徐　飛,　楊共強(qiáng),　王俊美,　宋玉立,　田懷芹

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州　450002)

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DON毒素在小麥赤霉病抗感品種麥穗組織中的積累分析

徐飛,楊共強(qiáng),王俊美,宋玉立*,田懷芹

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州450002)

本研究采用單小花滴注和噴霧接種方法對(duì)3個(gè)抗病品種(‘望水白’、‘蘇麥3號(hào)’、‘揚(yáng)麥16’)和3個(gè)感病品種(‘周麥18’、‘矮抗58’、‘豫保1號(hào)’)的赤霉病抗性進(jìn)行分析,并用ELISA測(cè)定了籽粒、穎殼和穗軸中的DON毒素水平。結(jié)果表明:兩種方法接種后第20天,除‘望水白’外,抗病品種的病級(jí)日擴(kuò)展速率和病小穗率都顯著低于感病品種(P<0.05);單小花滴注接種條件下,除‘周麥18’的籽粒和‘矮抗58’的穗軸外,抗病品種的籽粒、穎殼、穗軸中的DON毒素含量顯著低于感病品種的籽粒、穎殼、穗軸中的DON毒素含量(P<0.05);而噴霧接種條件下,抗病品種與感病品種的籽粒、穎殼中的DON毒素含量差異不顯著,而穗軸中的DON毒素含量差異顯著(P<0.05)。除個(gè)別情況外,6個(gè)品種中,籽粒中DON毒素水平<穎殼中DON毒素水平<穗軸中DON毒素水平(P<0.05)。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;小麥品種;赤霉病

小麥赤霉病(Fusariumheadblight，F(xiàn)HB)是由禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearumSchwabe)引起的小麥上的重要真菌病害,在北美洲、歐洲和亞洲廣泛流行[1]。我國(guó)19世紀(jì)中后期,小麥赤霉病在長(zhǎng)江中下游麥區(qū)和東北春麥區(qū)普遍發(fā)生,在黃淮海麥區(qū)和北方冬春麥區(qū)僅零星發(fā)生。其中黃淮海麥區(qū)是我國(guó)冬小麥主要種植區(qū)[2]。但近年來(lái),小麥赤霉病在黃淮海麥區(qū)也流行成災(zāi)。小麥赤霉病不僅使小麥產(chǎn)量損失10%～50%,而且病菌產(chǎn)生真菌毒素污染籽粒,危害人畜健康[2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的一種主要毒素,也稱(chēng)嘔吐毒素。培育和利用抗赤霉病和DON毒素積累的品種是防治小麥赤霉病、減輕DON毒素危害最為經(jīng)濟(jì)、有效和安全的措施[2]。

小麥對(duì)赤霉病的抗性包括抗侵染、抗擴(kuò)展、抗DON毒素積累和抗籽粒侵染?！住ⅰK麥3號(hào)’和‘揚(yáng)麥16’是小麥抗赤霉病育種中常用的抗源材料[3]。前人對(duì)其抗侵染和抗擴(kuò)展能力的研究較多[4],對(duì)發(fā)病籽粒中DON積累水平也有報(bào)道[5],但是對(duì)麥穗組織抗DON積累能力了解較少。本研究旨在明確小麥赤霉病抗性品種和感病品種在兩種接種方法下籽粒、穎殼以及穗軸中DON毒素積累水平,以及DON毒素水平與病程曲線下的面積(AUDPC)和病粒率之間的關(guān)系,為病害控制提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

供試小麥品種共6個(gè),其中3個(gè)抗病品種:‘望水白’、‘蘇麥3號(hào)’和‘揚(yáng)麥16’;3個(gè)感病品種:‘周麥18’、‘矮抗58’和‘豫保1號(hào)’。均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所小麥病害研究組提供。

供試菌株:6株禾谷鐮刀菌菌株(FX3-1-4、FX3-2-6、FX4-2-3、FX4-3-4、JZ2-1-4和XH1-3-11)由本研究組提供,并于前期工作中鑒定出其毒素化學(xué)型均為15ADON,菌株從田間的小麥赤霉病病穗上分離并進(jìn)行單孢純化,PDA試管保存于4℃的冰箱中。

1.2方法

1.2.1田間種植

于2012年10月在河南省焦作市溫縣黃莊鎮(zhèn)西虢村金地種業(yè)有限公司種植基地將供試6個(gè)小麥品種分別播種,每品種5行,行長(zhǎng) 1.0m,行距0.3m,每行播10g,按常規(guī)措施進(jìn)行田間管理。

