衛(wèi)海濱，夏 輝，樓巧君，馮芳君，馬孝松，梅捍衛(wèi)，羅利軍（上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，上?！?01106）

利用水稻抗旱種質(zhì)研究馴化和育種對(duì)遺傳多樣性的影響

衛(wèi)海濱，夏 輝，樓巧君，馮芳君，馬孝松，梅捍衛(wèi)*，羅利軍*
（上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，上海201106）

利用高通量測(cè)序獲取SNP標(biāo)記技術(shù)對(duì)上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心99個(gè)水稻抗旱種質(zhì)進(jìn)行全基因組重測(cè)序，分析其遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)。結(jié)果表明：在所有SNPs位點(diǎn)中，多態(tài)性比率為68.98%（1 927 238/2 793 702），SNPs標(biāo)記密度在12條染色體上分布范圍為4.5—6.2個(gè)SNP/kb；供試品種間的遺傳距離分布具有兩個(gè)密度高峰；鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹將99個(gè)品種劃分為秈稻和粳稻兩個(gè)類群。綜合SNPs和進(jìn)化分析結(jié)果表明：水稻在自然選擇和人工馴化過(guò)程形成復(fù)雜進(jìn)化史，99個(gè)抗旱種質(zhì)在DNA水平上的差異呈現(xiàn)兩個(gè)極端，遺傳距離分布范圍較大（0.003—0.998），具有較寬遺傳基礎(chǔ)和豐富的遺傳多樣性。本研究以期為水稻節(jié)水抗旱新品種選育的親本選配提供理論依據(jù)。

水稻；遺傳多樣性；抗旱性；育種；單核苷酸多態(tài)性

水稻（Oryzasativa L.）是世界上最古老的主要糧食作物之一，在全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有十分重要的地位。當(dāng)前世界人口不斷增長(zhǎng)，耕地面積逐年減少，水資源的競(jìng)爭(zhēng)日益激烈，全球面臨的糧食危機(jī)凸顯［1］。然而，上世紀(jì)末至今水稻產(chǎn)量卻沒(méi)有大的突破。主要原因在于栽培稻馴化過(guò)程中，為了獲得一種優(yōu)良性狀而使得很多優(yōu)秀農(nóng)藝性狀的雜合位點(diǎn)在人工選擇過(guò)程中丟失［2］。栽培稻的馴化和育種中，基因組的遺傳多態(tài)性發(fā)生了明顯的變化，導(dǎo)致水稻種質(zhì)的遺傳多樣性降低，供體親本的遺傳背景變窄［3］。目前已收集的水稻抗旱種質(zhì)品種包括具有抗旱或高產(chǎn)性能的地方種和節(jié)水抗旱稻育成種，其遺傳多樣性的豐富程度將是重要遺傳資源加以充分利用的基礎(chǔ)。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的普及，SNP分子標(biāo)記被廣泛用于研究物種的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)以及不同品種間的親緣關(guān)系［4］。例如，通過(guò)對(duì)水稻全基因組SNP數(shù)據(jù)的分析，揭示了水稻的馴化與起源，發(fā)現(xiàn)粳稻首先從普通野生稻中馴化出來(lái)，然后在栽培稻的傳播過(guò)程中粳稻與普通野生稻反復(fù)發(fā)生基因流最終形成了秈稻［5］。對(duì)我國(guó)水稻主產(chǎn)區(qū)的1495份雜交水稻品種進(jìn)行基因組測(cè)序，分析揭示了基因組區(qū)段在秈稻和粳稻間的遺傳多樣性特征［6］。因此，利用SNP分子標(biāo)記研究水稻群體的遺傳多樣性及其在馴化過(guò)程中發(fā)生的變化，是完全可行的。

為了有效利用淡水資源，實(shí)現(xiàn)從高產(chǎn)到節(jié)水抗旱的轉(zhuǎn)型，本世紀(jì)初我國(guó)啟動(dòng)了“綠色超級(jí)稻新品種培育”的863項(xiàng)目，本單位承擔(dān)了水稻節(jié)水抗旱種質(zhì)創(chuàng)新子課題。上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心初步建立了我國(guó)節(jié)水抗旱核心種質(zhì)資源，通過(guò)對(duì)各種材料的評(píng)價(jià)和鑒定，并進(jìn)行遺傳多樣性分析。本研究采用Illumina高通量測(cè)序SNP標(biāo)記對(duì)本中心建立的抗旱種質(zhì)（99個(gè)栽培稻品種）進(jìn)行研究，旨在揭示這些抗旱種質(zhì)在全基因組水平上的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，快速獲取大量有益的種質(zhì)評(píng)價(jià)信息，以期為水稻節(jié)水抗旱新品種選育的親本選配提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1水稻品種及其DNA提取

