、β桶狀區(qū)域、硫辛酰區(qū)域和α發(fā)夾區(qū)域[17]。其中α發(fā)夾區(qū)域與內(nèi)膜的TolC蛋白結(jié)合，其他的區(qū)域可能與AcrB互作[18-21]。

AcrB貫穿于跨膜結(jié)構(gòu)域和周質(zhì)結(jié)構(gòu)域[22]，包括3個(gè)非對(duì)稱(chēng)的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)具有可旋轉(zhuǎn)性，可通過(guò)松散（L）、緊湊（T）、開(kāi)放（O）型 3個(gè)結(jié)構(gòu)的變化，實(shí)現(xiàn)底物的向外運(yùn)輸功能[23-25]（圖1）。TolC外膜通道是由3個(gè)TolC單體組成的炮筒狀結(jié)構(gòu)[26]，這個(gè)通道連接周質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞外膜一直通向細(xì)胞表面[27]。

1.2 CusCFBA外排系統(tǒng)

CusCFBA外排系統(tǒng)是瓜類(lèi)和蔬菜作物病原細(xì)菌重要的銅外排系統(tǒng)，在植物病原細(xì)菌銅制劑耐受性方面具有重要的作用。CusCFBA外排系統(tǒng)（圖2）也是最具有代表性的一個(gè)HME-RND外排系統(tǒng)。它可以外排重金屬Ag+和Cu+，同時(shí)還可能參與磷霉素、二硝基苯酚、硝基苯與乙硫異煙胺的外排[28-29]，該外排泵有助于細(xì)胞內(nèi)Cu+平衡的維持[30]。

圖2 CusBA復(fù)合結(jié)構(gòu)[31]

CusCFBA外排系統(tǒng)由位于內(nèi)膜的CusA，位于周質(zhì)膜的CusB和位于外膜的CusC組成。這與AcrABC結(jié)構(gòu)極為相似，其化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果表明 CusA∶CusB∶CusC 為 3∶6∶3[31-32]。

CusB系統(tǒng)包含4個(gè)亞結(jié)構(gòu)域：3個(gè)β螺旋結(jié)構(gòu)域和1個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域[33]。CusA包含12個(gè)跨膜α螺旋。CusB識(shí)別并結(jié)合Cu+和Ag+，之后將Cu+和Ag+傳遞給位于周質(zhì)膜裂縫處CusA的M573、M623和M672等保守氨基酸殘基（圖3）。接收到重金屬離子的CusA構(gòu)象會(huì)迅速改變，使得這些重金屬離子進(jìn)入外排泵的周質(zhì)區(qū)域中，或者直接通向細(xì)胞外[34]。另外，CusF與CusB相互作用，可能促進(jìn)周質(zhì)膜裂縫的打開(kāi)；CusC自身的螺旋結(jié)構(gòu)與CusB的α螺旋結(jié)構(gòu)相互作用，構(gòu)建了重金屬離子的外排通道[33]。

圖3 底物與CusA結(jié)合示意圖[34]

2 RND耐藥外排泵和病原細(xì)菌/作物互作的關(guān)系

如今植物基因組學(xué)和高通量測(cè)序等新技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物病原細(xì)菌毒力、病原細(xì)菌/植物互作以及病原細(xì)菌耐藥性分析，植物病原細(xì)菌Xanthomonas axonopodispv.citri，Xanthomonas campestrispv.campestris，Ralstonia solanacearum，Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000，Erwinia carotovorasubsp.atroseptica和Xanthomonas oryzaepv.oryzae等的測(cè)序工作相繼完成[35-39]。測(cè)序結(jié)果顯示植物病原細(xì)菌基因組中含有大量的RND外排泵相關(guān)基因。RND外排泵不僅在細(xì)菌耐藥性方面具有重要作用，而且與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)。另外，病原細(xì)菌的RND耐藥外排泵還參與細(xì)菌體代謝副產(chǎn)物的分泌，如RND外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ToxGHI幫助Burkholderia glumaeBGR1外排毒黃素[40]。

