孔祥久,　石　潔,　孔繁芳,　王忠躍,　張　昊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京　100193)

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葡萄霜霉菌候選效應(yīng)子RXLR5信號(hào)肽的鑒定

孔祥久,石潔,孔繁芳,王忠躍*,張昊*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100193)

利用Getorf、 SignalP 3.0、BLASTP等生物信息學(xué)軟件和PERL語(yǔ)言從葡萄霜霉菌基因組中預(yù)測(cè)到一條編碼RXLR-EER結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)蛋白候選基因,將該基因編碼的蛋白命名為RXLR5。將RXLR5信號(hào)肽SP5編碼序列連接到pSUC2T7M13ORI載體并轉(zhuǎn)化到酵母蔗糖酶缺陷菌株YTK12后,重組菌株能成功分泌蔗糖酶,促使棉籽糖分解成單糖,因此,能在YPRAA培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng);同時(shí)生成的單糖能與TTC反應(yīng)產(chǎn)生紅色不溶于水的氯化三苯基四氮唑。由此推測(cè),SP5具有信號(hào)肽活性,可能在RXLR5從葡萄霜霉菌細(xì)胞內(nèi)泌到胞外的過程中起重要作用。

葡萄霜霉病菌;信號(hào)肽;酵母分泌系統(tǒng);蔗糖酶活性

葡萄霜霉病是影響全球葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的第一大病害。葡萄霜霉菌[Plasmoparaviticola(Berk.etCurt.) Berl.etde Toni]是葡萄霜霉病的病原菌,屬于鞭毛菌亞門、卵菌綱、霜霉目、霜霉科、單軸霉屬,是一種專性寄生卵菌,該病原菌可以侵染葡萄的任何綠色部分或組織,從而造成果實(shí)產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低等現(xiàn)象[1]。葡萄霜霉病造成的損失巨大,流行年份可高達(dá)20%～80%[2-3],嚴(yán)重時(shí)幾乎顆粒無收[4-5]。探索葡萄霜霉病菌與葡萄的互作關(guān)系,可以為葡萄霜霉病防控提供其他可行途徑。

植物病原真菌或卵菌在與寄主植物相互作用時(shí)分泌多種不同的效應(yīng)蛋白進(jìn)入寄主植物細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi),通過抑制寄主的防御反應(yīng)促使自身在寄主植物上定殖、生長(zhǎng)和發(fā)育[7-8]。植物病原卵菌編碼一大類被稱為 RXLR(Arg-X-Leu-Arg)的效應(yīng)蛋白,這類效應(yīng)蛋白的N端1～30個(gè)氨基酸處含有一段信號(hào)肽序列,負(fù)責(zé)效應(yīng)蛋白的泌出,在30～60個(gè)氨基酸處含有保守的 RXLR-dEER 結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)效應(yīng)蛋白進(jìn)入寄主植物組織,因此將其稱為 RXLR 效應(yīng)蛋白[9]。目前,已有多個(gè)卵菌的無毒基因被克隆并鑒定,如大豆疫霉(Phytophthorasojae)效應(yīng)蛋白 Avr1a[10]、 Avr1b[11]、Avr1c[10]和Avr1d[12];致病疫霉(Phytophthorainfestans)效應(yīng)蛋白Avr3a[13];擬南芥霜霉(Hyaloperonosporaparasitica)效應(yīng)蛋白ATR1[14]和 ATR13[15];黃瓜霜霉(Pseudoperonosporacubensis)效應(yīng)蛋白PcQNE[16]等,但是,目前葡萄霜霉菌的致病機(jī)理相關(guān)報(bào)道還很少,其與葡萄之間的相互識(shí)別機(jī)制也并不明確。本研究旨在將植物病原卵菌效應(yīng)蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)和鑒定方法用于葡萄霜霉菌效應(yīng)蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和鑒定,并證實(shí)該方法是否可行,從分子水平加深對(duì)葡萄霜霉菌-葡萄互作的認(rèn)識(shí),為新防治策略的研發(fā)及抗病葡萄新品種的培育提供理論支撐。

1　材料與方法

1.1病原體的分離、接種、擴(kuò)繁

供試葡萄霜霉菌(Plasmoparaviticola)采自河北廊坊中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地‘紅地球’葡萄品種。發(fā)病葉片在潮濕的容器中過夜培養(yǎng),然后用無菌水洗脫收集孢子囊。將孢子囊懸浮液涂到3%水瓊脂培養(yǎng)基上,在顯微鏡下將含單孢子囊的瓊脂塊倒扣在葉盤上促使侵染。供試葡萄品種為‘里扎馬特’,生長(zhǎng)條件為25℃,L∥D=16 h∥8 h。接種5～7 d后,從單孢子囊侵染的葉片組織收集孢子囊配成懸浮液(105孢子囊/mL)進(jìn)行后續(xù)接種擴(kuò)繁。接種的葉盤先在21℃、相對(duì)濕度約100%的黑暗條件下處理24 h,再將其置于21℃、相對(duì)濕度約100%、L∥D=16 h∥8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2可能的RXLR效應(yīng)蛋白的預(yù)測(cè)

