鄭　云　白煥煥

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EGFR和TGF-α在胃癌組織中表達(dá)的意義

鄭云白煥煥

目的探討EGFR和TGF-α的表達(dá)情況與胃癌臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性。方法對行胃癌根治術(shù)以及術(shù)后化療的110例患者采集標(biāo)本，并做固定、包埋、切片、免疫熒光染色，檢驗(yàn)EGFR和TGF-α表達(dá)的含量。以正常胃黏膜組織45例作為對照，對比正常組織和病理組織EGFR和TGF-α表達(dá)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對比EGFR和TGF-α在同一患者胃癌組織和癌旁組織中表達(dá)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；判斷EGFR和TGF-α的表達(dá)水平與患者總體生存期、腫瘤大小、腫瘤分級、腫瘤復(fù)發(fā)有無相關(guān)性。結(jié)果EGFR在正常胃黏膜組織、癌旁組織和胃癌組織中陽性率分別為8.89%、52.73%、43.64%。TGF-α在正常胃黏膜組織、癌旁組織和胃癌組織中陽性率分別為11.11%、57.27%、49.09%。正常胃黏膜組織中EGFR和TGF-α的表達(dá)與癌旁組織、胃癌組織比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EGFR和TGF-α的表達(dá)呈正相關(guān)。高表達(dá)與低表達(dá)EGFR、TGF-α的患者在總體生存期、腫瘤大小、腫瘤分級、腫瘤復(fù)發(fā)率等指標(biāo)上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論EGFR和TGF-α在胃癌組織及癌旁組織中表達(dá)較正常胃黏膜顯著升高，EGFR和TGF-α表達(dá)呈正相關(guān)，且高表達(dá)EGFR和TGF-α的患者預(yù)后較差。

EGFR；TGF-α；胃癌

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:892～894)

胃癌是我國最常見的癌癥之一，發(fā)病率在男性中為第2位，女性中為第3位；同時(shí)也是最兇險(xiǎn)的癌癥之一，死亡率在男性中為第3位，女性中為第2位。目前胃癌依然主要依靠手術(shù)治療，但是即使是通過規(guī)范的胃癌切除術(shù)，局部復(fù)發(fā)率仍然可高達(dá)22%[1]。當(dāng)前，提高術(shù)后總體生存率和無進(jìn)展時(shí)間的關(guān)鍵在于更好地理解腫瘤的分子特性，篩選出高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)人群，尋找潛在的化療靶點(diǎn)。在臨床實(shí)驗(yàn)中，人們發(fā)現(xiàn)EGFR和TGF-α在多種癌細(xì)胞上高表達(dá)[2]。本課題的目的在于探討EGFR、TGF-α在正常組織和胃癌組織中表達(dá)水平的差異以及高表達(dá)EGFR、TGF-α對胃癌患者預(yù)后的影響。

1　材料與方法

1.1一般資料

挑選我院普外科自2001年1月至2007年1月收治的行胃癌根治術(shù)以及術(shù)后化療的患者110例進(jìn)行研究。所有患者隨訪開始時(shí)的年齡在34～59歲，平均年齡為(47.1±9.8)歲，均已進(jìn)行長達(dá)8～14年的電話及門診隨訪，并保存手術(shù)切除標(biāo)本，研究過程中未有患者失訪。入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理證實(shí)為2～3級胃癌；②行胃癌根治術(shù)，術(shù)中證實(shí)胃癌為Ⅱ～Ⅲ期，手術(shù)過程順利，術(shù)后無嚴(yán)重并發(fā)癥；③無其它任何嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病(包括感染、遺傳疾病、自身免疫疾病、營養(yǎng)不良、代謝疾病、內(nèi)分泌疾病等)，卡氏評分在60分以上，預(yù)期生存時(shí)間大于2個(gè)月，各器官功能正常；④賁門癌不在此研究范圍之內(nèi)，因?yàn)槠鋸?fù)發(fā)率、總體生存時(shí)間與其他胃癌出入過大，可能影響結(jié)果[3]；⑤入選病例男女比例接近，均為中青年。⑥所有患者均被告知實(shí)驗(yàn)事宜，本課題已取得其知情同意。另外選取30例正常胃黏膜組織作為陰性對照。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的處理組織原位免疫熒光染色采用SP法(streptacidin perosidase)，操作如下：①新鮮標(biāo)本在中性福爾馬林緩沖液中固定24 h，然后用石蠟包埋。②對石蠟塊連續(xù)切片，厚度4 μm，68 ℃烤片20 min。鏡下檢查確認(rèn)切片內(nèi)無出血、壞死區(qū)。③二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。④滅活內(nèi)源性過氧化物酶：用3%過氧化氫溶液37%溫箱內(nèi)孵育10 min，使用PBS溶液沖洗3次。⑤修復(fù)抗原：在0.01 M枸櫞酸buffer中水浴15～20 min(95 ℃)，然后去除自然冷卻20 min，PBS溶液沖洗3遍。⑥用奶粉封閉，37 ℃溫箱孵育10 min，倒掉奶粉溶液。⑦滴上EGFR小鼠單克隆抗體(DakoCytomation公司，加利福尼亞州，美國)4 ℃冰箱過夜，用PBS溶液沖洗3次(陰性小鼠單克隆抗體為對照組)。滴上生物素二抗，在37 ℃溫箱中孵育30 min。PBS溶液沖洗3次。⑧滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的工作液，37 ℃溫箱孵育30 min，PBS沖洗3遍。⑨DAB顯色液顯色(北京索萊寶科技有限公司)，清水沖洗，蘇木精復(fù)染。⑩酒精脫水，樹膠封片。