Palumbo等最早發(fā)現(xiàn)Agrobacterium tumefaciens中的外排泵IfeAB運(yùn)載體可以外排植物分泌的抑菌性物質(zhì)異黃酮，并且在細(xì)菌定殖寄主作物過(guò)程中有著不可替代的作用[41]。在豆類(lèi)作物病原細(xì)菌P.syringaepv.phaseolicola1448A、P.syringaepv.syringaeB728a和番茄病原細(xì)菌P.syringaepv.tomatoDC3000中，RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體MexAB-OprM對(duì)化合物（如抗生素、植物源抗菌素、洗滌劑和染料等）有著非常高的耐受力。該蛋白復(fù)合體還參與細(xì)菌在植物體內(nèi)的繁殖過(guò)程[42]。P.syringaepv.syringae染色體基因編碼的PseABC家族是其合成丁香毒素和丁香肽等毒素不可缺少的，pseC基因的缺失會(huì)減少植物毒素的合成和分泌量[43]。Vargas P等研究發(fā)現(xiàn)，番茄植株分泌的黃酮類(lèi)物質(zhì)可誘導(dǎo)丁香假單胞番茄致病變種P.syringaepv.tomato菌株P(guān)meR蛋白的過(guò)表達(dá)，過(guò)表達(dá)的PmeR可抑制Mex-AB-OprM外排系統(tǒng)。PmeR和MexAB-OprM構(gòu)成的互作系統(tǒng)，與菌株P(guān).syringaepv.tomato在番茄植株上的定殖密切相關(guān)[44]。對(duì)丁香假單胞煙草致病變種P.syringaepv.tabaci鞭毛蛋白FliC的研究表明，ΔfliC較野生型菌株致病力和運(yùn)動(dòng)性都顯著降低，但是mexEFoprN（RND外排系統(tǒng)編碼基因）基因的表達(dá)量急劇上升。IV型菌毛（T4P）缺陷型突變體ΔpilA，其菌株富集能力及對(duì)煙草的致病力明顯減弱，參與其多耐藥外排泵MEX的相關(guān)基因mexABoprM的表達(dá)量明顯上升[45]?？梢?jiàn)RND外排泵不僅在逆境適應(yīng)、有害物質(zhì)外排等方面有重要的作用，而且在P.syringae中與細(xì)菌的侵染力也密切相關(guān)。

E.chrysanthemi具有2個(gè)AcrAB外排系統(tǒng)，它們不僅可以幫助細(xì)菌抵抗菊苣分泌的抗菌肽硫素，而且輔助細(xì)菌定殖菊苣葉片，引起病害[46]。有研究認(rèn)為E.chrysanthemi侵染植物，導(dǎo)致寄主植物水楊酸等抗菌物質(zhì)分泌增多，而這些有毒的抗菌物質(zhì)正好激活了細(xì)菌多耐藥外排泵編碼基因的表達(dá)，提高了細(xì)菌的侵染成活率[47]。該菌株中tolC編碼51kDa的蛋白與E.coli中TolC蛋白同源性高達(dá)70%。tolC基因缺失突變體不能外排鹽酸小檗堿；突變體在寄主植物內(nèi)可以存活，但生長(zhǎng)較慢，不足以造成病害[11]。Brown等通過(guò)對(duì)青枯菌（R.solanacearum）多耐藥外排泵相關(guān)基因acrA和dinF的功能研究發(fā)現(xiàn)缺失突變株對(duì)抗生素、植物毒素和洗滌劑的耐受性明顯低于野生菌株；對(duì)番茄植株侵染力相對(duì)較弱。這一結(jié)果也證實(shí)了RND外排泵在瓜菜病原細(xì)菌中具有雙重作用[48]。

梨火疫病菌（E.amylovora）主要侵染薔薇科作物。在侵染初期，病原細(xì)菌會(huì)暴露在植物體表面，并被植物分泌的大量抗菌素包圍。染料木黃酮是豆科作物或者非豆科作物分泌的異黃酮類(lèi)抗菌素[49-50]，是植物抗毒素Phytoalexins和Phytoanticipins路徑合成抗菌素的前體[51-52]。Burse A等發(fā)現(xiàn)薔薇科分泌的異黃酮類(lèi)抗菌素可誘導(dǎo)E.amylovora中外排泵編碼基因acrAB的大量表達(dá)。acrB缺失突變株致病力降低，對(duì)于果樹(shù)分泌的抗菌素變得敏感[53]。這與Al-Karablieh N等的研究結(jié)果不符。Al-Karablieh N等發(fā)現(xiàn)，E.amylovora基因tolC和acrB/tolC的缺失突變體對(duì)植物分泌的抗菌素及一些合成的抗菌劑較野生型敏感，而acrB缺失突變株對(duì)相關(guān)抗生素并不敏感。另外tolC和acrB/tolC缺失突變株的毒力并沒(méi)有降低，TolC可能通過(guò)與AcrAB的互作來(lái)保持植物體表面毒素的平衡，以輔助E.amylovora突破植物表層保護(hù)組織[54]。在AcrB外排泵缺失的突變株中，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MdtABC和MdtUVW，可以使E.amylovora對(duì)黃酮類(lèi)、梭鏈孢酸和新生霉素產(chǎn)生耐受性。MdtABC介導(dǎo)E.amylovora對(duì)膽鹽、硝酸鹽的抗性，其表達(dá)受雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)BaeSR的調(diào)節(jié)；MdtUVW介導(dǎo)其對(duì)克霉唑的耐受性。MdtABC和MdtUVW的缺失也會(huì)阻礙細(xì)菌對(duì)寄主植物的侵染[55]。他們還證明了外排蛋白NorM在E.amylovora侵染植株花器官時(shí)，可以與花柱上寄生的分泌抗菌素類(lèi)物質(zhì)的泛菌屬競(jìng)爭(zhēng)空間和營(yíng)養(yǎng)，幫助E.amylovora完成侵染。而norM基因缺失突變株的毒力并沒(méi)有降低，自然條件下致病力卻下降[56]。