1.2.2禾谷鐮刀菌混合分生孢子懸浮液的制備

將4℃保存的禾谷鐮刀菌菌株在新鮮的PDA平板上活化,25℃黑暗條件下培養(yǎng)3d,打取10塊(5mm)邊緣菌絲塊轉(zhuǎn)接到150mL的羧甲基纖維素酯液體培養(yǎng)基(CMC)中,置于恒溫?fù)u床上,25℃ 150r/min搖培5d,每個(gè)菌株2瓶(培養(yǎng)基用量150mL/瓶)。分別將供試菌株的分生孢子懸浮液用雙重紗布過(guò)濾,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),用無(wú)菌水調(diào)整分生孢子濃度為5×105個(gè)/mL用于田間接種,然后將6個(gè)菌株的分生孢子懸浮液等體積混合。單小花滴注接種和噴霧接種使用的分生孢子懸浮液濃度分別為5×105個(gè)/mL和5×104個(gè)/mL。

1.2.3田間接種和病害調(diào)查

于小麥揚(yáng)花初期(2013年5月3日),分別采用單小花滴注法和噴霧法接種。單小花滴注法采用剪刀剪去麥穗中部小穗的內(nèi)外穎殼頂部少許,滴入20μL鐮刀菌分生孢子懸浮液,每個(gè)麥穗接種1個(gè)小穗,每個(gè)品種接種15穗,5穗為1組,分別套透明塑料袋保濕并記錄接種后的天氣情況,3d后去掉保濕袋,于接種后第10天和第20天,參照徐雍皋等[6]的方法記錄每穗的病級(jí),計(jì)算各品種的病級(jí)日擴(kuò)展速率和AUDPC：

式中，y10和y20分別表示接種后第10天和第20天的病級(jí)。

噴霧法接種采用禾谷鐮刀菌分生孢子懸浮液噴霧,每平方米噴霧50mL,每個(gè)品種接種15穗,5穗為1組,分別套透明塑料袋保濕,于接種后第10天和第20天記錄每穗的病小穗數(shù)和總小穗數(shù),并計(jì)算病小穗率和AUDPC：

式中，y10和y20分別表示接種后第10天和第20天的病小穗率。

小麥成熟后,將兩個(gè)接種方法每個(gè)處理的病穗分別裝入網(wǎng)袋,晾干后4 °C冰箱中保存。進(jìn)行麥穗組織的DON毒素含量測(cè)定前剝出病穗中小麥籽粒,并記錄病粒數(shù)和總粒數(shù),計(jì)算病粒率：

1.2.4DON毒素含量的測(cè)定和分析方法

將不同接種方法接種后收獲的病穗中小麥籽粒剝出,在微型植物粉碎機(jī)中按籽粒、穎殼、穗軸分別研磨,過(guò)20目篩后裝入不同的自封袋中備用。每個(gè)樣品粉碎后,嚴(yán)格清理粉碎機(jī)以避免相互污染。稱(chēng)取樣品粉末置于50mL離心管中,加入5倍質(zhì)量的蒸餾水,用力振蕩3min并使用WhatmanNo.1濾紙過(guò)濾,收集濾液,然后稀釋10、100、1 000和10 000倍備用。

使用RIDASCREEN?DON酶聯(lián)免疫法嘔吐毒素定量檢測(cè)試劑盒(R-Biopharm,購(gòu)于北京科明雷德科技有限公司)檢測(cè)樣品中DON毒素,操作步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為0、3.7、11.1、33.3、100μg/L。在酶標(biāo)儀上同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品在450nm處的吸光度,每個(gè)樣品測(cè)定3次重復(fù)。當(dāng)濾液中DON毒素濃度過(guò)大或者過(guò)小而超出檢測(cè)范圍時(shí),使用其不同倍數(shù)的稀釋液。

使用R-Biopharm(德國(guó)拜發(fā)公司)的應(yīng)用軟件RIDA?SOFTWin(Z9999)進(jìn)行結(jié)果評(píng)估。并按照單次檢測(cè)的Logit/log曲線進(jìn)行分析,然后計(jì)算3次檢測(cè)結(jié)果的平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1不同小麥品種(系)對(duì)赤霉病的抗性

