劉聰利,　李　明,　趙改榮,　李玉紅

(中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所,鄭州 450009)

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河南甜櫻桃病毒病害調查及病原檢測

劉聰利,李明*,趙改榮,李玉紅

(中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所,鄭州 450009)

在河南省鄭州市、鞏義市、滎陽市、新鄭市選擇具有代表性的甜櫻桃生產園對病毒病發(fā)生情況進行調查,采集表現為疑似病毒病癥狀的樣本65份,利用7種病毒引物進行RT-PCR檢測。5種病毒檢測結果呈陽性,分別是李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus, PNRSV)、李矮縮病毒(Prunedwarfvirus, PDV)、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(Cherrygreenringmottlevirus, CGRMV)、櫻桃壞死銹斑病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus, CNRMV)及櫻桃病毒A(CherryvirusA, CVA);序列分析結果表明,5種病毒擴增片段與GenBank中注冊的相應病毒核苷酸序列均具有較高的一致性;樣本病毒檢出率為100%,其中13份樣本為單獨侵染,其余52份樣本均為多病毒復合侵染,占比高達80%,復合侵染比例隨著侵染病毒種類的增多逐漸降低;病毒侵染組合與葉片表型癥狀無明顯對應關系。

甜櫻桃;病毒病;病原檢測;復合侵染

甜櫻桃種植業(yè)歷來享有“黃金種植業(yè)”的美譽,近年來甜櫻桃栽培面積和總產量均穩(wěn)定增長。截至2013年,我國甜櫻桃栽培面積已達13.48萬hm2,較2001年增加了近10倍[1]。隨著甜櫻桃栽培規(guī)模不斷擴大,其病毒病的危害在生產中亦逐年顯現,已逐步成為影響甜櫻桃產量和品質的關鍵因素之一。

目前已知侵染甜櫻桃的病毒約34種,較常見的有20種[2]。王文文等[3]、盧美光等[4]先后對環(huán)渤海灣地區(qū)和北京的櫻桃病毒病發(fā)生情況進行了調查和鑒定,初步明確了我國甜櫻桃主產區(qū)病毒病病原主要有:李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus, PNRSV)、李矮縮病毒(Prunedwarfvirus, PDV)、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(Cherrygreenringmottlevirus, CGRMV)、櫻桃壞死銹斑病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus, CNRMV)、櫻桃病毒A(CherryvirusA,CVA)、蘋果褪綠葉病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)及櫻桃小果病毒(Littlecherryvirus,LChV)。宗曉娟等[5]建立和完善了幾種主要病毒的單重RT-PCR、多重RT-PCR、納米磁珠技術結合多重RT-PCR的檢測方法,為高效、準確檢測甜櫻桃病毒病病原提供了技術保證。盡管目前侵染甜櫻桃的病毒種類已初步明確,其相關病毒檢測技術也逐步健全,但關于我國甜櫻桃病毒病的危害特點尚未有系統(tǒng)報道,尤其是侵染甜櫻桃的病毒中,單獨侵染或多病毒復合侵染的比例,以及多病毒復合侵染的類型尚不明晰。本研究利用單重RT-PCR技術,對來源于河南、遼寧、山東、陜西等地的甜櫻桃生產園中表現疑似病毒病癥狀的苗木樣本進行病原檢測,以期為明確我國甜櫻桃病毒病的危害特點,為甜櫻桃病毒病診斷和病原檢測提供數據支持。

1　材料與方法

1.1材料

于2013年4月-6月,在河南省鄭州市、鞏義市、滎陽市、新鄭市選擇具有代表性的甜櫻桃生產園進行病毒病害分布調查并采集樣本。采樣果園為成齡園或老齡園,所選苗木分別來源于河南、陜西、大連、山東等地。共采集表現疑似病毒病癥狀的樣本65份,每株樹作為1份樣本,每份樣本采集病葉5片,記錄癥狀并拍照保存。隨后將樣本密封(塑料自封袋),編號后放入液氮罐,帶回實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

采用生物工程(上海)股份有限公司的柱式植物總RNA提取純化試劑盒提取總RNA,用紫外分光光度計檢測RNA濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。采用Fermentas公司的First Strand cDNA Systhesis Kit反轉錄獲得cDNA第一鏈。取上述RNA 5 μg,0.2 μg/μL隨機引物1 μL,加適量ddH2O 至12 μL,70℃溫浴5 min后置于冰上冷卻,依次加入20 U/μL RNA酶抑制劑1 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、5×反轉錄緩沖液4 μL,25℃溫浴5 min,加入200 U/μL反轉錄酶1 μL,42℃溫浴1 h,70℃ 10 min,終止反應后離心,-20℃保存,即為cDNA模板,稀釋8倍后用于PCR擴增。