有關(guān)植物病原細(xì)菌銅制劑耐受性的研究較多，但是大都集中在對(duì)Cop系統(tǒng)的研究，有關(guān)Cus系統(tǒng)的研究相對(duì)較少[57-60]。Gutiérrez-Barranquero等通過(guò)對(duì)P.syringae全基因組信息的分析發(fā)現(xiàn)P.syringae的銅耐受性是由CopG、CusCBA和CopABCD操縱子協(xié)同作用完成的[61]。另外，劉星等驗(yàn)證了Acidovorax citrulliRND外排泵相關(guān)基因cusB與Acidovorax citrulli菌株的銅耐受性密切相關(guān)。cusB缺失突變株較野生型對(duì)銅制劑更加敏感，但不影響致病力[62]。

3 外排泵抑制劑的開(kāi)發(fā)

外排泵抑制劑（EPIs）是一類(lèi)抑制細(xì)菌外排泵功能的藥物。利用它可使低濃度的抗生素起到較高的抗菌效果，同時(shí)減少細(xì)菌耐藥性的發(fā)生。它還可以抑制生物膜的形成，降低病原菌的毒力。EPIs的研究與應(yīng)用對(duì)于瓜菜細(xì)菌性病害的防治意義重大，但是相關(guān)研究難度較大。在實(shí)驗(yàn)室條件下，有效的EPIs已經(jīng)有不少報(bào)道，但是目前還沒(méi)有可以應(yīng)用于實(shí)踐的EPIs。

3.1 RND EPIs選取原則

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中EPIs必須具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：第一，能促進(jìn)細(xì)菌外排泵相關(guān)基因的表達(dá)；第二，藥劑本身對(duì)細(xì)胞無(wú)損害；第三，在其發(fā)揮作用的同時(shí)不影響質(zhì)子的跨膜運(yùn)輸；第四，不能增加非外排抗生素的活性；第五，不能影響抗生素的活性。這些限制因素使得實(shí)際篩選EPIs時(shí)困難重重。例如，對(duì)細(xì)菌能量平衡影響較大的羰基氰氯苯腙（CCCP）可作為一種抑制細(xì)菌外排泵的化合物。然而，該類(lèi)化合物嚴(yán)重消耗了細(xì)菌膜質(zhì)子動(dòng)力，從而導(dǎo)致了細(xì)菌的死亡[63]。再如，外排泵調(diào)控基因有很多，而且調(diào)控功能多且復(fù)雜，很難通過(guò)對(duì)一種或者一類(lèi)調(diào)控基因的抑制作用深入解析其抑制外排泵的分子機(jī)制，同時(shí)，在理論研究上，對(duì)于大部分調(diào)控基因的作用機(jī)制尚不明確，加大了研究難度。

