劉 玲, 柯皓天, 呂 銀, 陳仁芳

(1.四川省絲綢科學研究院，四川成都 610031；2.四川省絲綢工程技術(shù)研究中心，四川成都 610031；3.西南大學生物技術(shù)學院，重慶 400716)

?

一種用于桑RAD-Seq高通量測序的基因組DNA提取方法

劉 玲1, 柯皓天1, 呂 銀2, 陳仁芳3*

(1.四川省絲綢科學研究院，四川成都 610031；2.四川省絲綢工程技術(shù)研究中心，四川成都 610031；3.西南大學生物技術(shù)學院，重慶 400716)

[目的]篩選一種能夠得到高質(zhì)量桑樹基因組DNA的方法。[方法]采用天根試劑盒法(Plant Genomic DNA Kit 離心柱型)，并稍加改進，從11個桑種的新鮮嫩葉中提取DNA。[結(jié)果]該方法簡單快速，不需要復雜儀器，且能有效地除去桑葉中的多糖、多酚、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到的DNA能夠滿足RAD-Seq高通量的測序要求。[結(jié)論]建立了一種用于桑RAD-Seq高通量測序的基因組DNA提取方法。關(guān)鍵詞桑樹；RAD-Seq；基因組DNA提取

高質(zhì)量基因組DNA通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交及PCR分離基因等。因此，選用合適的提取方法獲取高質(zhì)高量DNA非常重要[1]。RAD-Seq，即限制性酶切位點相關(guān)DNA的測序技術(shù)，是利用限制性內(nèi)切酶對基因組進行酶切，產(chǎn)生一定大小的片段，構(gòu)建測序文庫，對酶切后產(chǎn)生的RAD片段進行高通量測序[2]。常用的植物基因組DNA提取方法有CTAB法[3]和SDS法[4]，但利用這2種方法得到的桑DNA很難滿足RAD-Seq測序的要求。桑RAD-Seq高通量測序?qū)侱NA濃度的要求較高。桑樹組織中含有較多的蛋白質(zhì)、糖類、酚類等雜質(zhì)，利用常用的提取方法很難得到高質(zhì)量的DNA。筆者利用該方法能夠得到較純的桑樹基因組DNA，滿足RAD-Seq測序要求。

1　材料與方法

1.1試驗材料供試材料為中國桑屬11個種及變種，分別為白桑Morusalba，蒙桑M.mongolica，長穗桑M.wittiorum，雞桑M.australis，奶桑M.macroura，細齒桑M.serrata，鬼桑M.mongolicavar.diabolica，川桑M.notabilis，黑桑M.nigra，華桑M.cathayana，滇桑M.yunnanensis。材料采自各原產(chǎn)地，采集時用帶冰塊的泡沫塑料盒盛裝，盡快采回于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3DNA質(zhì)量檢測

1.3.1瓊脂糖凝膠電泳檢測。取3 μL DNA溶液，加入2 μL 6×Loading buffer，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用DL 2 000 Maker做參照。150 V電泳20 min后，用EB染色，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.3.2紫外分光光度計檢測。取1 μL DNA樣品，用Nanodrop分光光度計(ND-1000，Thermo Fisher Scientific，USA)檢測DNA濃度和純度(A260/A280)。

2　結(jié)果與分析

2.1DNA電泳檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，電泳條帶明亮、清晰，無拖尾、彌散現(xiàn)象，說明該方法提取的桑樹DNA無降解現(xiàn)象,基因組完整性好，濃度較高。

注：M.maker，1.白桑，2.蒙桑，3.長穗桑，4.雞桑，5.奶桑，6.細齒桑，7.鬼桑，8.川桑，9.黑桑，10.華桑，11.滇桑。Note：M.maker, 1.M.alba, 2.M.mongolica, 3.M.wittiorum, 4.M.australis, 5.M.macroura, 6.M.serrata, 7.M.mongolica var.diabolica, 8.M.notabilis, 9.M.nigra, 10.M.cathayana, 11.M.yunnanensis.圖1　DNA提取瓊脂糖電泳圖譜Fig.1　Genomic DNA detected by agarose gel electrophoresis

2.2DNA濃度和純度A260/A280是檢測DNA純度的指標，A260/A280在1.8～2.0，說明DNA純度較高；A260/A280大于2.0時，說明DNA樣品中含有RNA；A260/A280小于1.8時，說明DNA樣品中可能存在蛋白質(zhì)污染。用Nanodrop分光光度計(ND-1000，Thermo Fisher Scientific，USA)檢測提取的DNA濃度和純度，結(jié)果見表1。由表1可知，A260/A280在1.80～1.90，濃度在92.5 ng/μL以上。說明所提取的DNA較純，符合進一步分析要求。

表1　桑種A260/A280

3　結(jié)論

該方法簡單快速，不需要復雜儀器，且能有效地除去桑葉中的多糖、多酚、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到的DNA經(jīng)華大基因檢測能夠滿足RAD-Seq高通量測序要求。

[1] 吳艷艷, 代德艷, 蔡春梅.一種改良的大豆DNA提取方法[J].大豆科學, 2015, 34(1)：112-115.

[2] 王洋坤, 胡艷, 張?zhí)煺?RAD-seq技術(shù)在基因組研究中的現(xiàn)狀及展望[J].遺傳, 2014, 36(1):41-49.

[3] 蔡朝暉, 李萍, 董婷霞, 等.貝母的分子生物學鑒定方法的研究[J].藥學學報,2000, 35(4):309-312.

[4] DOYLE J J, DOYLE J L． A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemical bulletin, 1987, 19:11-15.

[5] 天根生長科技(北京)有限公司.天根試劑盒Plant Genomic DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)使用說明書[Z].2016.

A High Throughput Sequencing DNA Extraction Method forMorusRAD-Seq

LIU Ling1, KE Hao-tian1, LU Yin2, CHEN Ren-fang3*

(1.Silk Research Institute of Sichuan Province, Chengdu, Sichuan 610031; 2.Sichuan Silk Engineering Research Center, Chengdu, Sichuan 610031; 3.Biotechnology School of Southwest University, Chongqing 400716)

[Objective] The aim was to screen out a method to obtain high quality DNA from mulberry genome.[Method] By using improved Plant Genomic DNA Kit centrifugal column method, DNA was extracted from 11 species of fresh mulberry leaves.[Result] The method is simple, rapid, and can effectively remove polysaccharides, polyphenols, protein and other impurities in the mulberry leaves, the DNA is able to meet the RAD-Seq high-throughput sequencing requirements.[Conclusion] A DNA extraction method for Morus RAD-Seq sequencing was established.

Mulberry; RAD-Seq; Genomic DNA extraction

劉玲(1989- )，女，山西大同人，碩士，從事桑樹分子標記研究。*通訊作者，副研究員，博士，從事桑資源及分類研究。

2016-06-12

S 188

A

0517-6611(2016)21-136-02