根據(jù)葡萄霜霉菌基因組信息,利用生物信息學(xué)軟件EMBOSS(6.4.0.0)軟件包中的Getorf軟件分析可能的開放閱讀框(ORF);用SignalP 3.0軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽,采用隱馬爾可夫模型,要求信號(hào)肽的可能性≥0.9,信號(hào)肽的最大剪切位點(diǎn)位于10～30個(gè)氨基酸處;用PERL語(yǔ)言編程分析序列中30～60個(gè)氨基酸處是否含有RXLR序列,RXLR序列下游是否含EER序列[17]。按照上述步驟找到了一條可能的編碼RXLR-EER效應(yīng)蛋白的基因,將該基因編碼的蛋白命名為RXLR5。

1.3葡萄霜霉菌基因組DNA的提取及RXLR5基因的克隆

PCR反應(yīng)體系(20 μL):基因組DNA模板1 μL,10 μmol/L引物R5F和R5R各1 μL,2×Premix PrimeSTAR HS Mix 10 μL,滅菌ddH2O 7 μL。

PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min 50 s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,采用ExnaseTMⅡ重組酶(Vazyme, USA)與CE Entry Vector連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,陽(yáng)性菌落采用通用引物M13-47/M13-48進(jìn)行PCR鑒定,最后將篩選得到的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4pSUC2T7M13ORI-SP5重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

PCR反應(yīng)體系(20 μL):基因組DNA模板1 μL,10 μmol/L的引物各1 μL,2×Premix PrimeSTAR HS Mix10 μL,滅菌ddH2O 7 μL。

PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸15 s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

采用Frozen-EZ Yeast Transformation II kitTM(Zymo Research, Orange, CA, U.S.A.)將構(gòu)建好的載體pSUC2-SP5、陰性對(duì)照載體pSUC2-Mg87[19]、陽(yáng)性對(duì)照載體pSUC2-Avr1b[20]分別轉(zhuǎn)化到SUC2缺乏的酵母菌株 YTK12中。在CMD-W 培養(yǎng)基(0.67%不含氨基酸的酵母氮源、 0.075% tryptophan dropout supplement、2%蔗糖、0.1% 葡萄糖和2% 瓊脂[18])上培養(yǎng)2～4 d來篩選轉(zhuǎn)化子。

圖1　酵母信號(hào)序列誘捕載體pSUC2T7M13ORI[18]Fig.1　The yeast signal sequence trap vector, pSUC2T7M13ORI

1.5對(duì)二糖利用能力鑒定

將轉(zhuǎn)化子畫線到含棉籽糖的YPRAA培養(yǎng)基(1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 棉籽糖、2 μg/L

的抗霉素A、2% 瓊脂)上,通過觀察酵母菌對(duì)棉籽糖的利用情況來驗(yàn)證SP5的功能。同時(shí)將轉(zhuǎn)化子畫線到Y(jié)PDA(1%酵母、2%蛋白胨、 2% 葡萄糖、0.003%硫酸腺嘌呤和2%瓊脂[18])和CMD-W培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.6TTC顯色鑒定

按Oh等[21]的方法,用TTC檢測(cè)分泌的蔗糖酶的活性。具體步驟如下,在含5 mL CMD-W 液體培養(yǎng)基的離心管中接種轉(zhuǎn)化的酵母菌株pSUC2-SP5、pSUC2-Mg87、pSUC2-Avr1b,在YPDA培養(yǎng)基上接種YTK12對(duì)照菌株,250 r/min 30℃搖菌24 h,13 000 r/min離心5 min來收集沉淀。用無菌超純水洗沉淀兩次,并重懸于5 mL無菌水中;取1 mL菌液測(cè)A600值,稀釋使其A600=0.6,取1 mL稀釋液于含5 mL蔗糖溶液的15 mL離心管中,顛倒混勻;加入1%TTC溶液35℃水浴35 min,室溫放置5 min。陽(yáng)性反應(yīng)會(huì)由無色變?yōu)樯罴t色。

2　結(jié)果與分析

2.1RXLR5蛋白序列基本信息

RXLR5的基因由1 878個(gè)堿基組成,編碼含625個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),用SignalP 3.0 預(yù)測(cè)在N端1～21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽(以黑色框標(biāo)出,圖2)的可能性為0.933(圖3);RXLR位于50～53個(gè)氨基酸處(以藍(lán)色框標(biāo)出,圖2);EER位于69～71個(gè)氨基酸處(以紅色框標(biāo)出,圖2)。

