李　雄,郭　星,余　佩,徐　暉,林松毅

(吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130062)

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高壓脈沖電場技術(shù)改變抗氧化活性肽MMCTN的二級結(jié)構(gòu)的實驗研究

李雄,郭星,余佩,徐暉,林松毅*

(吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130062)

本研究以DPPH自由基清除能力為抗氧化活性衡量指標(biāo),利用雙因素實驗設(shè)計研究方法,探究了高壓脈沖電場(PEF)的電場強(qiáng)度(5、10、15、20 kV/cm)和脈沖頻率(1800、2400 Hz)兩個因素對抗氧化肽MMCTN的抗氧化活性的影響,并且考察了PEF處理后保留時間(0、2 h)對其抗氧化活性的作用;借助傅立葉紅外光譜技術(shù)(MIR)、圓二色譜技術(shù)(CD)分析了PEF處理對MMCTN的二級結(jié)構(gòu)影響情況。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)電場強(qiáng)度為10 kV/cm,脈沖頻率為2400 Hz,且PEF處理后保留2 h時,MMCTN的DPPH自由基清除能力最高,達(dá)到94.14%±0.13%;MIR光譜分析得知高壓脈沖電場處理的樣品功能團(tuán)發(fā)生了改變;CD色譜分析得知PEF處理后的樣品中α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲之間發(fā)生了相互的轉(zhuǎn)化。

高壓脈沖電場(PEF),DPPH自由基清除能力,傅立葉紅外光譜技術(shù)(MIR),圓二色譜技術(shù)(CD)

大豆抗氧化肽(Soybean antioxidant peptides)是由大豆蛋白水解產(chǎn)生的具有抗氧化功能的多種肽分子的混合物,具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等功能[1-2]。利用蛋白酶水解法、發(fā)酵法等方法可以制備出具有抗氧化活性的肽[3-4],對于氨基酸序列明確的肽段,可以通過化學(xué)固相合成得到高純度的抗氧化肽。

高壓脈沖電場(Pulsed electric field,簡稱PEF)是一種非熱加工技術(shù),在食品領(lǐng)域中,PEF技術(shù)多用于殺菌、功能因子提取、酶的激活等方面[5-6]。近年來,已有利用PEF技術(shù)提高抗氧化肽活性的相關(guān)研究。例如,2011年Lin等人[7]研究發(fā)現(xiàn)了PEF技術(shù)能夠提高蛋清源肽的抗氧化活性;2012年Wang等人[8]研究發(fā)現(xiàn)PEF技術(shù)能夠使分子量 10～30 ku蛋清源抗氧化肽的FRAP值增加到44.23%;2014年,Wang等人[9]借助PEF技術(shù)處理還原型谷胱甘肽的DPPH自由基清除率由81.83%增加到97.40%,然而,PEF技術(shù)提高抗氧化肽活性的機(jī)制并不明確。本研究以DPPH自由基清除能力為衡量指標(biāo),利用雙因素設(shè)計實驗,研究PEF技術(shù)對化學(xué)合成的氨基酸序列為蛋氨酸(Met)-蛋氨酸(Met)-半胱氨酸(Cys)-蘇氨酸(Thr)-天冬酰胺(Asn)的大豆源抗氧化五肽MMCTN的活性影響,并借助傅立葉紅外光譜技術(shù)(MIR)和圓二色譜(CD)分析方法,初步揭示PEF技術(shù)對抗氧化肽MMCTN的二級結(jié)構(gòu)影響與抗氧化活性之間的聯(lián)系,為探索PEF技術(shù)提高食源性功能肽的活性機(jī)理提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

MMCTN抗氧化肽上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成;DPPH(2,2-二苯基-1-苦肼基)、溴化鉀分析純,美國Sigma公司生產(chǎn);甲醇、氫氧化鈉、乙醇等試劑分析純,北京化工廠生產(chǎn)。

高壓脈沖電場裝置吉林大學(xué)殷涌光教授設(shè)計;RT-6000 酶標(biāo)儀美國雷杜 Rayto 酶標(biāo)儀有限公司;ZG-2 真空冷凍干燥機(jī)杭州創(chuàng)意真空冷凍干燥設(shè)備廠;IR Prestige-21傅里葉紅外光譜儀日本島津公司;Jasco J-810圓二色譜儀日本JASCO公司。

1.2實驗方法

1.2.1雙因素實驗方案設(shè)計雙因素實驗考察了電場強(qiáng)度、脈沖頻率對化學(xué)合成的抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除能力的影響,實驗設(shè)計方案如表1所示:

