董志兵 陳云鵬浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江臺州 317500

IL-17A對柯薩奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌的影響

董志兵 陳云鵬
浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江臺州 317500

目的 探討IL-17A對IL-17A基因敲除柯薩奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌的影響。 方法 取15只IL-17A基因敲除型小鼠作為IL-17A基因敲除型組，15只WT小鼠作為對照組，各組小鼠腹腔內(nèi)注射Nancy株柯薩奇病毒建立病毒性心肌炎小鼠模型，觀察兩組小鼠的心肌HE染色、心肌組織病理積分、血清細(xì)胞因子和心肌組織TGF-β1蛋白水平情況。 結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示：兩組小鼠建模后第7、14、28天時心肌組織均出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，IL-17A基因敲除組小鼠各時間點心肌組織的炎癥反應(yīng)均較對照組輕，第14天時，兩組小鼠心肌組織炎性反應(yīng)均最嚴(yán)重，對照組小鼠心肌炎癥較IL-17A基因敲除組小鼠嚴(yán)重，出現(xiàn)廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤，心肌纖維化和心肌細(xì)胞壞死比較嚴(yán)重，IL-17A基因敲除組小鼠心肌組織炎癥較對照組輕。IL-17A基因敲除組第7、14、28天心肌組織病理積分均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。IL-17A基因敲除組小鼠血清INF-γ高于對照組，IL-17A基因敲除組小鼠血清TNF-α、IL-17和IL-6水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。IL-17A基因敲除組第7、14、28天小鼠心肌組織TGF-β1蛋白水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 敲除IL-17A基因能夠降低病毒性心肌炎小鼠的心肌炎癥，降低心肌組織病理積分，影響血清細(xì)胞因子水平，降低心肌組織TGF-β1蛋白水平。

IL-17A；病毒性心肌炎；株柯薩奇病毒B3；小鼠

病毒性心肌炎的發(fā)病和柯薩奇病毒B3、埃可病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒以及流感病毒的病毒感染關(guān)系密切［1-2］，柯薩奇病毒B3引起病毒性心肌炎最常見的病毒［3-4］。病毒性心肌炎的發(fā)病可能和病毒感染后再心肌細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，對心肌組織造成直接損傷，以及病毒感染后引起的免疫損傷和各種細(xì)胞因子參與的免疫反應(yīng)等因素有關(guān)。IL-17是由Th17細(xì)胞分泌合成的［5］，是一種炎癥介質(zhì)［6］，能夠?qū)е卵装Y細(xì)胞浸潤和組

織損傷破壞，引起組織炎性反應(yīng)［7］。本研究探討IL-17A對柯薩奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

15只IL-17A基因敲除型BALB/c小鼠由東京大學(xué)醫(yī)科學(xué)研究所提供；15只WT BALB/c小鼠購自湖南實驗動物中心；Nancy株柯薩奇病毒B3購自復(fù)旦大學(xué)。

1.2 試劑和儀器

甲醛 （成都市科龍化工試劑廠）、ELISA試劑盒（美國Fermentas公司）、PBS液（美國Sigma公司）等；離心機（美國Sigma公司）、震蕩器（美國Thermo公司）等。

1.3 方法

1.3.1 建立病毒性心肌炎小鼠模型及分組 PBS液將病毒原液稀釋為1×10-5，所有小鼠腹腔內(nèi)注射0.1 mL 100TCID50為1×10-5的Nancy株柯薩奇病毒建立病毒性心肌炎小鼠模型，IL-17A基因敲除型小鼠作為IL-17A基因敲除型組，WT小鼠作為對照組。建模后第7、14、28天每組各處死5只小鼠，留取心臟組織，建模第14天處死小鼠前摘除眼球取血進行血清化驗。

1.3.2 各組小鼠心肌組織的HE染色 各時間段小鼠常規(guī)進行HE染色，細(xì)胞核染色質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)核糖體被染成紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)成分和細(xì)胞外基質(zhì)被染成紅色。

1.3.3 計算心肌組織病理積分 采用Rezkalla半定量分析法進行計算，每張切片取5個高倍視野，計算每個視野中損傷壞死和炎性細(xì)胞浸潤區(qū)域面積/整個視野面積。心肌組織病理積分評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分為沒有心肌損傷，或者有可疑炎癥損傷；1分為病變面積＜25%；2分為25%≤病變面積＜50%；3分為50%≤病變面積≤75%；4分為病變面積＞75%。