圖2　RXLR5蛋白序列基本信息Fig.2　The basic information of the RXLR5 protein sequence

圖3　SignalP-HMM 預(yù)測(cè)模型Fig.3　SignalP-HMM prediction model

2.2RXLR5基因的擴(kuò)增

圖4顯示,引物R5F/R5R擴(kuò)增RXLR5基因的大小為1 878 bp。

圖4　RXLR5基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4　The PCR product of RXLR5 gene

2.3對(duì)二糖利用能力的鑒定

攜帶pSUC2-SP5和pSUC2-Avr1b的酵母菌株YTK12,能在以棉籽糖為唯一碳源的YPRAA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(如圖5),說明SP5與Avr1b具有同樣的信號(hào)肽活性,與SUC2融合后能夠使蔗糖酶正常分泌到胞外,從而將棉籽糖分解為酵母可直接利用的單糖。陰性對(duì)照pSUC2-Mg87不具備信號(hào)肽活性,與缺陷型菌株YTK12一樣不能將合成的蔗糖酶分泌到胞外,因此不能在YPRAA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。同時(shí)含有轉(zhuǎn)化子的酵母菌在YPAD和 CMD-W培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況作為對(duì)照。

圖5　YPRAA、YPAD和CMD-W培養(yǎng)基上的酵母生長(zhǎng)試驗(yàn)Fig.5 Yeast growth assay on media with YPRAA, YPAD or CMD-W

2.4TTC顯色鑒定

由圖6可知,攜帶pSUC2-SP5和pSUC2-Avr1b的酵母菌株YTK12分泌蔗糖酶能把蔗糖水解成單糖,單糖與TTC反應(yīng)產(chǎn)生紅色不溶于水的氯化三苯基四氮唑。YTK12和攜帶pSUC2-Mg87的酵母菌株YTK12不分泌蔗糖酶,因此不能與TTC發(fā)生顯色反應(yīng)。

圖6　分泌的蔗糖酶與TTC的顯色反應(yīng)Fig.6　The color reaction of invertase secreted by transformants with TTC

3　討論

植物與病原菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中,進(jìn)化出了一系列侵染與防御機(jī)制。一方面,寄主通過物理防御、抗菌化合物、先天免疫等獨(dú)特的機(jī)制阻止病原菌侵染。另一方面,植物病原菌也通過分泌大量的效應(yīng)分子,抑制寄主防御系統(tǒng),從而幫助自身完成侵染[22]。因此,效應(yīng)子直接影響植物與病原物之間的相互識(shí)別。明確效應(yīng)子功能對(duì)于解析植物與病原物之間的互作機(jī)制具有十分重要的意義。

鑒定效應(yīng)子首先要確定其是否能夠分泌到細(xì)胞外。本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)到一條具有RXLR-EER保守序列的候選效應(yīng)蛋白,并具在N端含有可能的信號(hào)肽序列。利用酵母分泌系統(tǒng)通過蔗糖酶活性檢測(cè)等試驗(yàn)證實(shí)了其信號(hào)肽序列能夠使缺陷型酵母重新分泌蔗糖酶,使其能在YPRAA培養(yǎng)基正常生長(zhǎng),并使TTC顯色,說明SP5具有信號(hào)肽活性。這些結(jié)果表明將植物病原真菌和卵菌效應(yīng)蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)和鑒定方法用于葡萄霜霉菌效應(yīng)蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和鑒定是可行的,這為葡萄霜霉菌RXLR效應(yīng)蛋白的鑒定奠定了良好基礎(chǔ),對(duì)于推動(dòng)認(rèn)識(shí)葡萄-葡萄霜霉病菌互作的分子機(jī)制,建立葡萄霜霉病的新型防控途徑具有重要的理論意義。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Identification of the signal peptide of candidate effector protein RXLR5 fromPlasmoparaviticola

Kong Xiangjiu,Shi Jie,Kong Fanfang,Wang Zhongyue,Zhang Hao

(State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

By using bioinformatics approaches, we identified an RXLR-EER effector fromPlasmoparaviticolagenome, RXLR5. We used the predicted signal peptide SP5 in-frame with the mature sequence of yeast invertase SUC2 in the yeast signal sequence trap vector pSUC2T7M13ORI, and the resultant construct was transferred into a yeast SUC2-minus strain. The fusion of SP5 to the SUC2 mature sequence enabled the successful secretion of invertase, thus enabling the yeast cells to hydrolyze raffinose and grow on YPRAA medium. The secretion of invertase and the hydrolysis of raffinose into monosaccharides were also confirmed with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC), which reacts with monosaccharides to form the insoluble triphenylformazan (red color). These results suggest that SP5 might have a signal peptide activity, and play an important role in the secretion of RXLR5 out of the cell.

Plasmoparaviticola;signal peptide;yeast secretion system;invertase activity

2014-12-23

2015-04-07

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203035);國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(nycytx-30)

E-mail:wangzhongy0301@sina.com;hzhang@ippcaas.cn

S 436.631.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.007