李愛娟 吳宗寶 張傳飛 周永列★ 胡慶豐 呂火烊

探討FCST在婦女陰道分泌物分離的白色念珠菌藥物敏感性檢測中的應(yīng)用

李愛娟 吳宗寶 張傳飛 周永列★ 胡慶豐 呂火烊

目的 了解本地區(qū)陰道炎婦女念珠菌感染情況及流式細(xì)胞術(shù)藥物敏感試驗(yàn)（FCST）檢測念珠菌對常用唑類抗真菌藥物敏感性的可行性。方法 對2864例陰道炎婦女的陰道分泌物進(jìn)行念珠菌的分離培養(yǎng)鑒定，F(xiàn)CST檢測分離的白色念珠菌對氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC）的藥物敏感性并與細(xì)菌自動鑒定及藥敏儀（ATB）檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 2864份陰道分泌物分離念珠菌344株，陽性率為11.9%，白色念珠菌285株占82.8%。白色念珠菌對FCA耐藥性較低為3.2%，對VRC和ITR的耐藥率均＞30%。ATB-F與FCST檢測285株白色念珠菌對FCA、VRC、ITR的符合率分別為95.1%、88.1%和91.2%。結(jié)論 白色念珠菌是本地區(qū)農(nóng)村婦女陰道分泌物的主要病原菌，本地區(qū)陰道分泌物分離白色念珠菌對VRC和ITR有一定的耐藥性。與ATB真菌藥敏試驗(yàn)（ATB-F）比較FCST用于檢測真菌對藥物的敏感性或耐藥性具有快速、準(zhǔn)確、敏感等優(yōu)點(diǎn)，具有臨床應(yīng)用前景。

流式細(xì)胞術(shù) 藥物敏感試驗(yàn) 白色念珠菌 氟康唑 伏立康唑 伊曲康唑

陰道炎是婦女最常見的婦科疾病之一，念珠菌是婦女外陰道感染主要病原體之一［1］。念珠菌屬是一類條件致病菌，又名假絲酵母菌（Candida），屬內(nèi)包括150多個種，主要以白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌等為主［2］。目前實(shí)驗(yàn)室檢測念珠菌對抗真菌藥物的藥物敏感性常用微量稀釋法、紙片擴(kuò)散法。國內(nèi)外已有報道基于流式細(xì)胞術(shù)快速檢測臨床分離細(xì)菌的藥物敏感性的流式細(xì)胞術(shù)藥物敏感試驗(yàn)（FCST），具有快速、準(zhǔn)確、結(jié)果清晰、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。為了解本地區(qū)陰道炎婦女念珠菌感染情況及對FCST檢測念珠菌對常用唑類抗真菌藥物敏感性的可行性，作者對2864例陰道炎婦女的陰道分泌物進(jìn)行念珠菌的分離培養(yǎng)鑒定，F(xiàn)CST檢測分離到的白色念珠菌對氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC）的藥物敏感性并與細(xì)菌自動鑒定及藥敏儀（ATB）檢測結(jié)果進(jìn)行比較，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 采集2014年1月至2015年7月來本院婦科和皮膚性病科門診的2864份女性就診者陰道分泌物，年齡20～63歲，平均（34±8）歲。臨床上有外陰不適、瘙癢、白帶增多、異味，小便不適等；2周內(nèi)未服任何抗生素及局部未用外用藥。

1.2 試劑及儀器 念珠菌顯色培養(yǎng)基購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司。FCA、ITR和VRC分別由法國輝瑞公司、比利時楊森公司和愛爾蘭輝瑞公司生產(chǎn)。碘化丙啶購自Sigma，RPMI-1640培養(yǎng)液購自北京?？寺?。流式細(xì)胞儀為美國BD FACSCalibur，ATB 自動細(xì)菌鑒定儀/FUNGUS試紙條為法國梅里埃產(chǎn)品。

1.3 方法 （1）菌株培養(yǎng)與鑒定：標(biāo)本采集用一次性無菌陰道窺器，擴(kuò)張陰道，用消毒棉簽取后穹窿分泌物。將分泌物拭子接種于念珠菌顯色培養(yǎng)基，35℃恒溫箱培養(yǎng)24～72h，呈淡綠色為白色念珠菌，藍(lán)灰色或鐵藍(lán)色為熱帶念珠菌，紫色為克柔念珠菌株，奶油色至白色為光滑念珠菌株。挑取初步鑒定為白色念珠菌菌落用無菌蒸餾水稀釋成相當(dāng)于2號麥?zhǔn)瞎艿木鷳乙海?50μl稀釋液至C培養(yǎng)基，混勻取135μl菌懸液于真菌鑒定條，ATB讀取結(jié)果。（2）ATB真菌藥敏試驗(yàn)（ATB-F）：無菌接種環(huán)挑取1～3個ATB 自動細(xì)菌鑒定儀鑒定為白色念珠菌菌落用無菌蒸餾水制備相當(dāng)于2號麥?zhǔn)瞎艿木鷳乙海?0 μl 稀釋液至ATB-F混勻，分別加135μl菌懸液于含ATB藥敏條（法國生物梅里埃公司）的各微孔，無菌礦物油封存后35℃恒溫箱培養(yǎng)24～72h后根據(jù)試劑使用說明書提供的判讀標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。（3）流式細(xì)胞術(shù)藥敏試驗(yàn)（FCST）：參考文獻(xiàn)［3］，各白色念珠菌臨床菌株懸液用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至1×106/ml。取1ml菌液中分別加入不同終濃度的各抗真菌藥物，加入藥物與濃度見表1。另設(shè)1份無藥陰性對照和1份加熱處死的陽性對照。35℃孵育3h。3000r/min 離心5min，取白色念珠菌沉淀加入脫氧膽酸鈉（SDC）溶液20μl，混勻后室溫放置5min。加入濃度為50μg/ml的PI 染液200μl，室溫下染色15min后，加入25 mmol/L 的去氧膽酸鈉20μl后染色5～10min后在流式細(xì)胞儀上檢測。流式細(xì)胞術(shù)分析的門設(shè)定和微量稀釋最小抑菌濃度（MICS）判定參考文獻(xiàn)［4］。