表1　雙因素實驗設(shè)計表Table 1　Design of Two-factor -at-a-time experiment

注:Aij為不同因素的處理水平。

1.2.2高壓脈沖電場(PEF)的處理在室溫環(huán)境下,將化學(xué)合成的抗氧化肽MMCTN用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為8 mg/mL的處理液,用蒸餾水和乙醇將物料泵及PEF系統(tǒng)管路清洗兩至三遍后,用物料泵抽取處理液,使處理液以3.2 mL/min的流速在電場處理裝置中循環(huán)流動。開啟電場裝置電源,將電場強(qiáng)度和脈沖頻率設(shè)至所需參數(shù),PEF處理時間為2～3 min,收集處理液,測定其PEF處理后,室溫保留0 h和2 h的抗氧化活性。

1.2.3DPPH自由基清除率測定方法參照文獻(xiàn)[10-11]所述方法進(jìn)行DPPH自由基清除率測定:在室溫環(huán)境下,將經(jīng)過PEF處理的化學(xué)合成的抗氧化肽MMCTN,向96孔板中依次加入100 μL測試液、100 μL甲醇及100 μL 0.6 mmol/L的DPPH甲醇溶液混合均勻,在室溫條件下避光反應(yīng)90 min,用酶標(biāo)儀在515 nm處測定其吸光度AS。相同條件下,用100 μL甲醇代替測試液作為空白對照,測定其吸光度AB,DPPH自由基清除率計算公式如下:

式中:AB為200 μL甲醇與100 μL DPPH甲醇溶液的吸光度;AS為100 μL測試液、100 μL甲醇與100 μL DPPH甲醇溶液的吸光度。

1.2.4中紅外光譜(MIR)測定方法依據(jù)Wang Ke等人[12]所選用的中紅外光譜分析方法,設(shè)置中紅外檢測器測試范圍為400～4000 cm-1,分辨率為4 cm-1。將溴化鉀在130 ℃環(huán)境下干燥5～8 h,以備壓片。將經(jīng) PEF處理后的化學(xué)合成的抗氧化肽MMCTN進(jìn)行真空冷凍干燥制成凍干粉。1 mg凍干粉和200 mg溴化鉀研磨混勻,壓片后作為處理樣,200 mg溴化鉀壓片作為空白樣,將處理樣和空白樣在處理室內(nèi)以 2.8 mm/s 的掃描速度自動識別,進(jìn)行背景掃描和基線校正后獲得 MIR 光譜圖。

1.2.5圓二色譜(CD)測定方法將圓二色譜儀測定的波長范圍設(shè)置為190～270 nm,樣品濃度為8 mg/mL,掃描速度100 nm/min,每個樣品重復(fù)掃描3次。用蒸餾水清洗兩次石英樣品池,再用經(jīng) PEF處理后的8 mg/mL化學(xué)合成的抗氧化肽MMCTN待測樣品溶液潤洗一遍,加入樣品至2/3處,將比色皿放入圓二色譜儀的樣品槽中進(jìn)行測量。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0(美國,芝加哥,SPSS公司)統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析、相關(guān)性分析。用獨立樣品的t檢驗差異顯著性檢驗,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示,顯著性水平為p<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1PEF處理對MMCTN的DPPH自由基清除率的影響

脈沖頻率為1800 Hz時,不同電場強(qiáng)度以及PEF處理后的保留時間對化學(xué)合成的抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率的影響情況如圖1所示。當(dāng)脈沖頻率為1800 Hz時,經(jīng)PEF處理后0 h測定化學(xué)合成抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率隨電場強(qiáng)度的變化較為顯著(p<0.05),當(dāng)電場強(qiáng)度從0 kV/cm增加到10 kV/cm時,DPPH清除率從92.68%±0.09%增加到93.01%±0.12%。當(dāng)電場強(qiáng)度為10 kV/cm時,DPPH的清除率達(dá)到最高值93.01%±0.12%。然而,當(dāng)電場強(qiáng)度從10 kV/cm增加到20 kV/cm 時,DPPH清除率從93.01%±0.12%下降到92.65%±0.10%,而經(jīng)PEF處理后2 h測定的化學(xué)合成抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率均達(dá)到93%以上,其中當(dāng)電場強(qiáng)度為10 kV/cm時,DPPH自由基的清除率達(dá)到最高值94.14%±0.13%。測定時間的不同導(dǎo)致的DPPH自由基清除率的不同可能是因為溶液的介電常數(shù)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致產(chǎn)生的電解質(zhì)更容易穿透細(xì)胞膜和結(jié)合活性肽。而在電場強(qiáng)度為10 kV/cm時,兩者都同時達(dá)到DPPH自由基清除率最高值。這個結(jié)果可能是因為肽分子內(nèi)存在極化結(jié)構(gòu),通過靜電力引起極化部位的互相吸引,造成結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,更易于活性部位發(fā)揮功能[13-14]。