1.3PCR擴增和目的片段克隆

選用國內外已報道的李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)、李矮縮病毒(PDV)、蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、櫻桃壞死銹斑病毒(CNRMV)、櫻桃病毒A (CVA)、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(CGRMV)、櫻桃小果病毒2(LChV2)特異引物[6-9](表1)進行RT-PCR擴增。從65個樣本中優(yōu)先挑選5個病毒危害癥狀較為嚴重的樣本進行檢測。

表1　7種病毒RT-PCR檢測特異性引物

0.2 mL PCR管中依次加入cDNA 1 μL,dNTPs(10 mmol/L)0.4 μL,10×PCR buffer (含Mg2+) 2 μL,Pfu DNA聚合酶(5U/μL)0.2 μL,上游和下游引物(10 μmol/L) 各1 μL,加dd H2O補足20 μL。反應程序為:95℃預變性4 min;95℃ 45 s,63℃ 45 s,72℃ 1 min,35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,DL2000分子量標準指示病毒特異性擴增片段,紫外燈下觀察電泳結果并照相記錄。

電泳結束后在紫外透射儀上分別切下相應條帶,采用DNA凝膠回收試劑盒進行純化。將純化后的PCR產物連接到pGEM-Easy載體上,轉化DH5α感受態(tài)細胞,經菌落PCR篩選陽性克隆,提取質粒,選取2～3個陽性克隆送公司測序,所得到的序列與GenBank中注冊的序列進行比對。以經過上述過程驗證的包含病毒目標片段的重組質粒作為RT-PCR檢測的陽性對照, ddH2O作為陰性對照,對其余樣本進行RT-PCR檢測。

2　結果與分析

2.1甜櫻桃病毒病的危害調查

對4個甜櫻桃生產園中的病毒病癥狀進行觀察,結果表明,各果園均有表現病毒病癥狀的植株,主要癥狀為葉片皺縮、黃化花葉、壞死環(huán)斑、濃綠細長、畸形、邊緣缺損、葉背耳突、植株矮縮等(圖1)。其中早熟品種‘紅燈’最為敏感,感染嚴重的植株只開花不結果。調查發(fā)現,大部分感病植株只是部分葉片表現癥狀,其開花結果沒有受到嚴重影響。

圖1　甜櫻桃病毒病樹的癥狀表現Fig.1　Symptoms of virus disease in sweet cherry

2.2甜櫻桃病毒病原RT-PCR檢測結果分析

利用7種病毒的特異性引物對65份樣本進行RT-PCR擴增,將檢測結果進行統(tǒng)計,結果如圖2所示,7種待檢病毒中5種病毒檢測結果呈陽性,其檢出率分別為PNRSV 46.2%、PDV 60%、CGRMV 43.1%、CVA 73.8%、CNRMV 27.7%。

本研究所選樣本皆為生產園中樹齡較大、葉片表現明顯病毒癥狀的樣本,樣本病毒檢出率為100%,其中，單一病毒侵染的有13份樣本,其余52份樣本均為多病毒復合感染,占比為80%。多病毒復合侵染中,PDV和CVA復合侵染比例最高,達21.2%;復合侵染病毒種類為2、3、4、5種不等,侵染比例分別為42.3%、30.8%、23.1%、3.8%,隨著復合侵染病毒種類的增多而降低(表2)。病毒侵染組合與葉片癥狀表型無明顯對應關系,如葉片表現壞死環(huán)斑癥狀的植株,感染病毒組合類型包括PNRSV、CNRMV、CVA 3種病毒或PNRSV、PDV、CNRMV、CVA 4種病毒;而同樣感染PNRSV、PDV、CVA 3種病毒的植株則呈現葉片細長、濃綠或葉片褪綠斑駁的表型。

圖2　5種甜櫻桃病毒的發(fā)生情況統(tǒng)計圖Fig.2　Statistical graph of the occurrence condition of five viruses infected sweet cherry

復合侵染病毒數量/種Co-infectionnumbers病毒名稱VirusPNRSVPDVCGRMVCNRMVCVA復合侵染Mixedinfection樣本數量/株Numberofsweetcherrytrees比例/%Percentage-+--+1121.2---++23.82+---+47.7--++-47.7++---11.9++--+713.5+--++11.93-++-+59.6+-+-+11.9--+++23.8+-+++23.84++-++35.8+++-+713.55+++++23.8

1) “+”表示檢測到相應病毒; “-”表示未檢測到相應病毒; “比例”=每種復合侵染類型的樣本數量/52。

“+”indicates the corresponding virus that has been detected； “-” indicates that no virus was detected； “Percentage”=The number of sweet cherry trees for each co-infection/52.

