宋志強,　成飛雪,　程菊娥,　張德詠,　何代進,　劉　勇*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 長沙　410128; 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 園藝作物病蟲害綜合治理湖南省重點實驗室, 長沙　410125; 3. 湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 長沙　410127)

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湖南省永州地區(qū)柑橘慢衰病與黃龍病病原鑒定及分布調(diào)查

宋志強1,2,成飛雪2,程菊娥2,張德詠1,2,何代進3,劉勇1,2*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 長沙410128; 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 園藝作物病蟲害綜合治理湖南省重點實驗室, 長沙410125; 3. 湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 長沙410127)

為明確湖南省柑橘黃化癥狀與柑橘慢衰病和柑橘黃龍病的相關(guān)性,應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對湖南省永州地區(qū)表現(xiàn)黃化癥狀的柑橘進行了兩種病原的鑒定及分布調(diào)查。結(jié)果表明,造成該地區(qū)柑橘黃化現(xiàn)象的主要原因為柑橘半穿刺線蟲和黃龍病菌對柑橘的侵染。所檢樣本中,柑橘慢衰病平均發(fā)生率為82.1%,土壤中的半穿刺線蟲群體密度最高達到3 077條/100 mL。永州地區(qū)柑橘黃龍病病菌屬于韌皮部桿菌屬類細(xì)菌亞洲種,平均檢出率為64.3%。柑橘半穿刺線蟲和黃龍病菌在柑橘園存在混合侵染現(xiàn)象,混合侵染率為53.6%。柑橘半穿刺線蟲在永州地區(qū)柑橘產(chǎn)區(qū)分布廣泛,是造成柑橘黃化癥狀的重要病因,重視并有效防控柑橘半穿刺線蟲已迫在眉睫。

柑橘慢衰病;柑橘黃龍病;柑橘半穿刺線蟲;病原鑒定;分布調(diào)查

柑橘半穿刺線蟲(Tylenchulussemipenetrans)引起的柑橘慢衰病(citrus slow decline disease)是柑橘上最重要的病害之一,廣泛分布于全世界柑橘產(chǎn)區(qū),造成極大的經(jīng)濟損失[1]。柑橘半穿刺線蟲是一種專化性強的定居型半內(nèi)寄生線蟲,能夠寄生50多種柑橘品種及其雜交種,也可在葡萄、草莓、荔枝、蘋果、柿、杉木等植物上繁殖[2-3]。柑橘被侵染后活力減退,葉片褪綠黃化,長勢衰弱似缺肥、缺水、生長不良癥狀,嚴(yán)重時葉片脫落,果實變小,甚至枯死[4]。此外,柑橘半穿刺線蟲侵染柑橘根部造成的傷口有利于真菌、細(xì)菌等病原物的入侵,加重對柑橘的危害[5]。柑橘受害后一般減產(chǎn)30%～50%,嚴(yán)重時達100%[6];福建省5個重要柑橘產(chǎn)區(qū)柑橘半穿刺線蟲果園發(fā)病率為74.6%,果園株發(fā)病率為5%～100%[7]。

柑橘黃龍病(citrus Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生產(chǎn)中的一種極具毀滅性的病害,其病原為韌皮部桿菌屬類細(xì)菌(CandidatusLiberibacter spp.),根據(jù)病原對熱的敏感性、傳播媒介和地理分布,可分為亞洲種(Ca. L. asiaticus)、非洲種(Ca. L. africanus)和美洲種(Ca. L. americanus)[8-9]。目前在我國僅發(fā)現(xiàn)亞洲種,在田間主要通過柑橘木虱(Diaphorinacitri)傳播,還可借助嫁接、菟絲子傳播。田間典型癥狀為葉片斑駁型黃化、均勻型黃化及缺素性黃化,果實呈“紅鼻果”或“斜肩果”，一般會造成30%～100%的產(chǎn)量損失[10];我國廣西柑橘黃龍病年平均發(fā)生率超過5%,每年造成的直接經(jīng)濟損失超過8.05億～9.62億元[11]。

湖南省是全國柑橘主產(chǎn)區(qū)之一，面積、產(chǎn)量、產(chǎn)值均穩(wěn)居全國第一。近年來,湖南省特別是永州地區(qū)柑橘黃化衰退現(xiàn)象日趨嚴(yán)重,極大地威脅了柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。由于柑橘慢衰病及黃龍病都會引起柑橘出現(xiàn)黃化癥狀,在多數(shù)情況下,柑橘慢衰病所表現(xiàn)的黃化癥狀常被基層誤診為柑橘黃龍病,造成防控措施不當(dāng),防治效果低下,而進行拋荒、砍伐或挖除,給柑橘產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。福建省長泰縣因?qū)⒏涕俾ゲ≌`診為黃龍病,每年挖除的病樹約占果樹總數(shù)的10%[12]。因此,準(zhǔn)確了解造成柑橘黃化現(xiàn)象的病因,對其防控具有極其重要的意義。本研究團隊于2014-2015年對湖南省永州地區(qū)表現(xiàn)黃化癥狀的柑橘進行了柑橘半穿刺線蟲和黃龍病病原鑒定及分布調(diào)查,以期為柑橘慢衰病和黃龍病的有效防控提供科學(xué)指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1樣品采集