1.3.4 各組小鼠血清細(xì)胞因子檢測 采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測各組小鼠血清細(xì)胞因子，激光掃描儀掃描熒光信號，數(shù)據(jù)分析軟件分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.3.5 各組小鼠心肌組織TGF-β1蛋白水平測定 采用ELISA法按照試劑盒說明書進行測定。

1.4 主要觀察指標(biāo)

兩組小鼠的心肌HE染色、心肌組織病理積分、血清細(xì)胞因子和心肌組織TGF-β1蛋白水平情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠的心肌HE染色情況

第7天時，IL-17A基因敲除組小鼠心肌組織有炎性細(xì)胞浸潤，伴有心肌纖維斷裂和細(xì)胞壞死，對照組小鼠心肌細(xì)胞的炎性程度較IL-17A基因敲除組小鼠嚴(yán)重（圖1A、B）；第14天時，IL-17A基因敲除組小鼠的心肌炎癥明顯加重，對照組小鼠心肌炎癥較IL-17A基因敲除組小鼠嚴(yán)重，出現(xiàn)廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤，心肌纖維化和心肌細(xì)胞壞死比較嚴(yán)重（圖1C、D）；第28天，兩組小鼠的心肌炎癥均較前減輕，IL-17A基因敲除組小鼠心肌炎癥減輕更明顯（圖1E、F）。

圖1 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠心肌HE染色情況（400×）

2.2 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠的心肌組織病理積分比較

IL-17A基因敲除組第7、14、28天心肌組織病理積分均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠的心肌組織病理積分比較（分，±s）

表1 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠的心肌組織病理積分比較（分，±s）

組別 動物只數(shù) 第7天 第14天 第28天IL-17A基因敲除組對照組t值P值55 1.45±0.22 1.87±0.31 3.674 ＜0.05 2.39±0.28 3.02±0.34 5.124 ＜0.05 0.88±0.17 1.53±0.22 4.274 ＜0.05

2.3 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠血清細(xì)胞因子比較

IL-17A基因敲除組小鼠血清INF-γ高于對照組，IL-17A基因敲除組小鼠血清TNF-α、IL-17和IL-6水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠血清細(xì)胞因子比較（ng/L，±s）

表2 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠血清細(xì)胞因子比較（ng/L，±s）

組別 動物只數(shù) INF-γ TNF-α IL-17 IL-6 IL-17A基因敲除組對照組t值P值55 129.35±6.37 92.33±7.45 7.254 ＜0.05 2.28±0.43 4.47±0.65 8.125 ＜0.05 49.56±2.34 88.58±5.63 11.274 ＜0.05 8.21±0.54 25.02±0.78 13.245 ＜0.05

2.4 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠心肌組織TGF-β1蛋白水平比較

IL-17A基因敲除組第7、14、28天小鼠心肌組織TGF-β1蛋白水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠心肌組織TGF-β1蛋白水平比較（ng/mg，±s）

表3 IL-17A基因敲除組和對照組小鼠心肌組織TGF-β1蛋白水平比較（ng/mg，±s）

組別 動物只數(shù) 第7天 第14天 第28天IL-17A基因敲除組對照組t值P值55 0.07±0.01 0.13±0.02 3.984 ＜0.05 0.14±0.01 0.28±0.00 7.246 ＜0.05 0.07±0.00 0.16±0.02 6.374 ＜0.05

3 討論

病毒性心肌炎的發(fā)病和多種病毒感染關(guān)系密切，其中柯薩奇病毒B3是病毒性心肌炎最常見的感染病毒［8-9］，病毒性心肌炎的發(fā)病率有增高趨勢，對人類健康造成嚴(yán)重危害［10］。大多數(shù)病毒性心肌炎經(jīng)過治療后能夠痊愈，少數(shù)疾病繼續(xù)發(fā)展，引起心律失常、心衰等嚴(yán)重并發(fā)癥［11］。既往研究認(rèn)為病毒性心肌炎的免疫損傷主要由Th1/Th2細(xì)胞介導(dǎo)，Th1細(xì)胞亞群產(chǎn)生的INF-γ和白細(xì)胞介素-2等細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫應(yīng)答［12］。近來有研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在病毒性心肌炎的發(fā)病中國發(fā)揮關(guān)鍵作用［13-14］，Th17細(xì)胞亞群主要通過IL-23和IL-1β誘導(dǎo)分化產(chǎn)生，Th17細(xì)胞能夠分泌IL-17細(xì)胞因子，IL-17細(xì)胞因子有 IL-17F和 IL-17A，Th17細(xì)胞還可以分泌合成IL-6、IL-22、TNF-α 和IL-23等細(xì)胞因子［15-16］，Th17細(xì)胞通過合成和分泌多種細(xì)胞因子，引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失去平衡，引起組織炎癥的發(fā)生，在病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［17］。