單小花滴注接種谷鐮刀菌后第10天和第20天,3個(gè)抗性品種的平均病級(jí)日擴(kuò)展速率為0.09和0.22, 3個(gè)感病品種的平均病級(jí)日擴(kuò)展速率為0.18和0.36,除‘望水白’外,抗病品種與感病品種的病級(jí)日擴(kuò)展速率和AUDPC都有顯著差異(P<0.05)(表1)。噴霧接種后第10天和第20天,3個(gè)抗性品種的平均病小穗率為14.35%和29.23%,3個(gè)感病品種的平均病小穗率為32.52%和77.33%,接種10d后,抗病品種和感病品種的病小穗率差異不顯著;接種20d后,除‘望水白’外,抗病品種與感病品種的病小穗率和AUDPC都有顯著差異(P<0.05)(表2)。單小花滴注接種后,3個(gè)抗性品種的平均病粒率為9.98%,3個(gè)感病品種的平均病粒率為23.91%,3個(gè)抗性品種的病粒率顯著低于感病品種‘矮抗58’的病粒率(P<0.05),而與感病品種‘周麥18’和‘豫保1號(hào)’的病粒率差異不顯著(表1)。噴霧接種后,3個(gè)抗性品種的平均病粒率為8.11%,3個(gè)感病品種的平均病粒率為30.49%,除‘望水白’外,抗性品種的病粒率顯著低于感病品種的病粒率(P<0.05)(表2)。

表1　單小花滴注接種后不同小麥品種赤霉病抗性指標(biāo)和麥穗組織中DON毒素水平1)Table 1　Fusarium head blight (FHB) resistance indexes and deoxynivalenol (DON)levels ofselected wheat cultivars based on the single-spikelet drip inoculation

1) 表中同列數(shù)據(jù)后具有相同小寫(xiě)字母表示不同小麥品種所測(cè)指標(biāo)差異不顯著(P>0.05),同行數(shù)據(jù)后具有不同大寫(xiě)字母表示同一小麥品種的不同組織間的指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。AUDPC表示病程曲線下的面積。病粒率表示發(fā)病籽粒占總粒數(shù)的比例。下同。

Thesamelowercaselettersinthesamecolumnsindicatenosignificantdifference(P>0.05)accordingtoFisher’sProtectedLeastSignificantDifferenceTest.Differentuppercaselettersinthesamerowindicatesignificantdifferencebetweentissuesofthesamecultivar.AUDPCistheareaunderFHBprogresscurve.PSKisthepercentageofscabbedkernels.Thesamebelow.

表2　噴霧接種后不同小麥品種赤霉病抗性指標(biāo)和麥穗組織中DON毒素水平Table 2　Fusarium head blight (FHB) resistance indexes and deoxynivalenol (DON)levels ofselected wheat cultivars based on spray inoculation

2.2不同抗感小麥品種(系)籽粒、穎殼、穗軸中DON毒素含量

單小花滴注接種后,3個(gè)抗性品種的籽粒、穎殼、穗軸中的DON毒素含量平均值分別為1.59、11.89、35.78mg/kg,3個(gè)感病品種的籽粒、穎殼、穗軸中的DON毒素含量平均值分別為22.14、41.95、66.87mg/kg(表1)。抗病品種籽粒中DON毒素含量顯著低于除‘周麥18’外其他2個(gè)感病品種籽粒中DON毒素含量(P<0.05);抗病品種穎殼中DON毒素含量顯著低于感病品種穎殼中DON毒素含量(P<0.05);抗病品種穗軸中DON毒素含量顯著低于除‘矮抗58’外其他2個(gè)感病品種穗軸中DON毒素含量(P<0.05)。

噴霧接種后,3個(gè)抗性品種的籽粒、穎殼、穗軸中的DON毒素含量平均值分別為1.92、8.02、12.59mg/kg,3個(gè)感病品種的籽粒、穎殼、穗軸中的DON毒素含量平均值分別為15.87、62.02、155.20mg/kg(表2)。3個(gè)抗病品種與3個(gè)感病品種的籽粒、穎殼中的DON毒素含量差異不顯著,而穗軸中的DON毒素含量差異顯著(P<0.05)。

另外,除噴霧接種后的‘望水白’、單小花滴注接種后的‘矮抗58’和‘豫保1號(hào)’外,抗性品種和感病品種籽粒中DON毒素含量<穎殼中DON毒素含量<穗軸中DON毒素含量(P<0.05)(表1～2)。

2.3DON毒素水平與AUDPC、病粒率間的關(guān)系

單小花滴注接種后,籽粒的DON含量與AUDPC的相關(guān)性系數(shù)為0.84(P<0.05),呈顯著正相關(guān),與病粒率不相關(guān)(P>0.05);穗軸和穎殼中DON含量與AUDPC和病粒率不相關(guān)(P>0.05)。噴霧接種條件下,籽粒、穎殼和穗軸中的DON含量與AUDPC和病粒率不相關(guān)(P>0.05)。

