周長(zhǎng)遠(yuǎn),王　艷,杜愛(ài)玲

(1.棗莊市臺(tái)兒莊區(qū)林業(yè)局,山東棗莊 277400;2.山東職業(yè)學(xué)院生物工程系,山東濟(jì)南 250104;3.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,山東濟(jì)南 250061)

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周長(zhǎng)遠(yuǎn)1,王艷2,杜愛(ài)玲3,*

(1.棗莊市臺(tái)兒莊區(qū)林業(yè)局,山東棗莊 277400;2.山東職業(yè)學(xué)院生物工程系,山東濟(jì)南 250104;3.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,山東濟(jì)南 250061)

應(yīng)用超臨界二氧化碳萃取姜油樹(shù)脂,選用乙醇-水作流動(dòng)相,HPD-100大孔樹(shù)脂作固定相分離出其中的烯類物質(zhì),并用高效液相色譜法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)確定含烯類的洗脫段。對(duì)比不同展開(kāi)劑下烯類物質(zhì)在硝酸銀硅膠板上的層析效果,最終選用V正己烷∶V乙酸乙酯=95∶5的溶劑作流動(dòng)相分離其中的β-倍半水芹烯。GC/MS檢測(cè)結(jié)果表明,分別選用HPD-100大孔樹(shù)脂和硝酸銀硅膠作為固定相可以將姜油樹(shù)脂中的β-倍半水芹烯很好的分離出來(lái),其峰面積百分?jǐn)?shù)達(dá)88.73%,收率為84.05%。通過(guò)進(jìn)一步HPLC檢測(cè)證明β-倍半水芹烯具有紫外吸收,其特征吸收波長(zhǎng)為232 nm。

硝酸銀硅膠,β-倍半水芹烯,分離

β-倍半水芹烯與姜烯等同屬倍半萜烯類化合物,均為姜油樹(shù)脂的主要活性成分[1]。研究證實(shí),其性質(zhì)同姜烯相似,具有多種生物活性,如抗病毒、抗生育和抗?jié)兊萚2]。由于姜油樹(shù)脂中倍半萜烯類化合物同分異構(gòu)體較多,目前針對(duì)β-倍半水芹烯的分離純化方法較少。賈雁高等[3]曾采用普通硅膠柱進(jìn)行姜烯的分離純化,最終所得的樣品姜烯和β-倍半水芹烯也沒(méi)有完全分離。Winstein等人[4]發(fā)現(xiàn)銀離子可以與烯烴類物質(zhì)發(fā)生可逆反應(yīng),形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,其穩(wěn)定性與雙鍵的位置有關(guān)[5-6]。黃漢昌等人[7]曾利用銀離子絡(luò)合分離出了香茅次油中的β-欖香烯。

姜油樹(shù)脂中不同類型倍半萜的雙鍵位置不同,因此可以與銀離子形成穩(wěn)定性不同的絡(luò)合物。本文根據(jù)β-倍半水芹烯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),參照普通硅膠柱的工藝流程,利用硝酸銀硅膠柱從姜油樹(shù)脂中分離純化β-倍半水芹烯。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

姜油樹(shù)脂南陽(yáng)張仲景大廚房股份有限公司;HPD-100大孔樹(shù)脂滄州寶恩吸附材料科技有限公司;柱層析硅膠200～300目、硅膠層析G板青島海洋化工廠;乙醇、硝酸銀、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、香草醛、濃硫酸,分析純天津市廣成化學(xué)試劑有限公司。

HY-4調(diào)速多用振蕩器江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;上海滬西自動(dòng)柱層析系統(tǒng);TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司;氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀、高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器)美國(guó)安捷倫公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HPD-100大孔樹(shù)脂分離烯類段物質(zhì)參照王艷等[8]有關(guān)樹(shù)脂柱的操作,將已處理好的HPD-100大孔樹(shù)脂采用40%的乙醇裝柱,稱取1 g左右姜油樹(shù)脂加入層析柱中,用50%的乙醇淋洗,采用不同配比的乙醇-水體系分別進(jìn)行洗脫,控制流速為1 mL/min左右,收集洗脫液,備測(cè)。

1.2.2UV和HPLC分析用紫外分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè),分別記錄232、262、282 nm下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

同時(shí)用高效液相色譜儀測(cè)定各洗脫液的組成。

檢測(cè)條件:ODS柱,柱溫25 ℃;二極管陣列檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)232、262、282 nm;甲醇-水體系,梯度洗脫,流量 1 mL/min。

1.2.3硝酸銀硅膠G板及硝酸銀硅膠的制備將硅膠G板(含硅膠的一面向下),輕輕放到10%的硝酸銀溶液中,浸泡10～20 s左右,取出,放在避光處晾干,備用[9]。

