許曉燕　邢　輝　蘭艷麗　劉　韻

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葉酸水平及HPV16感染對婦女發(fā)生宮頸癌變的協(xié)同作用研究

許曉燕邢輝蘭艷麗劉韻

目的探討葉酸水平、HPV16感染及HPV16 E2和E6 mRNA水平與宮頸癌變的關(guān)系，并研究葉酸水平及HPV16感染在宮頸癌變中的協(xié)同作用。方法選擇新發(fā)宮頸炎癥(CI)患者40例、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)患者80例(CINⅠ患者36例，CINⅡ/Ⅲ44例)、宮頸鱗狀細(xì)胞癌(SCC)患者48例作為研究對象，采用微生物法測定血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸含量，采用PCR檢測宮頸癌組織HPV16的感染情況，采用熒光定量PCR檢測宮頸癌組織和葉酸體外干預(yù)后Caski宮頸癌細(xì)胞中HPV16 E2及E6 mRNA水平，檢測不同葉酸濃度對Caski和C33A細(xì)胞抑制情況。結(jié)果CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組和SCC組HPV16感染率分別與CI組宮頸組織HPV16感染率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ、SCC 各組HPV16 E2和E6 mRNA水平與CI組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。宮頸癌的嚴(yán)重程度與HPV16 E2和E6 mRNA水平均呈明顯正相關(guān)性，與血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸含量均呈顯著負(fù)相關(guān)性。葉酸濃度與Caski細(xì)胞和C33A細(xì)胞的相對抑制率及HPV16 E2和E6 mRNA水平呈明顯負(fù)相關(guān)性。結(jié)論葉酸水平低、HPV16感染及HPV16 E2及E6 mRNA低表達(dá)均與宮頸癌變有關(guān)，補(bǔ)充葉酸明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)HPV16 E2及E6高表達(dá)，提示葉酸水平及HPV16感染在宮頸癌變的過程中具有協(xié)同作用。

葉酸；HPV16； E2；E6； 宮頸癌

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:875～878)

宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌的第三個(gè)常見的惡性腫瘤，也是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，其病因與許多因素有關(guān)[1]，其中高危型的HPV持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，90%以上的宮頸癌伴發(fā)高危型人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染，HPV16為HPV的其中一個(gè)亞型，據(jù)報(bào)道，HPV16感染是導(dǎo)致子宮頸腺癌發(fā)生的重要原因[2-3]。國內(nèi)外的研究報(bào)道顯示[4]，宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展與葉酸的缺乏呈密切的正相關(guān)。本研究一方面通過檢測宮頸癌患者HPV16 感染狀態(tài)、HPV16 E2和E6 mRNA水平、血清葉酸、紅細(xì)胞葉酸水平，另一方面研究葉酸干預(yù)對HPV16陽性的CaSki宮頸癌細(xì)胞中HPV16 E2及E6 mRNA水平的影響，從兩個(gè)方面探討葉酸水平及HPV16感染對婦女發(fā)生宮頸癌變的協(xié)同作用研究。

1　材料與方法

1.1研究對象

選擇2010年7月-2014年9月在我院經(jīng)病理學(xué)檢查確診的新發(fā)宮頸炎癥(CI)患者40例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)患者80例，其中低度CIN患者36例，高度CIN患者44例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌(SCC)患者48例，在入院后、系統(tǒng)治療前采集所有研究對象清晨空腹靜脈血和手術(shù)或活體宮頸組織標(biāo)本，置于-80℃保存，用于后續(xù)葉酸水平、HPV16 感染情況及HPV16E2及E6 mRNA水平檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：溶血性疾病、營養(yǎng)性巨幼細(xì)胞性貧血、消化道疾病、其他腫瘤患者，以及 3個(gè)月內(nèi)B族維生素使用者。

1.2細(xì)胞系的選擇與葉酸干預(yù)

選擇HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞Caski和HPV16陰性宮頸癌細(xì)胞C33A為研究的細(xì)胞系(均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所)，在10%胚胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，對數(shù)生長期的Caski細(xì)胞培養(yǎng)18 h后，轉(zhuǎn)入含不同濃度葉酸培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，以葉酸濃度為1 μg/ml為對照，以濃度為0.1 μg/ml為葉酸缺乏組，5個(gè)干預(yù)組的葉酸濃度分別為20 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、1 000 μg/ml、2 000 μg/ml。檢測不同葉酸濃度干預(yù)下癌細(xì)胞生長情況、HPV16 E2及E6基因的mRNA水平。