供試品種來(lái)自上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心種質(zhì)資源，包括通過(guò)節(jié)水抗旱性能的評(píng)價(jià)和鑒定的地方品種和節(jié)水抗旱稻育成種，共計(jì)99個(gè)（表1）。各品種的系譜資料源自品種參試時(shí)育種單位提供的信息，可以參考國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心的資料（www.ricedata.com）。上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心水稻遺傳育種溫室種植，取水稻苗期幼嫩葉片，采用天根生化科技（北京）有限公司植物基因組抽提試劑盒抽提基因組DNA。

表1　用于SNP分析的水稻品種Table 1　Rice varieties used forsNP analysis

（續(xù)表1）

1.2高通量測(cè)序及SNP分析

利用Illumina HiSeq-2000對(duì)水稻抗旱種質(zhì)的99個(gè)品種進(jìn)行全基因組重測(cè)序，由蘇州眾信生物技術(shù)有限公司完成，測(cè)序深度為5×，序列比對(duì)的參考基因組為日本晴msu7.0（http://rice.plantbiology.msu.edu/）。獲取基因組SNP信息后，將SNP分型數(shù)據(jù)用Clustalw 2軟件進(jìn)行完全比對(duì)，應(yīng)用Phylip 3.6.5軟件的Dnadist程序計(jì)算品種間的遺傳距離，最后采用鄰接法構(gòu)建遺傳關(guān)系樹狀圖。

2　結(jié)果與分析

2.1多態(tài)性SNP位點(diǎn)的分布

99個(gè)水稻抗旱種質(zhì)的重測(cè)序基因組序列與日本晴Nipponbare參考基因組進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)出群體SNPs。在分布于12條染色體的2793702個(gè)SNP位點(diǎn)中，1 927 238個(gè)被檢測(cè)到多態(tài)性，多態(tài)性比率為68.98%。不同染色體上分布的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量范圍為124070—214941個(gè)，分布差異較大，且在1號(hào)染色體上分布最多（圖1）。但每條染色體的SNPs標(biāo)記密度差異較小，分布區(qū)間為4.5—6.2個(gè)SNP/kb，平均標(biāo)記密度為5.16個(gè)SNP/kb。

2.2水稻品種間的遺傳變異

基于SNP標(biāo)記的品種兩兩之間遺傳距離分析，其變異范圍為0.003—0.998，平均值為0.527，其中‘MILT_1444’（R11）和‘IRAT_13’（R16）間的遺傳距離最?。?.003），而‘LIANGGUOZAO’（R85）與‘TODOROKIWASE’（R102）間的遺傳距離最大（0.998）。99個(gè)供試品種兩兩計(jì)算，共獲得4 851個(gè)遺傳距離數(shù)字，以0.05為組距進(jìn)行次數(shù)分布分析，可見99個(gè)品種間的遺傳距離具有兩個(gè)分布密度高峰（圖2）。在0.2與0.9處分布密度最大，兩側(cè)不對(duì)稱。大于0.7的遺傳距離數(shù)字有1 922個(gè)（39.62%），小于0.3的有1 323個(gè)（27.27%），分布呈現(xiàn)兩個(gè)極端的趨勢(shì)。

圖1　多態(tài)性位點(diǎn)在水稻12條染色體上的分布Fig.1　Distribution of polymorphicsites in 12 chromosomes of rice

圖2　品種間遺傳距離的次數(shù)分布Fig.2　Frequencydistribution ofgeneticdistances between varieties

2.3聚類分析

根據(jù)水稻SNP遺傳距離矩陣進(jìn)行聚類分析，99個(gè)品種被劃分為秈稻（黑色）和粳稻（灰色）兩大類群。其中育種常用到的兩個(gè)代表性品種：秈稻‘珍汕97B’（R158）和粳稻‘IRAT 109’（R109），分別位于秈粳群體中部，圖3中分別以紅色和綠色表示；兩個(gè)AUS類型的品種‘LAMBAYEQUE 1’（R25）和‘AUS 454’（R35）被分類至為粳稻，圖中以藍(lán)色表示，與‘IRAT 109’的遺傳距離分別為：0.182和0.387，表明在遺傳基礎(chǔ)上具有很高的親緣性，且‘IRAT 109’（R109）與‘LAMBAYEQUE 1’（R25）具有更近的親緣關(guān)系。

圖3　水稻抗旱種質(zhì)99個(gè)品種的聚類圖Fig.3　Cluster analysis of 99drought-resistant rice varieties

3　討論

水稻基因組精細(xì)圖的完成和高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，為DNA水平上利用SNP標(biāo)記研究水稻的遺傳多樣性創(chuàng)造了良好基礎(chǔ)［5-8］。本研究選用的水稻抗旱種質(zhì)99個(gè)品種，是來(lái)源于國(guó)內(nèi)外的優(yōu)良品種，具備一定的代表性。雖然群體材料數(shù)量較少，卻具備較高的遺傳多樣性水平，例如每200個(gè)堿基就有一個(gè)SNP（圖1），并與已有研究報(bào)道相吻合［9］。同時(shí)，經(jīng)過(guò)群體多態(tài)性篩選（MAF＞0.05），發(fā)現(xiàn)了較高的SNP多態(tài)性比率，SNP密度較大。以上結(jié)果表明該抗旱種質(zhì)群體具有遺傳多樣性變異豐富的特點(diǎn)，因此在抗旱性以外，還可能具有較豐富的優(yōu)異農(nóng)藝性狀。