3　討論

本研究評(píng)價(jià)了單小花滴注和噴霧法兩種接種方法下,3個(gè)抗病品種和3個(gè)感病品種對(duì)赤霉病的抗性,并測(cè)定了麥穗不同組織中的DON含量,結(jié)果表明:(1)兩種方法接種后第20天,除‘望水白’外,抗病品種的病級(jí)日擴(kuò)展速率和病小穗率都顯著低于感病品種(P<0.05),此結(jié)果與封薇等[5]報(bào)道的小麥品種抗病性與赤霉病發(fā)病程度有明顯的正相關(guān)的結(jié)論相同。其中‘望水白’在本試驗(yàn)中的病級(jí)日擴(kuò)展速率和病小穗率與感病品種沒(méi)有顯著性差異,與前人研究結(jié)果不相同[5,7],原因可能是與試驗(yàn)所用菌株、接種物濃度和接種后氣候條件不一樣造成。(2)單小花滴注接種后,除‘周麥18’的籽粒和‘矮抗58’的穗軸外,抗病品種的籽粒、穎殼、穗軸中的DON毒素含量顯著低于感病品種的籽粒、穎殼、穗軸中的DON毒素含量(P<0.05),其中籽粒中DON含量與AUDPC呈顯著正相關(guān),此結(jié)果與徐飛等[8]的研究結(jié)果相同。但是噴霧接種后,抗病品種與感病品種的籽粒、穎殼中的DON毒素含量差異不顯著,而穗軸中的DON毒素含量差異顯著(P<0.05)。結(jié)果說(shuō)明小麥品種的抗DON毒素積累能力受到不同接種方法的影響。(3)‘蘇麥3號(hào)’抗擴(kuò)展能力最強(qiáng),作為親本使用最為廣泛[9];‘望水白’與‘蘇麥3號(hào)’赤霉病抗性和抗DON積累能力沒(méi)有顯著差異(P>0.05),但是‘望水白’作為親本,后代農(nóng)藝性狀差,所以至今還未育出大面積生產(chǎn)應(yīng)用的抗赤霉病的小麥新品種。‘揚(yáng)麥16’抗擴(kuò)展能力與‘蘇麥3號(hào)’相當(dāng),在噴霧接種后10d和20d的病小穗率以及AUDPC最低(表2),抗病性較強(qiáng),且農(nóng)藝性狀好,可以作為抗侵染和抗DON毒素積累的抗源材料。

另外,本研究表明:除噴霧接種條件下的‘望水白’、單小花滴注接種條件下的‘矮抗58’和‘豫保1號(hào)’外,穗軸中DON毒素水平>穎殼中DON毒素水平>籽粒中DON毒素水平(P<0.05),兩種接種方法結(jié)果一致,與Sinha等[10]對(duì)自然發(fā)病病穗的研究結(jié)果相同。

籽粒中的DON毒素積累少有兩個(gè)原因：(1)籽粒形成過(guò)程中小麥植株產(chǎn)生降解DON的酶類(lèi);(2)在籽粒形成過(guò)程中,DON毒素轉(zhuǎn)移至籽粒的效率低[3]。因此要研究不同小麥品種抗DON積累的原因,需要從上述兩個(gè)方面進(jìn)行分析,并選擇合適的接種方法。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Concentrationsofdeoxynivalenolinvarioustissuesofwheatheadsinresistantandsusceptiblevarieties

XuFei,YangGongqiang,WangJunmei,SongYuli,TianHuaiqin

(InstituteofPlantProtection,HenanAcademyofAgriculturalSciences，KeyLaboratoryofCropIntegratedPestManagementoftheSouthernofNorthChina,MinistryofAgricultureofthePeople’sRepublicofChina,Zhengzhou450002,China)

TheFHBresistanceofthreeresistantandthreesusceptiblevarietieswereinvestigatedbysingleflowerdripinoculationandsprayinoculationunderfieldconditions,andELISAwasappliedtoevaluatetheconcentrationofdeoxynivalenolinvarioustissuesofwheatheads.Theresultsshowedthatdailyspreadingrateofdiseasedegreeandpercentageofinfectedspikeletsinresistantvarietieswereobviouslylowerthanthoseinsusceptibleones(P< 0.05),except‘Wangshuibai’.DONlevelsofkernels,chaffandrachisinresistantvarietieswerealsoobviouslylowerthanthatinsusceptibleones(P< 0.05)bysingleflowerdripinoculation,exceptkernelsin‘Zhoumai18’andrachisin‘Aikang58’.ButtherewasnosignificantdifferenceinDONlevelsinkernelsandchaffamongresistantandsusceptiblevarietiesbysprayinoculation,exceptforrachis(P< 0.05).TheconcentrationofDONwashighestintherachis,followedbychaff,andthenkernels(P< 0.05).

deoxynivalenol;wheatcultivar;Fusariumheadblight

2014-12-16

2015-01-29

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303016)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAD16B07)；河南省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(S2010-01-05)

E-mail:songyuli2000@126.com

S435.121

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.022