2 結(jié)果

2.1 念珠菌分離情況 2864份陰道分泌物念珠菌顯色培養(yǎng)陽性344份，無不同念珠菌重疊感染，陽性率為11.9%。其中白色念珠菌285株占82.8%，光滑念珠菌24株占7.0%，熱帶念珠菌22株占6.4%，克柔念珠菌11株占3.2%，星形念珠菌2占0.6%。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 285株白色念珠菌對3種唑類抗菌素真菌藥物的MICs見表1。

表1 藥敏試驗(yàn)藥物終濃度及白色念珠菌臨床菌株的MICs

2.3 兩種藥敏試驗(yàn)比較 285株白色念珠菌分別用ATB-F和FCST檢測對3種唑類抗菌素真菌藥物的敏感性。ATB-F檢測285株白色念珠菌對FCA、VRC、ITR的耐藥性分別為3.2%、31.9%和27.7%；用FCST檢測285株白色念珠菌對FCA、VRC、ITR的耐藥性分別為3.2%、31.2%和31.2%。ATB-F與FCST檢測285株白色念珠菌對FCA、VRC、ITR的符合率分別為95.1%、88.1%和91.2%。

3 討論

念珠菌性陰道炎的發(fā)病機(jī)制與多種因素有關(guān)，如長期服用廣譜抗生素、口服避孕藥和激素、免疫抑制劑等因素誘發(fā)感染［5］。國外報道約40%～70%的成年婦女有外陰陰道念珠菌病病史，約5%患者有反復(fù)發(fā)作，反復(fù)發(fā)作和頑固難愈與念珠菌的耐藥性密切相關(guān)。致病菌種類的分析和藥物敏感性的監(jiān)測對臨床有著重要意義。近年國內(nèi)也見臨床病例中真菌、尤其是念珠菌的感染率日趨升高且對一線抗真菌藥物FCA和VRC耐藥性不斷增強(qiáng)［2］。本資料中，2864份女性就診者陰道分泌物念珠菌感染率為11.9%，白色念珠菌占82.8%。白色念珠菌對3種唑類抗真菌藥物除對FCA較敏感（耐藥率為3.2%）外，對其余2種藥物的耐藥率均＞30%，提示對引起陰道炎的真菌應(yīng)該加強(qiáng)藥敏檢測，防止濫用藥物和非規(guī)范化自行使用藥物。

美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）推薦的真菌藥敏試驗(yàn)方法主要有常量稀釋法、微量稀釋法、紙片擴(kuò)散法［3］。本實(shí)驗(yàn)室真菌藥敏試驗(yàn)常用紙片擴(kuò)散法，與稀釋法比紙片擴(kuò)散法較為簡便，但培養(yǎng)周期長、易污染、有拖尾現(xiàn)象等缺點(diǎn)存在；近年有實(shí)驗(yàn)室使用的E-test檢測真菌藥物敏感性，雖簡便，但仍需較長實(shí)驗(yàn)時間且主觀因素易影響結(jié)果判斷［6］。因此，建立快速、準(zhǔn)確、易于標(biāo)準(zhǔn)化的真菌藥敏試驗(yàn)方法具有重要的臨床意義。

本資料中，作者從陰道炎婦女陰道分泌物中分離到的285株白色念珠菌，用文獻(xiàn)建立的FCST檢測了對FCA、ITR和VRC的敏感性并與ATB-F法進(jìn)行比較，ATB-F與FCST檢測285株白色念珠菌對3種唑類抗真菌藥物符合率較高均在90%左右，對ITR的符合率高達(dá)95.1%，提示FCST與ATB-F測定白色念珠菌的藥物敏感性有較好的一致性。FCST檢測白色念珠菌對抗真菌藥物藥敏試驗(yàn)可在0.5 h內(nèi)出結(jié)果，而用稀釋法、微量稀釋法、紙片擴(kuò)散法需＞2d時間。當(dāng)然目前使用的FCST檢測白色念珠菌方法與參數(shù)參考文獻(xiàn)獲得，雖然結(jié)果表明文獻(xiàn)方法適用于本實(shí)驗(yàn)室，但要在更多種類的真菌甚至其他細(xì)菌使用流式細(xì)胞術(shù)檢測其藥物敏感性還有待于條件的進(jìn)一步摸索以利于建立標(biāo)準(zhǔn)化程序。

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