圖1　電場強(qiáng)度、保留時間與DPPH自由基清除率的關(guān)系Fig.1　The relationship between electric field intensity, retention time and DPPH free radical clearance注:脈沖頻率為1800 Hz， 不同小寫字母代表差異性顯著(p<0.05)。

脈沖頻率為2400 Hz時,不同電場強(qiáng)度以及PEF處理后的保留時間對化學(xué)合成的抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率的影響情況如圖2所示。在脈沖頻率為2400 Hz時,抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率隨電場強(qiáng)度的變化同樣較為顯著(p<0.05),當(dāng)保留時間為2 h,電場強(qiáng)度從0 kV/cm增加到5 kV/cm時,DPPH自由基清除率從92.68%±0.07%增加到93.03%±0.03%。當(dāng)電場強(qiáng)度為5 kV/cm時,DPPH的清除率達(dá)到最高值93.03%±0.03%,顯著性地高于其他水平(p<0.05)。然而,當(dāng)電場強(qiáng)度從5 kV/cm增加到20 kV/cm 時,DPPH自由基清除率從93.03%±0.03%下降到92.64%±0.13%。而經(jīng)PEF處理后2 h測定的抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率均達(dá)到93%以上,其中,當(dāng)電場強(qiáng)度為5 kV/cm時,DPPH自由基的清除率達(dá)到最高值94.13%±0.05%。而電場強(qiáng)度相同的情況下,脈沖頻率為1800 Hz和2400 Hz時,DPPH自由基的清除率不同可能是脈沖頻率能夠影響肽分子的二級結(jié)構(gòu),從而影響了抗氧化肽MMCTN的DPPH自由基清除率。

圖2　電場強(qiáng)度、保留時間與DPPH自由基清除率的關(guān)系Fig.2　The relationship between electric field intensity, retention time and DPPH free radical clearance注:脈沖頻率為2400 Hz， 不同小寫字母代表差異性顯著(p<0.05)。

2.2MIR圖譜分析

MIR 對4000～400 cm-1范圍的光譜進(jìn)行了分析,并得到了MIR光譜圖。由圖3可以看出,經(jīng)過高壓脈沖電場處理的樣品與未處理的樣品相比較,其光譜的波動情況和未處理樣品大致相同,但是吸光度發(fā)生了一些變化。圖3A顯示高壓脈沖條件為脈沖頻率1800 Hz,電場強(qiáng)度為5 kV/cm時,其吸光度變大,而電場強(qiáng)度為20 kV/cm時,其吸光度降低。圖3B顯示高壓脈沖條件為脈沖頻率2400 Hz,電場強(qiáng)度為5和15 kV/cm時,其吸光度比變大,而電場強(qiáng)度為10 kV/cm時,其吸光度降低。

圖3　PEF處理樣品的MIR光譜圖Fig.3　The MIR spectra of PEF treated sample注：A：PEF脈沖頻率為1800 Hz； B：PEF脈沖頻率為2400 Hz，圖4同。

PEF處理后的MMCTN的基團(tuán)變化如表2所示。在未經(jīng)電場處理的樣品中存在-NH2和-NH(3400～3100 cm-1)吸收峰,-NH2(1650～1560 cm-1)吸收峰,O-H(3300～2500 cm-1)吸收峰,飽和C-H(3000～2800 cm-1)吸收峰,不飽和C-H(>3000 cm-1)吸收峰,-C=O(1850～1600 cm-1)吸收峰,C=C(1680～1620 cm-1)吸收峰,C-N(1360～1180 cm-1)吸收峰,C=S(1250～1000 cm-1)吸收峰,S=O(1220～1040 cm-1)吸收峰,酰胺帶(1700～1600 cm-1)吸收峰,-NO2(1600～1500 cm-1和1300～1250 cm-1)吸收峰,C-O-C(1150～900 cm-1)吸收峰,S-S(550～430 cm-1)吸收峰,C-O(1300～1000 cm-1)吸收峰,-NH2(1650～1560 cm-1)吸收峰,苯環(huán)(900～690 cm-1)吸收峰。當(dāng)高壓脈沖電場的脈沖頻率固定在1800 Hz時,當(dāng)電場強(qiáng)度為5、10、15、20 kV/cm時,處理后的樣品相比為處理樣品缺少了C-O和-NH2吸收峰。當(dāng)脈沖頻率固定在2400 Hz時,經(jīng)電場強(qiáng)度5 kV/cm處理的樣品,其吸收峰未發(fā)生改變;電場強(qiáng)度為10 kV/cm時,缺失了S-S吸收峰;電場強(qiáng)度為15 kV/cm時,缺失了-NO2和C-O吸收峰;電場強(qiáng)度為20 kV/cm時缺失了S-S,C-O和苯環(huán)吸收峰。