2014年6月-2015年11月對湖南省永州市冷水灘區(qū)、零陵區(qū)、道縣和江永縣柑橘園中表現(xiàn)黃化癥狀的柑橘進行了取樣調(diào)查。采用五點取樣法分別采集柑橘植株的葉片、根系及根際土壤,進行柑橘慢衰病和柑橘黃龍病病原檢測。

1.2柑橘半穿刺線蟲形態(tài)學(xué)鑒定

柑橘慢衰病最主要的診斷方法是鑒定柑橘根系及根際土壤中是否存在柑橘半穿刺線蟲。柑橘根組織中的雌蟲在體視顯微鏡下用細(xì)解剖針直接剝離;土壤中2齡幼蟲和雄蟲采用淺盤法分離。將雌蟲以及分離獲得的2齡幼蟲和雄蟲經(jīng)緩慢加熱殺死后用TAF固定液固定,制成臨時玻片,于光學(xué)顯微鏡下進行形態(tài)觀察、拍照。采用de Man公式進行形態(tài)測計,其中:n=樣本數(shù);L=體長;Stylet=口針長;Tail=尾長;Spicule=交合刺長度;a=體長/最大體寬;b=體長/頭端至食道與腸連接處的距離;c=體長/尾長;c＇=尾長/肛門或泄殖腔處體寬;V=陰門至頭端的距離/體長×100;DGO=背食道腺開口至口針基部球的距離。

1.3柑橘半穿刺線蟲分子生物學(xué)鑒定

1.3.1柑橘半穿刺線蟲DNA提取

單條線蟲DNA的提取參照王江嶺等的方法并稍作修改[13]。挑取單條線蟲放入含有8 μL ddH2O和1 μL 10×PCR buffer (Mg2+free)的200 μL PCR管中,放入液氮中冷凍1 min,置于95℃下2 min,重復(fù)5次;向PCR管中加入1 μL 1 mg/mL蛋白酶K,65℃溫育15 min,95℃反應(yīng)10 min,獲得的DNA提取液直接進行PCR擴增。

1.3.2柑橘半穿刺線蟲PCR檢測

分別以柑橘半穿刺線蟲的雌蟲、雄蟲和2齡幼蟲的DNA為模板,采用Liu等報道的特異性引物Ts-SF(5′-TACCAGGTTGAGCAGAGTTCTT-3′)和Ts-SR(5′-TCCTACCCTTCCA CAGCG-3′)進行PCR擴增[14],片段大小為297 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL:10×EasyTaqbuffer 3 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,10 μmol/L正反向引物各1 μL,5 U/μLEasyTaqDNA polymerase 0.5 μL,模板DNA 5 μL,補足ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個循環(huán);72℃延伸5 min。PCR擴增結(jié)束后,取5 μL擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.4土壤中柑橘半穿刺線蟲群體密度調(diào)查

將采集的柑橘土壤樣品充分混勻后,分別取100 mL,采用淺盤法分離土壤樣品中的2齡幼蟲,在倒置顯微鏡下統(tǒng)計柑橘半穿刺線蟲2齡幼蟲的數(shù)量。每樣品重復(fù)3次,計算每100 mL土壤樣品中的柑橘半穿刺線蟲群體密度。

1.5柑橘黃龍病分子生物學(xué)檢測

以黃梢或葉片黃化作為田間診斷柑橘黃龍病依據(jù)的同時,采用分子生物學(xué)技術(shù)對其進行準(zhǔn)確診斷。采用CTAB法提取柑橘葉脈總DNA。參照Hocquellet等報道的柑橘黃龍病菌特異性引物A2(5′-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3′)和J5(5′-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3′)進行PCR擴增[15],亞洲種和非洲種片段大小分別為703 bp和669 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL:10×EasyTaq buffer 3 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,10 μmol/L正反向引物各1 μL,5 U/μL EasyTaq DNA polymerase 0.5 μL,DNA模板1 μL,補足ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳分析,然后將PCR產(chǎn)物回收、轉(zhuǎn)化、克隆并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將獲得的序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中已知序列進行同源性比較。

