高 磊，趙勝杰，路緒強，何 楠，朱紅菊，豆峻嶺，張 莉，劉文革

（中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009）

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.&Na?kai]是一年生蔓性草本植物，屬于葫蘆科西瓜屬。因其營養(yǎng)豐富，味甜多汁，是夏季消暑解渴的佳品，有夏季“水果之王”的美譽，在世界園藝產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織2014年統(tǒng)計，世界上西瓜的種植面積達到了蔬菜種植面積的9.5%。

隨著人們生活水平的提高，消費者對西瓜的品質(zhì)提出了更高要求，因此培育優(yōu)質(zhì)的西瓜品種，滿足人們的消費需求就顯得尤為重要。西瓜果實品質(zhì)主要包括商品品質(zhì)、感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等方面。有機酸的組分與含量是影響果實品質(zhì)的重要因素，對果實的營養(yǎng)品質(zhì)和代謝起重要作用［1-2］。同時有機酸對人體有重要的營養(yǎng)價值，蘋果酸具有天然香味，口味柔和，有利于人體氨基酸吸收；而檸檬酸則具有溫和爽快的酸味，可以增進食欲，并促進體內(nèi)對鈣、磷的吸收。隨著人們生活習慣的改變，不同的消費者對酸甜口味有不同的偏好，當果實的含糖量較高時，酸含量較高的果實更受喜愛［3］。新疆農(nóng)業(yè)科學院哈密瓜研究中心已成功培育出一系列酸甜可口的風味甜瓜品種，具有廣闊的應(yīng)用前景［4］。而目前種植的西瓜作物基本上是以甜味為主的品種，具有酸甜口味的西瓜品種尚處于市場上的空白期，因此培育酸甜可口的西瓜新品種，來彌補市場空缺，調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，就成為擺在西瓜育種家面前的一項重要任務(wù)。要達到這一目的，首先就需要了解西瓜果實有機酸含量形成的生物學基礎(chǔ)。

果實有機酸含量是復(fù)雜的數(shù)量性狀，主要受遺傳因素的控制，同時受自然環(huán)境和栽培措施等因素的共同影響。甜瓜果實中的有機酸主要以檸檬酸為主，還含有蘋果酸、琥珀酸等［5］。張紅［6］研究認為甜瓜果實總酸含量和酸度（pH）受一對主基因+多基因混合遺傳模型控制，而檸檬酸含量則主要受兩對主基因+多基因混合遺傳模型控制。針對西瓜果實中有機酸相關(guān)方面的研究不多，主要集中在成熟西瓜果實中有機酸的種類和含量，且結(jié)果也不一致。西瓜成熟果實中的有機酸含量總體偏少，主要成分是蘋果酸和檸檬酸，同時還含有少量的甲酸［7］。也有研究者認為成熟西瓜果實中的有機酸主要是蘋果酸和檸檬酸，還有微量的琥珀酸和富馬酸［8-9］。同時又有研究者認為西瓜果實中的有機酸主要是蘋果酸和酒石酸［10-11］。因此可將西瓜歸結(jié)為蘋果酸積累型果實。

由于受西瓜種質(zhì)資源的利用限制，使得對西瓜果實有機酸的研究較少，因此尚未見到與西瓜果實有機酸相關(guān)的分子生物學方面的報道。本試驗通過連續(xù)多代回交和SSR分子標記研究對BC7F1世代進行果實酸味株系基因型分析，所獲得的與有機酸含量相關(guān)的導入系群體，其酸味能穩(wěn)定遺傳，是研究有機酸合成復(fù)雜性狀的良好材料，為有機酸合成途徑關(guān)鍵基因的精細定位和克隆奠定基礎(chǔ)，同時也豐富了西瓜的種質(zhì)資源類型，有助于選育酸甜風味的西瓜新品種。