稱取硝酸銀于體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液中,待硝酸銀溶解后加入硅膠,攪拌均勻,于110 ℃下避光烘干,備用。

1.2.4TLC分析將烯類段流出液點(diǎn)樣于硝酸銀硅膠G板一端,展開(kāi),然后用1%的香草醛濃硫酸溶液顯色。

1.2.5硝酸銀硅膠柱層析法分離β-倍半水芹烯避光條件下,將已處理好的硝酸銀硅膠采用干法裝柱[10]。取烯類段樣品上樣,加洗脫劑,控制流速,收集洗脫液,備測(cè)。

1.2.6HPLC和GC-MS分析用高效液相色譜儀和氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定1.2.5中洗脫液的組成。

HPLC檢測(cè)條件同1.2.2。

GC-MS檢測(cè)條件參照姜烯的檢測(cè)條件[3]。

1.2.7β-倍半水芹烯回收率的計(jì)算參照賈雁高等人的計(jì)算方法[3],利用分離所得β-倍半水芹烯樣品和姜油樹(shù)脂的GC/MS分析數(shù)據(jù),計(jì)算β-倍半水芹烯的收率:

其中,Y為β-倍半水芹烯的收率;A1為單位體積樣品中β-倍半水芹烯的峰面積計(jì)數(shù);A2為姜油樹(shù)脂單位體積樣品中β-倍半水芹烯的峰面積計(jì)數(shù);V1為β-倍半水芹烯樣品的體積,mL;m為姜油樹(shù)脂的上樣量;N為姜油樹(shù)脂的稀釋倍率。

2　結(jié)果與分析

2.1HPD-100大孔樹(shù)脂分離烯類段物質(zhì)

對(duì)1.2.1中分離所得樣品利用紫外分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè),結(jié)果初步表明:70%的乙醇水溶液可以將姜油樹(shù)脂中的酚類物質(zhì)洗下,90%的乙醇溶液洗脫其中的烯類物質(zhì)(如圖1)。

圖1　HPD大孔樹(shù)脂的洗脫曲線Fig. 1　Eluant curve of HPD macroporous resin

為進(jìn)一步確定HPD-100大孔樹(shù)脂的分離效果,對(duì)烯類段物質(zhì)峰值樣在232、262、282 nm下進(jìn)行HPLC檢測(cè),所得色譜圖如圖2所示。

圖2　烯類洗脫段峰值樣的HPLC譜圖Fig. 2　HPLC chromatograms of vinyl peak sample注:a:232 nm;b:262 nm;c:282 nm。

HPLC分析結(jié)果表明,10 min前沒(méi)有姜酚的特征吸收峰(RT為2.9 min左右),僅有少量的溶劑峰存在,保留時(shí)間達(dá)12 min后出現(xiàn)明顯的譜峰,且均為烯類物質(zhì)的吸收峰;又因在262 nm下的吸收強(qiáng)于282 nm(酚類物質(zhì)的特征吸收波長(zhǎng)),由此我們可推斷90%的乙醇水溶液可以將RT值為12 min以后的烯類物質(zhì)完全洗脫下來(lái),所得烯類樣中不含姜酚類物質(zhì),烯類與酚類物質(zhì)實(shí)現(xiàn)充分分離。

2.2烯類段物質(zhì)的TLC分析

合并烯類段洗脫液,以硝酸銀處理后的硅膠G板作為層析介質(zhì),采用不同配比的正己烷和乙酸乙酯作展開(kāi)劑,展開(kāi)樣品,分析效果如圖3所示。

圖3　烯類段物質(zhì)在硝酸銀硅膠G板上的TLCFig. 3　Thin layer chromatography of vinyl sample on argentated silica gel G pre-coated Plate注：a圖從左到右分別為V正己烷∶V乙酸乙酯=100∶0;90∶10;80∶20;70∶30;b圖從左至右分別為V正己烷∶V乙酸乙酯=98∶2;97∶3;96∶4;95∶5;94∶6;93∶7;92∶8。

圖3分析結(jié)果表明,以正己烷含量為92%～98%的正己烷-乙酸乙酯的混合溶劑作展開(kāi)劑時(shí),烯類物質(zhì)的展開(kāi)效果較好但是區(qū)別不大;考慮到硅膠在極性條件下較易發(fā)生溶脹,致使柱壓力過(guò)大的性質(zhì)[11],層析過(guò)程中適宜選用弱極性的溶劑,因此最終確定為V正己烷∶V乙酸乙酯=95∶5的溶液體系。(經(jīng)GC-MS檢測(cè)證明β-倍半水芹烯的顯色點(diǎn)為a點(diǎn),Rf值為0.8左右,該點(diǎn)在加熱顯色過(guò)程中揮發(fā))。