2.3甜櫻桃病毒RT-PCR擴增片段序列分析

為進一步驗證檢測的準確性,將上述5種病毒的PCR產物進行克隆、測序,獲得序列與GenBank中各病毒基因組序列相應區(qū)段比對,結果表明:PNRSV、PDV、CGRMV、CVA和CNRMV與已知序列相似性較高,為78%～99%。

3　討論

在長期的無性繁殖過程中,甜櫻桃苗木感染并積累了多種病毒或類病毒[9-10],一旦被病毒侵染,樹體終身帶毒,致使樹勢減弱,產量降低,果實品質下降,甚至整株死亡。統(tǒng)計資料顯示,1992-2007年地中海地區(qū)24 000株核果類果樹的病毒病發(fā)病率高達23.5%,其中櫻桃感病率最高,達45.6%,其復合侵染比例則高達76.4%[11]。王文文等[12]通過對表現皺葉病的甜櫻桃品種‘紅燈’樹體內的病毒檢測后,發(fā)現多病毒復合侵染比例較高。本研究中,對表現疑似病毒病癥狀的65份樣本的病原檢測結果顯示,樣本病毒檢出率為100%,5種病毒檢測結果呈陽性,分別為PNRSV、PDV、CGRMV、CVA、CNRMV,多病毒復合侵染比例高達80%,與地中海地區(qū)櫻桃病毒復合侵染比例76.4%差別不大[11]。復合侵染病毒種類為2、3、4、5種不等,侵染比例隨復合侵染病毒種類增多而降低。甜櫻桃病毒侵染組合與葉片癥狀表型無明顯對應關系,這一結論與王文文等[12]對表現皺葉病的‘紅燈’樹體內病毒檢測結果一致。

目前我國櫻桃病毒病發(fā)生較為普遍,且復合侵染比例較高,雖然研究中涉及的樣品數量及分布地點有限,但這些數據基本反映了我國櫻桃病毒病的發(fā)生特點,可為后續(xù)調查提供數據支持。由于甜櫻桃復合侵染病毒組合與葉片癥狀表型無明顯對應關系,因此建立高效準確的檢測方法,明確侵染甜櫻桃的病毒種類,才能有針對性地控制病毒的傳播。而選育抗病性強的優(yōu)良品種、建立無病毒苗木繁育體系,是保證甜櫻桃產量和提高品質的基本措施。

[1]黃貞光, 劉聰利, 李明, 等. 近20年國內外甜櫻桃產業(yè)發(fā)展動態(tài)及對未來的預測[J].果樹學報, 2014, 31(S1):1-6.

[2]董薇, 宋雅坤, 吳明勤, 等. 大櫻桃病毒病研究進展[J].中國農學通報, 2005, 21(5): 332-336.

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[4]盧美光,吳冰, 高蕊, 等. 我國部分地區(qū)櫻桃病毒病害初步調查和病原檢測[J].植物保護, 2015, 41(1):98-103.

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(責任編輯：楊明麗)

Investigation and pathogen detection of sweet cherry virus disease in Henan

Liu Congli,Li Ming,Zhao Gairong,Li Yuhong

(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou450009, China)

Several representative sweet cherry orchards were selected to investigate the occurrence condition of virus disease in Zhengzhou, Gongyi, Xingyang and Xinzheng cities of Henan Province, from which sixty-five samples with suspected virus symptoms were collected. Seven pairs of specific primers were used to detect viruses infected sweet cherry by RT-PCR. RT-PCR results and sequence analysis showed that five viruses were found positive, includingPrunusnecroticringspotvirus(PNRSV),Prunedwarfvirus(PDV),Cherrygreenringmottlevirus(CGRMV),Cherrynecroticrustymottlevirus(CNRMV),CherryvirusA (CVA). The amplified fragments had high identity with the corresponding nucleotide sequence reported in GenBank. The positive rate of viruses was 100%, among all 65 samples tested, 13 were of single infection, and the rest 52 samples were of mixed infection which account for more than 80%.The proportion of mixed infection gradually decreased along with ascending of the virus types. No significantly comparable relations were found between types of mixed infection and virus disease symptoms.

sweet cherry;virus disease;pathogen detection;mixed infection

2015-08-24

2015-10-10

中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程專項經費(CAAS-ASTIP-2015-ZFRI)；鄭州市現代農業(yè)科技創(chuàng)新工程(131PZDGC113)

E-mail:limingzhengzhou@hotmail.com

S 436.629

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.034