2　結(jié)果與分析

2.1柑橘半穿刺線蟲形態(tài)鑒定

2.1.1測計值

雌蟲:n=20;L=379.2(350.1～410.5)μm;a=4.7(4.0～5.3);b=3.0(2.7～3.4);V=90.1(87.3～93.0);Stylet=12.1(10.5～13.3)μm。

圖1　柑橘半穿刺線蟲的形態(tài)特征圖Fig.1　Morphological characters of Tylenchulus semipenetrans

雄蟲:n=20;L=360.0(317.9～410.1)μm;a=33.9(29.2～45.6);b=3.2(2.9～3.5);c=8.7(7.7～10.1);c＇=4.9(4.0～5.6);Stylet=10.2(9.4～11.1)μm;Spicule=19.1(16.8～21.5)μm;DGO=6.0(5.2～6.9)μm。

2齡幼蟲:n=20;L=379.6(337.1～414.5)μm;b=3.4(3.1～3.7);Stylet=13.8(13.0～14.7)μm。

2.1.2形態(tài)描述

雌蟲:成熟雌蟲與雄蟲異型,蟲體前部潛入根組織內(nèi),后部外露于根表面,膨大呈囊狀(圖1a)。頭部骨化弱,口針中等發(fā)達,基部球大而圓(圖1b)。具兩個彎曲的卵巢,陰門向腹面斜裂,近尾端,產(chǎn)卵于膠質(zhì)卵囊中。排泄孔位于陰門前,無直腸和肛門。尾端有一指形突起(圖1c)。

雄蟲:蟲體蠕蟲形,纖細(xì)(圖1d)。唇區(qū)圓形?？卺樌w細(xì),有基部球。食道細(xì)長,中食道球退化,食道腺呈洋梨形,與腸交界明顯(圖1e)。交合刺細(xì),無交合傘。尾圓錐形,末端稍鈍(圖1f)。

2齡幼蟲:蟲體蠕蟲形(圖1g)。頭部骨質(zhì)化,口針較發(fā)達,有基部球。中食道球大,食道腺與腸基本平接或略覆蓋腸(圖1h)。尾漸細(xì),末端鈍圓(圖1i)。

2.2柑橘半穿刺線蟲分子生物學(xué)鑒定

利用柑橘半穿刺線蟲特異性引物分別對雌蟲、雄蟲和2齡幼蟲的DNA進行PCR擴增,結(jié)果顯示,雌蟲、雄蟲和2齡幼蟲均擴增出297 bp大小的特異性片段(圖2),表明分離得到的線蟲為柑橘半穿刺線蟲,其結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

圖2　不同齡期柑橘半穿刺線蟲PCR產(chǎn)物Fig.2　PCR products amplified from Tylenchulus semipenetrans at different developmental stages using the species-specific primers

2.3柑橘黃龍病病菌檢測

利用柑橘黃龍病菌特異性引物A2和J5對采集的28份樣品的葉脈DNA進行PCR擴增,結(jié)果顯示,共有18份樣品擴增出一條703 bp的特異性條帶,而陰性對照未擴增出相應(yīng)的條帶(圖3)。所得序列與GenBank公布的柑橘黃龍病菌亞洲種序列(CP004005.1和CP001677.5等)同源性為100%。

圖3　利用特異性引物A2和J5檢測湖南永州地區(qū)柑橘樣品中的柑橘黃龍病菌Fig.3　Electrophoresis of PCR products of HLB pathogen from Yongzhou City, Hunan Province,using primers A2 and J5

2.4柑橘半穿刺線蟲和柑橘黃龍病分布

在所采集的28份柑橘土壤樣品中,有24份樣品檢出了柑橘半穿刺線蟲,冷水灘區(qū)、零陵區(qū)、道縣和江永縣均有柑橘半穿刺線蟲的分布,平均發(fā)生率為82.1%,土壤中的線蟲群體密度最高達到3 077條/100 mL,冷水灘區(qū)和零陵區(qū)發(fā)生率較高,均為100%,其次是江永縣,發(fā)生率為91.7%,而道縣發(fā)生率相對較低,為20%(表1)。

從表1中可以看出,永州地區(qū)所采集的柑橘葉片樣品中,柑橘黃龍病的平均檢出率為64.3%,其中江永縣檢出率最高,為83.3%,道縣、零陵區(qū)和冷水灘區(qū)檢出率分別為60.0%、57.1%和25.0%,所檢測到的18個柑橘黃龍病分離物均為韌皮部桿菌屬類細(xì)菌亞洲種。

