徐建軍，張?jiān)戚x，顧 嘯，姚麒麟*（上海市松江區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，上?！?6；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，南京　004）

水稻半矮稈基因sd1功能標(biāo)記的開發(fā)與利用

徐建軍1，張?jiān)戚x2，顧 嘯1，姚麒麟1*
（1上海市松江區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，上海201611；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，南京210014）

開發(fā)利用已克隆的水稻株高相關(guān)基因的分子標(biāo)記用于分子育種，對(duì)水稻理想株型的育種具有十分重要的意義。通過(guò)開發(fā)水稻半矮稈基因sd1的功能標(biāo)記，利用該標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外99份水稻品種的sd1基因位點(diǎn)進(jìn)行了分子檢測(cè)，為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了有利工具。

水稻；sd1；功能標(biāo)記；分子標(biāo)記輔助選擇

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約有50%以上的人口以稻米為主食。20世紀(jì)60年代，在世界范圍內(nèi)，半矮稈基因sd1的利用使水稻育種發(fā)生了革命性變化，水稻產(chǎn)量得到了大幅度提高，被稱為第一次“綠色革命”。爾后，大量的矮稈基因被不斷挖掘利用，給水稻生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

在當(dāng)前的水稻理想株型育種中，株高仍然是備受關(guān)注的性狀之一。選育株高適中的水稻品種，一方面能夠優(yōu)化株型，提高收獲指數(shù)，降低秸稈還田的壓力；另一方面能夠提高耐肥性和抗倒能力。目前，在水稻理想株型育種中，應(yīng)用最廣泛的株高基因仍然是半矮稈基因sd1。sd1基因位于在水稻第1染色體長(zhǎng)臂末端。石春海等［1］通過(guò)田間性狀調(diào)查，結(jié)果表明sd1在抑制節(jié)間伸長(zhǎng)的同時(shí)，還可以促進(jìn)有效穗數(shù)、結(jié)實(shí)率和收獲指數(shù)的提高，且不影響抽穗天數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重。SASAKI等［2］、MONNA等［3］、MADOKA等［4］、SPIELMEYER等［5］從分子水平揭示了sd1水稻株高降低而產(chǎn)量不受影響的原因。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇育種為傳統(tǒng)育種注入了新的活力。與傳統(tǒng)育種的單一表型選擇相比，分子標(biāo)記輔助選擇育種具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)。開發(fā)與sd1基因緊密連鎖或基因內(nèi)的分子標(biāo)記，將為水稻株高的改良提供有利工具。截至目前，EUN等［6］、CHO等［7］、OGI等［8］、王松文等［9］開發(fā)了一些與sd1基因連鎖的分子標(biāo)記；但是，sd1基因內(nèi)標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用還未見報(bào)道。本研究將開發(fā)sd1基因內(nèi)分子標(biāo)記，為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供工具。

1　材料與方法

1.1供試材料及水稻DNA的提取

供試材料為來(lái)源于國(guó)內(nèi)外的99份水稻品種。其中秈稻11份，粳稻88份；國(guó)外28份，國(guó)內(nèi)71份；國(guó)外品種主要來(lái)自朝鮮、韓國(guó)和日本，分別為3份、5份和20份；國(guó)內(nèi)品種主要來(lái)源于江蘇、黑龍江、河南、四川等省。在水稻分蘗盛期，剪取新鮮葉片，采用CTAB法提取DNA［10］。

1.2分子標(biāo)記開發(fā)

分子標(biāo)記開發(fā)基于日本晴序列，借助Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)InDel分子標(biāo)記。

1.3分子標(biāo)記分析

PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25μL PCR反應(yīng)體系：2.5μL模板DNA（1 ng/μL），正反引物各1.25μL （0.1μmol/L），2.5μLdNTPs（0.25 mmol/L），2.5μL 10×Buffer（不含Mg2+），2.5μL 25 mmol/L Mg2+，0.2μL Taq酶（5 U/μL），12.3μLddH2O。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，接著94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，33個(gè)循環(huán)后72℃補(bǔ)充延伸10 min，最后4℃保溫。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)3.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，利用UVP凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1sd1基因內(nèi)分子標(biāo)記的開發(fā)