1.3檢測方法

①按試劑盒操作說明抽提宮頸癌組織DNA (組織DNA抽提試劑盒，購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)，以抽提DNA為模板，通過常規(guī)PCR檢測宮頸癌組織HPV16的感染情況,所用引物序列：HPV16F:5’-GTATACGGTCAAGGAGTACGTA-3’，HPV16R:5’-CACCGAGCTTATCCGTAAGCGG-3’。②采用微生物法測定血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸含量，具體操作參照文獻(xiàn)[5]。③采用常規(guī)四甲基偶氮噻唑藍(lán)( MTT) 法檢測葉酸干預(yù)對Caski細(xì)胞和Hela細(xì)胞增殖的影響，具體操作參照文獻(xiàn)[6]。④采用RNA抽提試劑盒(購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取癌組織和癌細(xì)胞總RNA,濃度及純度符合要求的RNA進(jìn)行合成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈的合成按照First Strand cDNA synthesis Kit操作說明(Takara公司，日本)。合成的cDNA通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測HPV16 E2及E6基因的mRNA水平(TransStart Top Green qPCRSuperMix試劑盒，購于北京全式金生物技術(shù)有限公司)，以GAPDH基因?yàn)閰⒖蓟?，E2-F：5’-GACGACCCGTCTCAAGGAG-3’,E2-R:5’-GATCCACTACTCAGGCTTC-3’,擴(kuò)增片段長度為115 bp；E6-F:5’-CATGCTCAGTTACCTGAT-3’，E6-R:5’-ACGGATACTCAGCTGACTAGA’,擴(kuò)增片段長度為107bp； 以GAPDH作為參考基因，引物序列為：5’-CGACGTAGTCTCATCTGACTT-3’,5’-GTTGCAGTCGACATAATCGTTGA-3’，片段長度為114 bp，引物均由上海生工有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：cDNA第一鏈1 μl,2xTrans Start Top Green qPCRSuperMix 10 μl,引物1(10 μM)0.6 μl,引物2(10 μM)0.6 μl,Passive Reference Dye 0.4 μl,ddH2O 7.4 μl，反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃10 s；58 ℃20 s；72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)，同時(shí)進(jìn)行溶解曲線的分析，程序?yàn)椋?0 ℃1 min;95 ℃30 s。在ABI7500分析軟件上分析E2、E6、GAPDH基因(參考基因)的Ct值，采用2- Ct法計(jì)算CaSki細(xì)胞處理前后E2、E6、GAPDH的表達(dá)量，采用公式Ct=Ct(目的基因)- Ct(GAPDH基因)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman分析，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1不同宮頸癌組織中HPV16的感染情況

CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組和SCC組HPV16感染率分別與CI組宮頸組織HPV16感染率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2不同宮頸癌組織HPV16 E2和E6 mRNA水平檢測

不同宮頸癌組織中，HPV16 E2 mRNA水平從CI到SCC明顯升高，各組之間的總體差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=196.2，P<0.0001)，同時(shí)，HPV16 E6 mRNA水平從CI到SCC也明顯升高，各組之間的總體差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=129.9，P<0.0001)。CINⅠ，CINⅡ/Ⅲ，SCC 各組HPV16 E2和E6 mRNA水平分別與CI組HPV16 E2和E6 mRNA水平進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，見表2。相關(guān)性的分析結(jié)果顯示，宮頸癌的嚴(yán)重程度與HPV16 E2和E6 mRNA水平均呈明顯的正相關(guān)性(E2：γ=0.9928，P=0.0072；E6：γ=0.9990，P=0.0010)。

表1　不同宮頸癌組織中HPV16的感染情況(例，%)