1.2.2蛋白表達(dá)水平檢測標(biāo)準(zhǔn)[4]根據(jù)免疫染色評分半定量檢測EGFR和TGF-α的原位表達(dá)水平。該評分包含比例評分和亮度評分。比例評分反映了陽性染色的細(xì)胞數(shù)(0分，<5%，同陰性對照；1分，5～10%；2分，10～50%；3分，50～75%；4分，>75%)，亮度評分反映了染色的強(qiáng)度，即單個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)水平(0分，無染色，同陰性對照；1分，弱陽性；2分，中等陽性；3分，強(qiáng)陽性)。檢測始終由同一個(gè)對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并不了解的技術(shù)員單盲完成。最后將比例評分和亮度評分相加，得到的分值反映了蛋白表達(dá)水平，定義為L值。實(shí)驗(yàn)前即定下評判標(biāo)準(zhǔn)：L值<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.3觀察指標(biāo)

正常組織、癌旁組織、胃癌組織L值；患者總體生存時(shí)間(overall survival，OS)，腫瘤分級、大小，術(shù)后有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有無復(fù)發(fā)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件(Stata Corp.TX，美國)處理數(shù)據(jù)，顯著性檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。相關(guān)性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2　結(jié)果

2.1EFGR在正常胃黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織中L值對比

正常胃黏膜組織的EGFR、TGF-α的L值以及陽性例數(shù)較癌旁組織、胃癌組織均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。癌旁組織的EGFR、TGF-α的L值、陽性例數(shù)與胃癌組織相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1　EFGR、TGF-α在正常胃黏膜組織、癌旁組織、胃癌組織中L值及陽性例數(shù)比較

注：*為與正常組比較，P<0.05。

2.2EGFR、TGF-α表達(dá)水平和胃癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

癌旁組織中陽性表達(dá)與陰性表達(dá)EGFR、TGF-α的胃癌在腫瘤直徑、腫瘤分級、總體生存時(shí)間、復(fù)發(fā)率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。胃癌組織中陽性表達(dá)與陰性表達(dá)EGFR、TGF-α的腫瘤在腫瘤直徑、腫瘤分級、總體生存時(shí)間、復(fù)發(fā)率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同為陽性表達(dá)EGFR、TGF-α的腫瘤組織在腫瘤直徑、腫瘤分級、總體生存時(shí)間上與同為陰性表達(dá)EGFR、TGF-α的腫瘤組織相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2　EGFR、TGF-α表達(dá)水平和患者腫瘤臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系數(shù)據(jù)比較±s)

注：NnE1：EGFR在癌旁組織中陰性數(shù)；NpE1：EGFR在癌旁組織中陽性數(shù)；NnE2：EGFR在胃癌組織中陰性數(shù)；NpE2：EGFR在胃癌組織中陽性數(shù)；NnT1：TGF-α在癌旁組織中陰性數(shù)；NpT1：TGF-α在癌旁組織中陽性數(shù)；NnT2：TGF-α在胃癌組織中陰性數(shù)；NpT2：TGF-α在胃癌組織中陽性數(shù)；Nn：胃癌組織中EGFR與TGF-α均呈陰性數(shù)；Np：胃癌組織中EGFR與TGF-α均呈陽性數(shù)。

3　討論

通過本課題的研究，我們得出以下結(jié)果：①EGFR和TGF-α在胃癌組織、癌旁組織中的表達(dá)明顯高于正常胃黏膜組織；②EGFR或者TGF-α表達(dá)高者腫瘤直徑更大、分級更高、總體生存時(shí)間降低，預(yù)后不佳。兩者合并陽性預(yù)后更差。