水稻的馴化會(huì)使遺傳多樣性降低，尤其是一些地方品種及育成種遺傳多態(tài)性下降水平更加嚴(yán)重［10］。本研究通過(guò)遺傳距離推斷遺傳變異程度，發(fā)現(xiàn)水稻抗旱種質(zhì)群體遺傳距離分布具有雙峰特征（圖2）。其中遺傳距離位于0.2—0.3出現(xiàn)的峰，表明馴化獲得優(yōu)良農(nóng)藝性狀的同時(shí)，當(dāng)代栽培稻在馴化過(guò)程中經(jīng)歷了馴化瓶頸，導(dǎo)致栽培群體相對(duì)于祖先野生稻整體遺傳多態(tài)性有所降低。另一個(gè)遺傳距離峰位于0.9附近，表明部分種質(zhì)資源具有相對(duì)較為豐富的遺傳多樣性。親緣關(guān)系結(jié)果表明（圖3），來(lái)源于秈稻和粳稻兩大類群的品種具有各自的種質(zhì)抗性優(yōu)勢(shì)，育種分別從秈稻和粳稻中選擇一個(gè)親本，更有利于節(jié)水抗旱稻新品種的培育［11］。利用這批核心種質(zhì)，上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心已培育出一大批節(jié)水抗旱稻，包括常規(guī)節(jié)水抗旱稻品種：‘中旱2號(hào)’‘滬旱3號(hào)’‘滬旱15號(hào)’‘滬旱7號(hào)’，及三系雜交節(jié)水抗旱稻不育系與恢復(fù)系：‘滬旱1A’‘滬旱2A’‘旱恢2號(hào)’‘旱恢3號(hào)’等［12-13］。因此這批抗旱種質(zhì)確實(shí)能夠成為培育節(jié)水抗旱稻的資源寶庫(kù)。

目前，在節(jié)水抗旱稻育種中被廣泛深入應(yīng)用的材料依舊不多，而這些抗旱種質(zhì)資源卻具備較高程度的遺傳差異與多樣性，提示我們應(yīng)該進(jìn)一步挖掘該種質(zhì)資源群體的育種潛力。在這個(gè)過(guò)程中，本研究中應(yīng)用的SNP可以成為很好的分子標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選育與育種，為選育節(jié)水抗旱稻新品種提供重點(diǎn)關(guān)注的親本資源。另一方面，發(fā)掘與SNP相關(guān)的潛在抗旱等優(yōu)良農(nóng)藝性狀基因，將會(huì)成為下一步的研究方向，并將為闡明節(jié)水抗旱的分子遺傳基礎(chǔ)提供有利的參考。

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（責(zé)任編輯：程智強(qiáng)）

Impacts ofdomestication and breeding ongeneticdiversity in utilizingdrought-resistant ricegermplasms

WEI Hai-bin，XIA Hui，LOU Qiao-jun，F(xiàn)ENG Fang-jun，MA Xiao-song，MEI Han-wei*，LUO Li-jun*
（Shanghai Agrobiologicalgene Center，Shanghai 201106，China）

Thegenome-widesequencing of the 99drought-resistant rice varieties collected by this center was conducted by using high throughoutgenomesequence togetsNP markers and thegeneticdiversity was analyzed.The resultsshowed that the percentage of polymorphicsites was 68.98%（1 927 238/2 793 702）among all the identifiedsNPs，and thedensity ofsNP markers in 12 chromosomes was 4.5—6.2sNP/kb；Thedistribution ofgeneticdistances between the tested varieties had twodensity peaks；The 99 rice varieties could be classified into indica and japonica types in the phylogenetic tree established by the neighbor-joining method. ThesNP and phylogenetic analyses indicated that a complicated history of rice evolution formedduring naturalselection and artificialdomestication，thedifferences of 99drought-resistant rice varieties atdNA level presented two extremes，thedistribution ofgeneticdistances was relatively wide in range（0.003—0.998），and thus rice had abundantgeneticdiversity.The findings could provide a theoretical basis for parentalselection in breeding newdrought-resistant rice cultivars.

Rice；Geneticdiversity；Drought resistance；Breeding；SNP

S511

A

1000-3924（2016）04-001-05

2016-03-30

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（14ZR1437000）；上海市種業(yè)發(fā)展項(xiàng)目［滬農(nóng)科種字（2014）第1號(hào)，滬農(nóng)科種字（2016）第1-6號(hào)］

衛(wèi)海濱（1977—），男，博士，助理研究員，主要從事節(jié)水抗旱稻遺傳研究。E-mail：whb@sagc.org.cn

，E-mail：hmei@sagc.org.cn，lijun@sagc.org.cn