2.3硝酸銀硅膠柱層析法分離β-倍半水芹烯

量取8 mL烯類段洗脫液上樣,選用V正己烷∶V乙酸乙酯=95∶5的溶液體系洗脫,洗脫流速為2 mL/min左右。GC-MS法分析收集的β-倍半水芹烯峰值樣,所得質(zhì)譜圖如圖4所示,樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為:MS m/z(rel. int.):204.1(M+,29),161.0(63),162.1(9),133.0(44),134.0(9),120.0(39),119.0(26),109.0(31),93.0(60),92.0(39),91.0(58),76.9(38),68.9(100),54.9(20),所得結(jié)果與Teris A.等人分析的β-倍半水芹烯的質(zhì)譜結(jié)果[12]基本相同,由此確定該樣品所含物質(zhì)是β-倍半水芹烯,該峰值樣的總離子流圖如圖5所示,其含量見(jiàn)表β-倍半水芹烯峰值樣成分組成。

圖4　β-倍半水芹烯峰值樣品的質(zhì)譜圖Fig.4　Mass Spectrum of the β-sesquiphellandrene Sample

圖5　β-倍半水芹烯峰值樣品的總離子流圖Fig. 5　Total ion chromatogram of β-sesquiphellandrene peak sample

2.4β-倍半水芹烯的紫外吸收

將2.3中的峰值樣在不同波長(zhǎng)條件下進(jìn)行HPLC檢測(cè)(DAD檢測(cè)器),該峰值樣僅在232 nm下出現(xiàn)吸收峰,如圖6。分析結(jié)果表明,β-倍半水芹烯具有紫外吸收,其特征吸收波長(zhǎng)為232 nm,在1.2.1與1.2.5的分離條件下β-倍半水芹烯的峰面積百分含量可達(dá)93.39%。

圖6　β-倍半水芹烯峰值樣品的HPLC譜圖Fig.6　HPLC spectrums of the β-sesquiphellandrene peak sample

2.5β-倍半水芹烯收率的計(jì)算

利用表1中得到的β-倍半水芹烯峰面積計(jì)數(shù)和姜油樹(shù)脂的GC/MS分析數(shù)據(jù)[13],姜油樹(shù)脂中β-倍半水芹烯的AA為19138673,利用1.2.7中的計(jì)算公式計(jì)算其收率。在選定的分離條件下,共收集樣品約200 mL,其中含β-倍半水芹烯樣品約35 mL,最終計(jì)算其收率為84.05%。

表1　β-倍半水芹烯峰值樣成分組成Table 1　Components of β-sesquiphellandrene Product

3　結(jié)論

選用HPD-100大孔樹(shù)脂作固定相,90%的乙醇-水作流動(dòng)相,可以分離出姜油樹(shù)脂中的烯類物質(zhì),然后選用V正己烷∶V乙酸乙酯=95∶5的混合溶劑,采用硝酸銀硅膠柱能較完全的分離出其中的β-倍半水芹烯,其峰面積百分?jǐn)?shù)為88.73%,收率達(dá)84.05%,HPLC的分析結(jié)果證明β-倍半水芹烯在232 nm下具有紫外吸收。

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Separation ofβ-sesquiphellandrene from ginger oleoresin

ZHOU Chang-yuan1，WANG Yan2，DU Ai-ling3,*

(1.TaiEr zhuang Forestry Bureau of Zaozhuang Municipal,Zaozhuang 277400,China；2. Department of Bioengineering,Shandong Polytechnic,Ji’nan 250104,China；3. School of Chemistry and Chemical Engineering,Shandong University,Ji’nan 250061,China)

A ethanol-water solution was used as mobile phase,and the HPD-100 macroporous resin as the stationary phase to separate the vinyl part from ginger oleoresin extracted by supercritical carbon dioxide,and HPLC was used for detecting vinyls tracing. Different developing solvents of vinyls on argentated silica gel G pre-coated plate were compared,Vhexane∶Vethylacetate=95∶5 was determined as the mobile phase to sepatateβ-sesquiphellandrene. The GC/MS test results indicated that HPD-100 macroporous resin and silver nitrate modified silica gel were separately used as the stationary phase which could effectively separateβ-sesquiphellandrene from ginger oleoresin with 88.73% area percentage and 84.05% recovery. Through further HPLC analysis,β-sesquiphellandrene was found its existence of UV absorption at 232 nm.

silver nitrate modified silica gel;β-sesquiphellandrene;separation

2015-04-23

周長(zhǎng)遠(yuǎn)(1985-),男,碩士,研究方向：種質(zhì)資源創(chuàng)新與分子生物學(xué)研究,E-mail:fangfeiyuanfang@126.com。

杜愛(ài)玲(1956-),女,碩士,教授,研究方向：天然產(chǎn)物的提取分離等,E-mail:duailing56@163.com。

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2008GB2C600178)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0225-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.039