表2　PEF處理的MMCTN中紅外分析結(jié)果Table 2　Functional groups of PEF treated MMCTN analyzed by MIR

注:“+”代表樣品中存在相應(yīng)基團(tuán),“-”代表不存在。

經(jīng)過高壓脈沖電場處理的樣品其MIR光譜并無明顯的差異,但其吸光度和吸收峰發(fā)生了細(xì)微變化,高壓脈沖電場改變MMCTN化學(xué)合成抗氧化肽的活性,可能是由于這些變化引起的。

2.3CD圖譜分析

經(jīng)過PEF處理的抗氧化肽MMCTN測得的CD圖譜如圖4所示。圖4A展示了脈沖頻率固定在1800 Hz,不同電場強(qiáng)度下抗氧化肽MMCTN的CD圖譜,從該圖可以看出經(jīng)PEF處理的抗氧化肽MMCTN在240～260 nm處有一個負(fù)的吸收峰,且CD圖譜的譜線大致重合,說明PEF處理后的抗氧化肽MMCTN,其二級結(jié)構(gòu)的種類并未發(fā)生變化。脈沖頻率固定在2400 Hz時,不同電場強(qiáng)度下抗氧化肽MMCTN的CD圖譜如圖4B所示,同樣,經(jīng)PEF處理的抗氧化肽MMCTN在240～260 nm處有一個負(fù)的吸收峰,且其二級結(jié)構(gòu)的種類并未發(fā)生變化。

圖4　PEF處理的抗氧化肽MMCTN的CD圖譜Fig.4　The CD spectra of PEF treated sample

PEF處理的MMCTN的CD圖譜分析結(jié)果如表3所示。未經(jīng)PEF處理的抗氧化肽MMCTN含有α螺旋,β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲三種二級結(jié)構(gòu),其百分比分別占12.5%,33.1%,54.4%。經(jīng)過不同電場強(qiáng)度的PEF處理的抗氧化肽MMCTN,其二級結(jié)構(gòu)的種類并未發(fā)生變化,但是含量發(fā)生了改變。當(dāng)脈沖頻率為1800 Hz,電場強(qiáng)度為20 kV/cm時,α螺旋的含量降低到7.9%,而經(jīng)其他PEF條件處理的樣品α螺旋的含量均得到了提高。脈沖頻率為2400 Hz,電場強(qiáng)度為10 kV/cm時,抗氧化肽MMCTN中出現(xiàn)了8.4%的β折疊,而其他處理樣品以及未經(jīng)處理的抗氧化肽MMCTN中并未發(fā)現(xiàn)該二級結(jié)構(gòu)。當(dāng)脈沖頻率固定在2400 Hz,電場強(qiáng)度為10 kV/cm時,處理樣品的β轉(zhuǎn)角含量有所下降;電場強(qiáng)度為15 kV/cm時,處理樣品的β轉(zhuǎn)角含量沒有變化;而其他樣品的β轉(zhuǎn)角含量有所增加。經(jīng)脈沖頻率1800 Hz,電場強(qiáng)度為20 kV/cm處理的樣品,其無規(guī)則卷曲的含量增加了2.7%,而其余PEF處理的樣品無規(guī)則卷曲的含量均減少了。因此可以發(fā)現(xiàn),經(jīng)PEF處理的抗氧化肽MMCTN的二級結(jié)構(gòu)之間發(fā)生了轉(zhuǎn)化,或許這是由于經(jīng)PEF處理時,強(qiáng)大的電場力造成的,而這些二級結(jié)構(gòu)間的相互轉(zhuǎn)化是否會影響抗氧化肽MMCTN的活性需要進(jìn)一步的研究證明。

表3　PEF處理的MMCTN的CD圖譜分析結(jié)果(%)Table 3　Results of PEF treated MMCTN analyzed by CD(%)

3　結(jié)論

本研究借助雙因素實驗設(shè)計的方法,對抗氧化肽MMCTN進(jìn)行PEF處理,獲知當(dāng)電場強(qiáng)度為10 kV/cm,脈沖頻率為2400 Hz,且PEF處理后保留2 h時,MMCTN的DPPH自由基清除能力最高,達(dá)到94.14%±0.13%。經(jīng)MIR光譜和CD色譜分析,高壓脈沖電場改變MMCTN化學(xué)合成抗氧化肽的活性,可能是處理后的樣品中功能基團(tuán)有一定的改變,其α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲之間相互轉(zhuǎn)化引起的。本研究為探索PEF技術(shù)提高食源性功能肽的活性機(jī)理提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

[1]Yamaguchin,Naitos,Yokooye. Oxidative stabilit of dried model food consisted of soybean protein hydrolyzed and lard[J]. Nippon ShokuhIG akaishi,1980,27(2):51-55.