3.2 研究較多的EPIs

目前研究較多的2類(lèi)EPIs包括肽類(lèi)EPIs和吡啶并嘧啶類(lèi)EPIs，它們也是最具代表性的2類(lèi)EPIs。

3.2.1 肽類(lèi)EPIs PAβN（苯丙氨酸-精氨酸-氨酸萘酰胺，起初稱(chēng)為MC-207，110），英文全稱(chēng)phenylalanyl arginyl β-naphthylamide，是研究最早最有價(jià)值的一種EPI[64]，其結(jié)構(gòu)如圖4。Renau等通過(guò)對(duì)Pseudomonas aeruginosa中 MexAB、MexCD 和 Mex-EF基因過(guò)表達(dá)，從200 000個(gè)可增強(qiáng)P.aeruginosa菌株敏感性的小分子EPIs中篩選得到了該化合物[65]。PAβN作為外排泵的結(jié)合底物，與抗生素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合區(qū)域[66]，提高細(xì)胞內(nèi)抗生素濃度，從而達(dá)到抑制抗生素外排的作用。作為一種廣譜性的EPIs，它還可以使結(jié)構(gòu)不同的抗生素如氟喹諾酮類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、惡唑烷酮類(lèi)、氯霉素和利福平等抗生素恢復(fù)生物活性，但不能恢復(fù)β內(nèi)酰胺以及氨基糖苷類(lèi)抗生素活性[64]。這類(lèi)化合物最突出的優(yōu)點(diǎn)在于，它很難使細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。但是該類(lèi)化合物的親和力較差，必須當(dāng)?shù)孜餄舛确e累到一定程度才能發(fā)揮作用[67]。此類(lèi)化合物會(huì)阻礙細(xì)胞膜的功能，對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性[68]，這限制了其應(yīng)用前景。然而PAβN衍生物如MC-04，124，在細(xì)胞液中的穩(wěn)定性高，且毒性很小，同時(shí)不會(huì)使外排泵的調(diào)控基因表達(dá)過(guò)高[69]。

圖4 兩類(lèi)抗生素的分子式[64]

3.2.2 吡啶并嘧啶類(lèi) EPIs-ABI-PP（D13-9001）D13-9001（圖4）是與RND外排泵作用過(guò)程研究最清楚的一類(lèi)EPIs。其作用機(jī)制是D13-9001與AcrB、MexB的疏水端結(jié)合，影響AcrB/MexB的空間結(jié)構(gòu)的改變，破壞底物與AcrB/MexB末端的運(yùn)輸通道造成外排泵功能故障，藥物在細(xì)菌體內(nèi)積累，進(jìn)而達(dá)到抑制外排的效果[70]。D13-9001的親水端存在于細(xì)菌外排泵的通道，可能阻礙底物與外排泵在這一區(qū)域的結(jié)合。

與肽類(lèi) EPIs-PAβN相比，吡啶并嘧啶類(lèi)EPIs-ABI-PP安全低毒或無(wú)毒、水溶性好、藥效突出[71]，具有較大的應(yīng)用前景。它可以特異性地抑制AcrAB-TolC和MexAB-OprM外排泵，但是對(duì)MexXY-OprM外排泵沒(méi)有抑制效果[72]，這也是它沒(méi)能應(yīng)用于實(shí)踐中的主要原因。

4 展望

外排泵廣泛存在于瓜類(lèi)和蔬菜作物病原細(xì)菌中，在細(xì)菌抵抗外界脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前有關(guān)RND外排泵結(jié)構(gòu)與功能、外排抑制劑等的研究已取得很大的進(jìn)展。植物病原細(xì)菌P.syringae，A.tumefaciens，Rhizobium etli和Bradyrhizobium japonicum中相關(guān)多耐藥RND外排泵的研究已見(jiàn)報(bào)道，但相關(guān)機(jī)制并不清楚[73-75]。

RND多耐藥外排泵是細(xì)胞代謝的外排結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞代謝中具有重要作用。在正常的細(xì)菌體內(nèi)，RND外排泵相關(guān)基因的表達(dá)應(yīng)該有特定的生理調(diào)節(jié)方式，對(duì)這一調(diào)控體系的研究有助于我們了解細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制。另外，有關(guān)植物分泌物對(duì)病原細(xì)菌的吸引導(dǎo)致病害發(fā)生的研究甚多[76]。然而，病原細(xì)菌RND多耐藥外排泵對(duì)植物分泌物的響應(yīng)機(jī)制的研究，可以說(shuō)還是一個(gè)未開(kāi)發(fā)的領(lǐng)域。已經(jīng)有研究證明，細(xì)菌RND外排泵直接參與細(xì)菌有毒物質(zhì)的外排[77]，植物分泌的抗菌素類(lèi)外排底物或許可以作為生物源藥劑，通過(guò)化學(xué)合成其類(lèi)似物并用于對(duì)細(xì)菌的防治。針對(duì)RND多耐藥外排泵在病原細(xì)菌/植物互作中的重要作用的研究，也將給我們對(duì)細(xì)菌致病機(jī)制、入侵手段、植物防御特點(diǎn)等的研究提供思路。

綜上所述，系統(tǒng)研究植物病原細(xì)菌RND多耐藥外排泵對(duì)病原細(xì)菌的科學(xué)防治具有重大意義。相信隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，對(duì)于外排泵的研究會(huì)更加的深入，這也將會(huì)給瓜菜細(xì)菌性病害的防治提供新的更好的措施。