1 材料與方法

1.1 供試材料及群體構(gòu)建

試驗材料‘203Z’為中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所多倍體西瓜課題組經(jīng)過多代自交的西瓜栽培品系（C.lanatus ssp.vulgaris），果實中心可溶性固形物含量11.5%左右，pH值6.5左右；‘PI 271769’為非洲野生西瓜（C.lanatus ssp.lanatus），果實中心可溶性固形物含量4.0%左右，pH值4.6左右。以‘203Z’為母本、‘PI 271769’為父本雜交獲得 F1代，再以‘203Z’為輪回親本，經(jīng)過7代連續(xù)回交，在BC7F1世代發(fā)現(xiàn)了果實具有酸味的西瓜株系。田間試驗于2011年3月至2015年7月在河南省中牟縣和新鄉(xiāng)縣試驗基地進行。除野生西瓜外，所有試驗材料均以‘新土佐’南瓜為砧木，采用嫁接吊蔓栽培，單蔓整枝，第2雌花留單瓜，在大棚內(nèi)按常規(guī)栽培方式進行管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取及DNA低pH、高pH池的構(gòu)建 利用改良的CTAB法[13]提取西瓜幼苗基因組DNA，用核酸蛋白檢測儀及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)BC7F1世代果實酸味pH值鑒定結(jié)果，分別選取10個果實低 pH 值（4.71～5.02）和高 pH 值（6.16～6.49）的單株DNA樣品等量進行混合，構(gòu)建DNA低pH池和DNA高pH池，用于SSR標記分析。

1.2.2 SSR標記分析 試驗選取的SSR引物[14]，由上海博彩生物科技有限公司合成。PCR擴增反應(yīng)體系為 10 μL，包含 0.5 μL 模板 DNA（50 ng·μL-1），正向和反向引物各 0.6 μL（10 μmol·L-1），1 μL 10×buffer，0.2μL dNTP（10 mmol·L-1），0.1 μL Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1），7 μL 去離子水。擴增程序為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 20 s，50～60℃（根據(jù)不同引物確定不同退火溫度）退火20 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物在4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后照相進行帶型統(tǒng)計，與供體親本‘PI 271769’帶型一致的記為 A，與輪回親本‘203Z’帶型一致的記為B，兩親本均有的帶型記為H。

1.2.3 西瓜中心果肉pH調(diào)查 果實成熟收獲后，沿縱軸平均切成兩半取中心瓜瓤進行勻漿，采用酸度計測其pH值；中心瓜瓤用液氮保存，用作果實有機酸含量的測定。

1.2.4 有機酸組分含量的測定 有機酸組分的提取參照王軒［12］的方法改進后進行。準確稱取5 g試樣（鮮質(zhì)量），加入25 mL去離子水，80℃水浴提取30 min，冷卻，定容至50 mL，過濾，取5 mL依次過Dionex OnGrard II1cc Cartridge固相萃取小柱和0.22 μm孔徑濾膜。濾液上離子色譜測定，在中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所農(nóng)業(yè)部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心進行。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 每個表型數(shù)據(jù)取3次平均值，采用SPSS 16.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析；利用Graphical GenoTypes（GGT）軟件進行世代基因型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本多態(tài)性引物的篩選

選取在西瓜11條染色體上均勻分布的185對SSR引物對輪回親本‘203Z’、供體親本‘PI 271769’及F1代進行多態(tài)性篩選（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)有97對引物在兩個親本材料之間出現(xiàn)多態(tài)性差異，多態(tài)率為52.4%，且多為共顯性標記，說明兩個親本材料之間遺傳基礎(chǔ)差異較大。

圖1 部分SSR標記在兩個親本及F1上的擴增結(jié)果

2.2 西瓜果實中心部位有機酸含量分析

在BC7F1世代，對果實性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)有果實酸味的材料，選擇其中的10個單瓜進行有機酸含量測定（表1）?？梢钥闯?，西瓜果實中心部位的pH值變化范圍為4.70～5.02；有機酸主要是蘋果酸，平均質(zhì)量分數(shù)為 3.708 mg·g-1，變化范圍為 2.591～4.538 mg·g-1；其次是檸檬酸，平均質(zhì)量分數(shù)為0.538 mg·g-1，蘋果酸和檸檬酸構(gòu)成了西瓜果實的主要有機酸，占絕大比例；此外還有少量的甲酸、乳酸、琥珀酸及富馬酸。果實酸味株系與輪回親本‘203Z’相比，盡管‘203Z’有較高的檸檬酸含量，但酸味果實株系有較低的pH值和特別高的蘋果酸含量，推測有供體親本的染色體片段已滲入到BC7F1世代果實酸味的單株中。

表1 親本及BC7F1世代部分果實酸味單株有機酸含量

2.3 BC7F1世代SSR篩選

選擇在親本之間具有多態(tài)性的97對SSR引物在‘203Z’、‘PI 271769’和通過 BC7F1世代單株構(gòu)建的低pH、高pH池中進行篩選，結(jié)果有4對SSR標記（表2）在低pH、高pH池之間出現(xiàn)差異條帶，其中在低pH池中擴增出來的為雜合帶型，而在高pH池中擴增出來的帶型與輪回親本‘203Z’一致。