根據(jù)RGP（Ricegenome annotation project）基因注釋，sd1基因在‘日本晴’序列圖譜對(duì)應(yīng)的位置是38381423-38384165 bp（5’-3’）。利用sd1基因的序列，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站與‘9311’序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因在這2個(gè)測(cè)序品種之間，存在383 bp的插入缺失。利用該插入缺失，基于‘日本晴’序列，借助Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)了1對(duì)InDel分子標(biāo)記。標(biāo)記命名為：InDel-sd1。標(biāo)記序列為，F(xiàn)：5’AGCTGGACATGCCCGTGGTC 3’，R：5’TTGAGCTGCTGTCCGCGAAG 3’。‘日本晴’PCR產(chǎn)物為606 bp，‘9311’的PCR產(chǎn)物為223 bp。

2.2InDel-sd1的分析

以水稻品種‘日本晴’和‘9311’為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳和 UVP凝膠成像系統(tǒng)成像，對(duì)分子標(biāo)記InDel-sd1進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，分子標(biāo)記InDel-sd1條帶清晰，PCR產(chǎn)物大小準(zhǔn)確，為共顯性標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確區(qū)分‘日本晴’和‘9311’兩個(gè)品種sd1基因位點(diǎn)的基因型。前人研究表明‘9311’的sd1基因位點(diǎn)為突變型，隱性半矮稈基因型，‘日本晴’sd1位點(diǎn)為野生型，顯性高稈基因型［11］。所以，本標(biāo)記能夠準(zhǔn)確區(qū)分這兩種基因型，為該標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了有力的工具。

2.3InDel-sd1的應(yīng)用

圖1　InDel-sd1的電泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of InDel-sd1

利用分子標(biāo)記InDel-sd1，對(duì)上述99份水稻品種的sd1基因位點(diǎn)進(jìn)行了基因型分析。結(jié)果表明：‘9311’‘南粳35’‘02428’‘關(guān)東98’‘明之星’‘九稻3號(hào)’‘水原264’‘密陽(yáng)23’‘當(dāng)育3號(hào)’‘皖稻77’‘川米2號(hào)’‘川新糯’‘內(nèi)中124’等13份水稻品種的sd1基因位點(diǎn)與‘9311’一致，為突變型。其中，粳稻5份，秈稻8份。部分水稻品種的基因型分析結(jié)果如圖2。其余86份水稻品種的sd1基因位點(diǎn)為與‘日本晴’一致，為野生型。

3　結(jié)論與討論

EUN等［6］、CHO等［7］開發(fā)了與sd1基因連鎖的分子標(biāo)記，并利用它們進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。OGI等［8］開發(fā)了1個(gè)與sd1基因緊密連鎖的RFLP標(biāo)記。王松文等［9］開發(fā)了2個(gè)基于PCR的sd1基因緊密連鎖的標(biāo)記，分別于sd1基因的遺傳距離為4.4 cM和9.01 cM。但是，上述開發(fā)的標(biāo)記均為連鎖標(biāo)記，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，由于重組事件的發(fā)生，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的偏差。截至目前，sd1基因內(nèi)標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用還未見報(bào)道。本研究基于測(cè)序品種‘9311’和‘日本晴’，開發(fā)了半矮稈基因sd1的基因內(nèi)分子標(biāo)記，為理想株型的分子育種提供了有用工具。本研究開發(fā)的基于PCR的基因內(nèi)分子標(biāo)記，檢測(cè)方法方便快捷，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，比前人開發(fā)的連鎖標(biāo)記更具應(yīng)用價(jià)值。

本研究利用新開發(fā)的分子標(biāo)記，檢測(cè)了99份來(lái)源于國(guó)內(nèi)外的水稻品種，一方面驗(yàn)證了新標(biāo)記的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，另一方面明確了‘9311’等13份水稻品種的sd1基因位點(diǎn)為突變型，為理想株型育種提供了材料基礎(chǔ)。

圖2　22個(gè)水稻品種　sd1基因位點(diǎn)的基因型分析Fig.2　Genotype analysis ofsd1gene loci of 22 rice varieties

［1］石春海，申宗坦.水稻半矮稈基因sd1對(duì)農(nóng)藝性狀的影響［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，1996（1）：13-18.