表2　不同宮頸癌組織中HPV16 E2和E6 mRNA水平檢測

注：*與CI組比較，P<0.05。

2.3不同宮頸癌患者中血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸含量檢測

血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸含量檢測結(jié)果顯示，各組間總體血清葉酸含量和紅細(xì)胞葉酸含量差異顯著，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為33.82,14.35，P<0.0001)。CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ、SCC 各組患者血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸含量分別與CI組進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。相關(guān)性的分析結(jié)果表明，宮頸癌的嚴(yán)重程度與血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸含量均呈顯著負(fù)相關(guān)(E2：γ=-0.9847，P=0.0153；E6：γ=-0.9957，P=0.0043)。

表3不同宮頸癌組織中血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸含量比較

分組 例數(shù)血清葉酸紅細(xì)胞葉酸CI406.69±1.75289.48±49.51CIN Ⅰ365.74±2.04#260.57±58.92# Ⅱ/Ⅲ444.29±1.13#243.66±38.68#SCC483.64±1.27#215.39±64.75#

注：#為與CI組比較，P<0.05。

2.4葉酸干預(yù)對Caski細(xì)胞和C33A細(xì)胞增殖的影響

不同葉酸濃度均抑制Caski細(xì)胞和C33A細(xì)胞的增殖，與對照組相比，不同葉酸干預(yù)組Caski和C33A細(xì)胞的增殖情況差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；且葉酸缺乏組與對照組Caski和C33A細(xì)胞增殖情況比較差異顯著，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，葉酸濃度與Caski細(xì)胞和C33A細(xì)胞的相對抑制率具有明顯相關(guān)性(Caski：γ=-0.7656，P=0.0448；C33A：γ=-0.7791，P=0.0389)。

表4　葉酸干預(yù)對Caski細(xì)胞和C33A細(xì)胞增殖的影響±s)

注：a為與對照組比較，P<0.05。

2.5葉酸干預(yù)對Caski細(xì)胞HPV16 E2和E6 mRNA水平的影響

隨著葉酸濃度的升高，HPV16 E2和E6 mRNA水平均明顯下降，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。相關(guān)性的分析結(jié)果表明，葉酸濃度與HPV16 E2和E6 mRNA水平呈明顯的負(fù)相關(guān)性(E2：γ=-0.8163，P=0.0251；E6：γ=-0.8172，P=0.0248)，見表5。

表5　葉酸干預(yù)對Caski細(xì)胞HPV16 E2和E6 mRNA水平的影響

注:b為與對照組比較，P<0.05。

3　討論

HPV能入侵皮膚、粘膜、生殖器組織中的上基部角蛋白細(xì)胞和上皮細(xì)胞，引起癌癥或性病。目前的研究認(rèn)為90%以上的宮頸癌與持續(xù)性的高危型 HPV感染有關(guān)[5]。在HPV亞型中，HPV16是引起HPV相關(guān)癌癥中最普遍的一種類型，據(jù)報(bào)道[6]，大約50%～60%的癌癥涉及HPV16。也有報(bào)道指出[7]，子宮頸腺癌HPV亞型則以HPV18、HPV16及HPV45為主。本文從HPV16角度進(jìn)行研究，對不同時(shí)期的宮頸病變進(jìn)行HPV16感染率的檢測，結(jié)果顯示，在新發(fā)宮頸炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中均檢測到HPV16，且隨著病變程度的加重，HPV16的感染率也上升，表明HPV16與宮頸癌變有關(guān)，與研究報(bào)道一致[8]。E6是 HPV16亞型編碼的主要的致癌基因，在病毒的復(fù)制和致癌進(jìn)程中起著重要的作用，E6通過與腫瘤抑癌基因形成特殊的復(fù)合物調(diào)控腫瘤生長的信號通路，而E2調(diào)控致癌基因的轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)一步影響E6基因功能的發(fā)揮[9]，本文對新發(fā)宮頸炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織進(jìn)行E6和E2 mRNA水平的檢測，結(jié)果顯示，隨著宮頸組織病變程度的加重，E6和E2 mRNA水平也呈明顯上升，且與宮頸組織病變程度呈顯著的正相關(guān)。

葉酸對細(xì)胞的分裂生長及核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)的合成起著重要的作用，已有研究指出葉酸營養(yǎng)狀況好與食道癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等多種癌癥患病危險(xiǎn)性低有關(guān)聯(lián)[10]。本研究采用微生物法對新發(fā)宮頸炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變、宮頸鱗狀細(xì)胞癌的血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸的含量與宮頸癌變呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，與研究報(bào)道一致[11]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了葉酸的干預(yù)可明顯抑制Caski宮頸癌細(xì)胞和C33A宮頸癌細(xì)胞的增殖。