[2]Chemhm,Muramotok,Yamauchi,et al. Analysiso antioxidative peptides from soybean B-conglycin[J]. Agricultural Food Chemistry,1995,43(3):574-578.

[3]Bishov S J,Henick A S. Antioxidant effect of protein hydrolysates in a freeze-dried model system[J]. Food Science,1972,37:873-875.

[4]Chen H M,Muramoto K,Yamauchi F. Structural analysis ofantioxidative peptides from soybeanβ-conglycinin[J]. Agric Food Chemistry,1995,43:574-578.

[5]殷涌光,閆琳娜,李玉娟. 用高壓脈沖電場對桃汁非熱殺

菌的研究[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報,2006,37(8):89-92.

[6]劉錚,楊瑞金,趙偉. 高壓脈沖電場破壁法提取廢啤酒酵母中的蛋白質(zhì)與核酸[J]. 食品工業(yè)科技,2007,28(3):85-88.

[7]Lin S Y,Guo Y,Liu J B,et al. Optimized enzymatic hydrolysis and pulsed electric field treatment for production of antioxidant peptides from egg white protein[J]. African Journal of Biotechnology,2011,10(55):11648-11657.

[8]Wang K,Wang J,Zhao P,et al,Optimized PEF treatment for antioxidant polypeptides with MW 10-30 kDa and preliminary analysis of structure change[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2012,51(5):819-825.

[9]Wang J,Wang K,Wang Y,et al. A novel application of pulsed electric field(PEF)processing for improving glutathione(GSH)antioxidant activity[J]. Food Chemistry,2014,161:361-366.

[10]王佳. 大豆源抗氧化肽活性組分優(yōu)選與其生物學(xué)評價[D]. 長春:吉林大學(xué),2014,(6):13-14.

[11]王可.電子束輻照技術(shù)輔助提高玉米蛋白粉酶解效果[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2014,30(22):300-308.

[12]王可.玉米蛋白資源高效利用開發(fā)抗氧化肽的關(guān)鍵技術(shù)研究[D]. 長春:吉林大學(xué),2014.

[13]于志鵬. 蛋清源活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究[D]. 長春:吉林大學(xué),2014.

[14]李成偉. 幾種β-多膚的合成與二級結(jié)構(gòu)分析[D]. 上海:華東師范大學(xué),2009.

Secondary structure of MMCTN treated by pulsed electric field(PEF)technology

LI Xiong,GUO Xing,YU Pei,XU Hui,LIN Song-yi*

(College of Food Science and Technology,Jilin University,Changchun 130062,China)

DPPH radical scavenging capacity was used as measuring indices of antioxidant activity In this research. Two-factor-at-a-time experiment was used to investigate the pulsed electric field(PEF)effects on antioxidant activity of MMCTN and the two factors were electric filed intensity(5,10,15,20 kV/cm)and pulse frequency(1800,2400 Hz). And the effects of retention time(0,2 h)after PEF treatment on antioxidant activity were investigated. Then,mid-infrared spectroscopy(MIR)and circular dichroism spectrum(CD)were used to analyze the secondary structure changes of PEF treated MMCTN. The results showed that when the electric filed intensity was 10 kV/cm,pulse frequency was 2400 Hz and retention time was 2 h,the DPPH radical scavenging capacity was up to 94.14%±0.13%. The MIR showed that the functional groups of PEF treated samples were changed and the CD indicated thatαhelices,βstrands,βturn and random coil were interconverted.

Pulsed electric field(PEF);DPPH radical scavenging capacity;Mid-infrared spectroscopy(MIR);Circular dichroism spectrum(CD)

2015-06-03

李雄(1995-),男,本科,研究方向:營養(yǎng)與功能性食品,E-mail:980066308@qq.com。

林松毅(1970-),女,博士,教授,研究方向:營養(yǎng)與功能性食品,E-mail:linsongyi730@163.com。

國家”十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD33B03);吉林大學(xué)本科生2015年度創(chuàng)新訓(xùn)練國家級培育項目(2015831277)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)03-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.006