目前，人們已經(jīng)認(rèn)識到：上皮細(xì)胞膜上廣泛分布著EGFR家族，家族成員有：EGFR(ErbB1/HER-1)、HER-2(ErbB2)、HER-3(ErbB3)和HER-4(ErbB4)[5]。EGFR家族是一種跨膜蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，結(jié)構(gòu)上可分為細(xì)胞內(nèi)區(qū)、細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)3部分[5-6]。TGF-α是繼EGF后第2個(gè)發(fā)現(xiàn)的可與EGFR結(jié)合的配體[2]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：EGF、TGF-α在正常組織中對于抑制胃酸分泌、保護(hù)并促進(jìn)胃黏膜生長有重要作用[7]。但過度表達(dá)這兩種蛋白又會帶來一系列的病理變化：人們在過度表達(dá)TGF-α的小鼠組織中觀察到，其肝臟、胰腺、胃腸的上皮均過度增生，并且會導(dǎo)致乳腺的癌前病變，盡管數(shù)個(gè)器官均比正常小鼠大，但是由于正常結(jié)締組織、脂肪組織和骨的萎縮，體重反而減輕[2]。

另外，EGF/TGF-α-EGFR系統(tǒng)是一種奇特的自分泌系統(tǒng)，即配體由某細(xì)胞合成并釋放，最終仍然作用于該細(xì)胞上的受體。EGFR配體與其結(jié)合，可自身介導(dǎo)EGFR二聚化，形成二聚體，二聚體再實(shí)現(xiàn)受體的自磷酸化，激活酪氨酸激酶受體(RTK)，RTK引發(fā)下游一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化，如：PI3K/Akt/mTOR通路、Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路等，最終作用于轉(zhuǎn)錄因子。在腫瘤細(xì)胞中EGFR、TGF-α的過度表達(dá)，加上其自分泌能力，將會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管生成[8-12]。這些研究成果為本課題的展開提供了理論依據(jù)，并與本課題結(jié)果相吻合。

人們亦根據(jù)以上的研究進(jìn)展開發(fā)出了針對EGFR家族的靶向藥物，目前其主要分為兩大類：一類是作用于細(xì)胞外區(qū)的單克隆抗體，通過競爭性抑制配體與受體的結(jié)合，使受體失去活性，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長，如西妥昔單抗、曲妥珠單抗等；另一類是作用于細(xì)胞內(nèi)區(qū)的小分子酪氨酸激酶抑制劑，干擾與三磷酸腺苷(ATP)的結(jié)合，抑制酪氨酸激酶磷酸化，阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，如吉非替尼、拉帕替尼等。但西妥昔單抗在胃癌治療中的療效尚不明確，已經(jīng)開展的多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，西妥昔單抗聯(lián)合化療一線治療晚期胃癌的風(fēng)險(xiǎn)比為44.1%～68.6%，二線治療為3.6%～23.0%，尚無充實(shí)的依據(jù)證實(shí)西妥昔單抗聯(lián)合化療能夠明顯改善晚期胃癌患者的預(yù)后[6]。這些尚待解決的臨床問題為本課題繼續(xù)深入開展提供了方向。

綜上所述，高表達(dá)EGFR和TGF-α是胃癌進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)因素，但他們同時(shí)也是潛在的治療靶點(diǎn)，有待臨床進(jìn)一步的重視和研究。

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(編輯：甘艷)

The Expression of EGFR and TGF-alpha in Gastric Cancer

ZHENGYun，BAIHuanhuan.

TCMHospitalofBaoji，Baoji，721000

ObjectiveTo discuss the relationship between expression level of EGFR，TGF-α and the pathological characteristic of gastric cancer.Methods110 patients underwent radical operation of gastric cancer were selected.All patients received follow-up visits for 8～14 years and their specimens were preserved after surgery.The collected specimens were fixed，embedded，slided and received immunofluorescently stain，the expression level of EGFR and TGF-α were detected.The expression level of EGFR with TGF-α in normal gastric epithelial tissues，para-carcinoma tissues and gastric cancer tissues were compared.The relationship between high expression of EGFR，TGF-α and overall survival，tumor size，tumor grade，and recurrence rate were detected.ResultsPositive expression rates of EGFR in normal gastric epithelial tissues，para-carcinoma tissues and gastric cancer tissues was 8.89%、52.73%、43.64%，respectively.Positive expression rates of TGF-α in normal gastric epithelial tissues，para-carcinoma tissues and gastric cancer tissues was 11.11%、57.27%、49.09%，respectively.There was a statistical difference in the expression of EGFR，TGF-α in the 2 different tissues(P<0.05).There was a positive correlation between the expression level of EGFR and TGF-α.There were statistic differences in overall survival，tumor size，tumor grade，recurrence rate of patients with different expression of levels of EGFR and TGF-α.ConclusionEGFR and TGF-α’s expression levels are higher in para-carcinoma tissues and gastric cancer tissues than in normal gastric epithelial tissues.High expression level of EGFR and TGF-α suggests bad outcomes.

EGFR；TGF-α；Gastric cancer

721000 陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院(鄭云);719000 陜西省榆林市中醫(yī)醫(yī)院(白煥煥)

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.06.007

R735.2

A

1001-5930(2016)06-0892-03

2015-07-09

2016-05-17)