表2 在低pH與高pH池之間具有差異條帶的SSR引物序列

圖2 BC7F1世代單株3-10基因型分析

2.4 BC7F1單株基因型分析

選擇BC7F1世代果實酸味株系中的其中一個單株3-10進行基因型分析（圖2），可以發(fā)現(xiàn)：在西瓜的第6和第10染色體上存在2條不同長度的來源于供體親本‘PI 271769’的外源片段，長度分別為3.65 cM和8.80 cM，且為雜合片段，外源片段總長度為12.45 cM，而構(gòu)建的圖譜總長度為772.8 cM，背景回復(fù)率為98.4%，而理論上BC7世代背景回復(fù)率為99.2%。

2.5 BC7F1世代果實酸味株系基因型比較分析

通過對選擇的BC7F1世代10個果實酸味株系的基因型進行比較（圖3），可以看出：每個單株存在2～4個不等的外源野生片段，有6個以上的不同單株在西瓜的第2、第6和第10染色體上都存在外源野生片段，獲得了由野生西瓜‘PI271769’為供體親本，栽培種西瓜‘203Z’為輪回親本的高代回交導入系群體。

圖3 BC7F1世代10個果實酸味株系基因型比較

3 討論

本試驗以栽培種西瓜‘203Z’為輪回親本、野生西瓜‘PI 271769’為供體親本，通過離子色譜法，檢測到兩個親本及BC7F1世代個體中成熟果實中心部位的有機酸主要為蘋果酸，其次是檸檬酸，此結(jié)果與王堅［7］、Dune［8］、劉景安［9］的研究結(jié)果相一致。但也有研究認為［10-11］，西瓜成熟果實中的有機酸主要為蘋果酸和酒石酸，推測造成這種差異的原因可能是試驗材料的不同。劉慧英［10］還詳細研究了不同嫁接西瓜與自根西瓜果實動態(tài)發(fā)育中有機酸組分的變化規(guī)律，認為嫁接西瓜與自根西瓜相比，在發(fā)育后期有機酸含量降低。本試驗中除野生西瓜‘PI 271769’外，均進行嫁接栽培，對‘203Z’和 BC7F1世代個體有機酸含量的測定不會造成影響，所以BC7F1世代個體和‘203Z’相比，有機酸含量較高是有意義的。

BC7F1世代的10個單株其果實與輪回親本‘203Z’相比，pH值偏低，蘋果酸和檸檬酸含量較高，其他可測性狀基本一致，并且西瓜果實有機酸含量呈現(xiàn)連續(xù)變異的特點，屬于典型的數(shù)量性狀，是由多個基因共同控制有機酸的合成，因此可以推測BC7F1世代果實酸味株系中滲入的一個或多個外源野生片段存在著控制西瓜果實有機酸合成的關(guān)鍵基因。

通過連續(xù)多代回交獲得的導入系群體，其遺傳背景與輪回親本較一致，只含有少量的外源片段，消除了大部分遺傳背景的干擾，是進行目標基因精細定位的良好材料。目前已通過構(gòu)建導入系群體對多個植物的重要農(nóng)藝性狀基因進行了精細定位和克?。?5-17］。本試驗連續(xù)回交7代，獲得了只在有機酸含量方面有差異的導入系群體，對有機酸合成途徑關(guān)鍵基因的精細定位和克隆提供了良好的試驗材料，同時也為開發(fā)利用野生酸西瓜的優(yōu)異基因提供了良好的種質(zhì)資源。

隨著西瓜全基因組測序的完成［18］和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已構(gòu)建了多張有關(guān)西瓜的高密度遺傳連鎖圖譜［19-21］，對西瓜重要的復(fù)雜農(nóng)藝性狀的研究具有重要意義。本試驗利用分布在西瓜11條染色體上的97對SSR標記構(gòu)建了含有772.8 cM的遺傳連鎖圖譜，沒有完全覆蓋整個西瓜基因組，同時在某些標記之間遺傳距離較大，可能會遺漏某些目標外源片段。獲得含有供體親本的外源片段距離較大，候選基因太多，還無法確定哪些關(guān)鍵基因與有機酸的合成途徑有關(guān)，這需要進一步縮短外源片段的長度，對目標基因進行精細定位。

通過對兩個親本進行重測序，可以開發(fā)新的分子標記來增加標記的數(shù)量，構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合已構(gòu)建好的導入系群體，從而實現(xiàn)西瓜果實有機酸合成關(guān)鍵基因的精細定位和克隆，解析這一復(fù)雜性狀，同時利用這一具有酸味的西瓜創(chuàng)新種質(zhì)資源，選育具有酸甜風味的西瓜新品種，更好地為西瓜生產(chǎn)者和消費者提供服務(wù)。