［2］SASAKI A，ASHIKARI M，UEGUCHI-TANAKA M，et al.A mutantgibberellin-synthesisgene in rice［J］.Nature，2002，416：701-702.

［3］MONNA L，KITAZAWA N，YOSHINO R，et al.Positional Cloning of Ricesemidwarfinggene，sd-1：Rice“Green Revolutiongene”Encodes a Mutant Enzyme Involved ingibberellinsynthesis［J］.DNA Research，2002，9（1）：11-17.

［4］MADOKA A，TAKAHIRO K，MIKIKO K，et al.Gibberellin biosynthesis andsignal transduction is essential for internode elongation indeepwater rice［J］.Plant，Cell&Environment，2014，37（10）：2313-2324.

［5］SPIELMEYER W，ELLIS M H，CHANDLER P M.Semidwarf（sd-1），“green revolution”rice，contains adefectivegibberellin 20-oxidasegene ［J］.Proceedings of the National Academy ofsciences，2002，99（13）：9043-9048.

［6］EUN M Y，CHO Yg，CHUNG TY.Molecular markers linked tightly withsemidwarf（sd-1）character andshattering habits in rice［J］.Koreansoc Mol Biol，1991，4：182-185.

［7］CHO Yg.Genetics of esterase isozymes and RFLP markers，and their linkage with asemidwarfgene（sd-1）in rice（Oryzasativa L.）［D］.seoul：Seoul National University，Republic of Korea，1992.

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［9］王松文，施利利，王妮妮，等.水稻sd-1基因分子標(biāo)記的建立［J］.天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，7（2）：52.

［10］PANAUD O，CHEN X，MCCOUCHs R.Development of microsatellite makers and characterization ofsimplesequence length polymorphism （SSLP）in rice（Oryzasativa L.）［J］.Molgengenet，1996，252：597-607.

［11］陳仁霄，張所兵，朱鎮(zhèn)，等.秈稻9311HR-T顯性高稈基因的初步定位［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24（5）：553-558.

（責(zé)任編輯：張睿）

Development and application of co-segregated marker forsemi-dwarfgenesd1 in rice（Oryzasativa L.）

XU Jian-jun1，ZHANG Yun-hui2，GU Xiao1，YAO Qi-lin1*
（1Songjiang Agricultural Technology and Popularization Center ofshanghai，Shanghai 201611，China；2Institute of Food Crops of Jiangsu Academy of Agriculturalsciences，Nanjing 210014，China）

Development and application of molecular markers for cloned plant height relatedgenes is ofgreatsignificance in rice breeding for ideal plant type.A co-segregated functional marker ofsemi-dwarfgenesd1 in rice wasdeveloped，and thesd1 locus of 99 rice varieties at home and abroad wasdetected by the marker.The results provided favorable tools for marker assistedselection breeding in rice.

Rice；sd1；Functional marker；MAS

S511

A

1000-3924（2016）04-022-03

2015-06-08

上海市科技興農(nóng)“農(nóng)業(yè)種植資源創(chuàng)新與良種良法配套技術(shù)集成應(yīng)用”項(xiàng)目“地方特色品種資源開發(fā)應(yīng)用”課題［滬農(nóng)科種字（2014）第3-1號(hào)］

徐建軍（1983—），男，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向：農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣。Tel：021-57866226；E-mail：rilitianlang991983@163.com

，Tel：021-67835172；E-mail：sj_yaoqilin@163.com