3　結(jié)論與討論

目前,已在我國湖南、湖北、廣東、廣西、福建等15個省(市、自治區(qū))的柑橘產(chǎn)區(qū)中發(fā)現(xiàn)有柑橘半穿刺線蟲的分布和危害[3,16]。由于柑橘半穿刺線蟲在柑橘根部侵染危害,蟲體細(xì)小,無法用肉眼觀察到,雖發(fā)生普遍,危害嚴(yán)重,但其引起的柑橘慢衰病在柑橘生產(chǎn)中卻得不到重視,基層技術(shù)人員和種植戶基本不認(rèn)識或不了解該病害,所表現(xiàn)的黃化癥狀常被誤診為柑橘黃龍病,而進行拋荒、砍伐或挖除,造成重大經(jīng)濟損失。本研究利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法,明確了湖南省永州地區(qū)柑橘主要病原線蟲為柑橘半穿刺線蟲,平均發(fā)生率為82.1%,其中冷水灘區(qū)、零陵區(qū)和江永縣發(fā)生率比較高,土壤中的線蟲群體密度最高達到3 077條/100 mL,表明柑橘半穿刺線蟲在永州地區(qū)柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍且嚴(yán)重,是引起柑橘黃化癥狀的重要病因之一。

表1　采集樣品中柑橘半穿刺線蟲2齡幼蟲群體密度及黃龍病病菌檢測1)

1) “+”and “-”分別代表陽性和陰性結(jié)果。

"+"and "-" represent positive and negative results, respectively.

柑橘黃龍病于1919年在我國廣東省潮汕地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)[17],目前已有11個省(市、自治區(qū))的柑橘產(chǎn)區(qū)遭受其危害,受害面積占柑橘種植總面積的80%以上[18]。本研究利用分子生物學(xué)方法對永州地區(qū)疑似柑橘黃龍病植株進行了檢測,結(jié)果表明所有表現(xiàn)黃化癥狀的柑橘樣品中僅有64.3%的樣品檢測結(jié)果呈現(xiàn)陽性,說明表現(xiàn)黃化癥狀的柑橘植株不一定都帶有黃龍病病菌。

造成柑橘黃化癥狀的病因有多種,主要包括柑橘黃龍病、柑橘線蟲病、柑橘病毒病和生理性病害等,單憑柑橘的田間黃化癥狀不易正確診斷出其病因。所以,正確快速地診斷出柑橘黃化癥的病因是有效控制病害危害和蔓延的基礎(chǔ)。本研究通過對表現(xiàn)黃化癥狀的柑橘調(diào)查取樣和檢測發(fā)現(xiàn),柑橘慢衰病和柑橘黃龍病在永州地區(qū)柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍且嚴(yán)重,并且存在著混合或復(fù)合侵染現(xiàn)象。因此,在重點防控柑橘黃龍病的同時,也應(yīng)重視并有效控制柑橘半穿刺線蟲的危害,從而保障柑橘生產(chǎn)安全,促進柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展和增加農(nóng)民收入。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Identification and distribution survey of the pathogens of citrus slow decline disease and citrus Huanglongbing in Yongzhou City, Hunan Province

Song Zhiqiang1,2,Cheng Feixue2,Cheng Ju’e2,Zhang Deyong1,2,He Daijin3,Liu Yong1,2

(1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha410128, China; 2. Hunan Key Laboratory of Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops, Institute of Plant Protection, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha410125, China; 3. Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic, Changsha410127, China)

In order to determinate the correlation between etiolation symptoms of citrus in Hunan Province and citrus slow decline disease and citrus Huanglongbing (HLB), leaf, root and soil samples were collected from citrus with etiolation symptoms in Yongzhou City, Hunan Province and the identification and distribution survey of two pathogens were carried out based on morphological characteristics and molecular biology techniques. The results showed that the infection ofTylenchulussemipenetransand HLB pathogen were the main cause of etiolation phenomenon of citrus in this area. The average incidence rate ofT.semipenetransin collected samples was 82.1%. The highest population density of juveniles in samples was reached to 3 077 nematodes per 100 mL soil. The HLB pathogen isCandidatusLiberibacter asiaticus and the average detection rate was 64.3% in Yongzhou City. There were mixed infection ofT.semipenetransand HLB pathogen in citrus orchards and mixed infection rate was 53.6%.T.semipenetransis widely distributed in citrus growing regions of Yongzhou City, and it is the important cause of large range of etiolation symptoms of citrus. There is extremely urgent for paying attention to and effectively controllingT.semipenetrans.

citrus slow decline disease;citrus Huanglongbing;Tylenchulussemipenetrans;pathogen identification;distribution survey

2016-01-27

2016-02-29

湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2015B249)；國家自然科學(xué)基金(31171826)

E-mail: haoasliu@163.com

S 436.66

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.032