IL-17是Th17細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)分子在病毒性心肌炎急性期介導(dǎo)病毒復(fù)制，引起自身免疫反應(yīng)和組織炎癥損傷，參與病毒性心肌炎的發(fā)病［18］。在病毒性心肌炎小鼠的心肌組織中IL-17mRNA的表達升高，心肌組織中IL-17A的表達和柯薩奇病毒B3的復(fù)制呈正相關(guān)，在病毒性心肌炎患者血清中IL-17的水平較正常人提高，表明IL-17參與病毒性心肌炎的發(fā)病過程［19-20］。本研究通過對IL-17A基因敲除病毒性心肌炎小鼠的心肌組織進行研究，探討IL-17A對柯薩奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌的影響。本研究HE染色結(jié)果顯示：兩組小鼠建模后心肌組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，IL-17A基因敲除組小鼠心肌組織的炎癥反應(yīng)均輕。IL-17A基因敲除組的心肌組織病理積分較低。IL-17A基因敲除組小鼠血清細(xì)胞因子出現(xiàn)異常。表明敲除IL-17A基因能夠降低病毒性心肌炎小鼠的心肌炎癥，降低心肌組織病理積分，影響血清細(xì)胞因子水平，降低心肌組織TGF-β1蛋白水平［21］。IL-17A基因敲除病毒性心肌炎小鼠血清中IL-17水平降低，血清INF-γ水平升高，過表達的INF-γ有助于控制心肌組織中病毒的復(fù)制，抑制心肌間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤和心肌細(xì)胞變性壞死，減輕心肌損傷，IL-17A基因敲除病毒性心肌炎小鼠血清TNF-α、IL-17和IL-6水平降低，表明IL-17A可能通過TNF-α、IL-17和IL-6等細(xì)胞因子參與病毒性心肌炎的炎性反應(yīng)［22］。

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Effect of IL-17A on Coxsackie B3 viral myocarditis mice myocardium

DONG Zhibing CHEN Yunpeng
Department of Cardiovascular Medicine，Wenling First People's Hospital，Zhejiang Province，Wenling 317500，China

Objective To study the myocardium of IL-17A gene knockout viral myocarditis mice，and explore the effect of IL-17A on Coxsackie B3 viral myocarditis mice myocardium.Methods 15 IL-17A gene knockout mice were selected as IL-17A gene knockout group，15 WT mice were selected as control group，mice of each group were injected Nancy strain coxsackievirus to establish viral myocarditis mice model，observed myocardial HE staining，myocardial pathological scores，serum cytokines and myocardial tissue TGF-β1protein level of two groups mice.Results HE staining showed∶mice of two groups all showed myocardial inflammation at 7th，14th，28th day after modeling，cardiac tissue inflammation reaction of IL-17A gene knockout group mice was lighter than control group，at the 14th day，cardiac tissue inflammatory reaction of two groups mice were the most serious，the control group mice appeared widespread inflammatory cell infiltration，myocardial necrosis and myocardial fibrosis compare serious，cardiac tissue inflammation reaction of IL-17A gene knockout mice lighter than control group.The myocardial pathological scores of IL-17A gene knockout group were lower than those of control group at 7th，14th，28 day，the difference was statistically significant （P＜0.05）.The serum INF-γ of IL-17A gene knockout group mice was higher than that of control group，the serum TNF-α，IL-17 and IL-6 levels of IL-17A gene knockout group mice were lower than those of control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The myocardial TGF-β1protein levels of IL-17A gene knockout group mice were lower than control group at 7th，14th，28 day，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion IL-17A gene knockout can reduce viral myocarditis mice myocardial inflammation，reduce myocardial histopathologic score，influence serum cytokine levels，reduce myocardial tissue TGF-β1protein levels.

IL-17A；Viral myocarditis；Strains of Coxsackie virus B3；Mice

R285.5

A

1673-7210（2016）06（a）-0023-04

2016-03-06本文編輯：蘇 暢）

浙江省溫嶺市科學(xué)技術(shù)局科技項目（2011WLCB0087）。