葉酸的缺乏可使DNA鏈斷裂、修復(fù)障礙、突變增加以及低甲基化。在癌癥發(fā)生的過程中，HPV致癌基因與宿主細(xì)胞DNA進(jìn)行整合是癌癥發(fā)生的必要條件，易發(fā)生于染色體脆性位點(diǎn)，而低葉酸營養(yǎng)狀態(tài)大大增加了HPV DNA整合到脆性位點(diǎn)的幾率[12]，鑒于此，本文進(jìn)一步從體外實(shí)驗(yàn)研究葉酸水平與HPV16的相互關(guān)系，選擇HPV16陽性的Caski宮頸癌細(xì)胞為研究對象，進(jìn)行不同葉酸濃度干預(yù)后，檢測Caski細(xì)胞E6和E2 mRNA水平，結(jié)果顯示隨著葉酸濃度的升高，Caski細(xì)胞中E2和E6 mRNA水平均明顯的下降，且與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性的分析結(jié)果進(jìn)一步表明，葉酸濃度與E2及E6 mRNA水平均呈明顯的負(fù)相關(guān)性，提示補(bǔ)充葉酸可明顯逆轉(zhuǎn)HPV16引發(fā)的癌癥中E2和E6高表達(dá)，葉酸水平及HPV16感染在宮頸癌變的過程中可能具有協(xié)同作用，其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，葉酸水平低、HPV16感染及E2及E6 mRNA低表達(dá)均與宮頸癌變有關(guān)，補(bǔ)充葉酸明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)HPV16引發(fā)的癌癥中E2及E6高表達(dá)，提示葉酸水平及HPV16感染在宮頸癌變的過程中具有協(xié)同作用。

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(編輯：吳小紅)

Study of Synergistic Effect of Folate Levels and HPV16 Infection on Cervical Carcinogenesis

XUXiaoyan,XINGHui,LANYanli,etal.

TheFirstPeople'sHospitalofJiangxiaDistrict,Wuhan,430200

ObjectiveTo investigate the relationship of level of folate,HPV16 infection,mRNA levels of HPV16 E2 and E6 and cervical carcinogenesis,and the synergistic effect of folate levels and HPV16 infection on development of cervical cancer.Methods40 patients with cervical inflammation (CI),80 patients with cervical intraepithelial neoplasia (CIN) (36 cases of CINⅠ,44 cases of CINⅡ/Ⅲ) and 48 patients with cervical squamous cell carcinoma (SCC) were chosen for the study.The content of serum folate and red blood cell folate were detected with microbiological method.And the HPV16 infection and mRNA levels of HPV16 E2 and E6 in cervical cancer tissues and CaSki cervical cancer cells were tested using quantitative PCR.Meanwhile,the vitro effect of folic acid intervention on proliferation of HPV16-positive CaSki cervical cancer cells and HPV-negative C33A cervical cancer cells.Results① HPV16 infection in CINⅠgroup,CINⅡ/Ⅲ group and SCC group showed statistically significant compared with that in CI group (P<0.05).② mRNA levels of HPV16 E2 and E6 in groups of CIN,CINⅡ/Ⅲ and SCC were statistically significant differences when compared with those in CI group(P<0.0001).The severity of the cancer showed a positive correlation with mRNA levels of HPV16 E2 and E6,but showed a negative correlation with content of serum folate and RBC folate.③ The content of serum folate was negatively correlated with the relative inhibition rate of Caski and C33A as well as mRNA levels of HPV16 E2 and E6.ConclusionThe decreased folate levels and lower mRNA expression of HPV16 E2 and E6 mRNA as well as HPV16 infection are associated with lower development of cervical cancer.Adding folic acid could significantly inhibit the proliferation of cancer cells and reverse the high expression of HPV16 E2 and E6,implying the synergistic effect of folate levels and HPV16 infection on development of cervical cancer.

Folate;HPV16;E2;E6;Cervical cancer

湖北省衛(wèi)生計(jì)生委基金項(xiàng)目(編號:WJ2015MA024)

430200 武漢市江夏區(qū)第一人民醫(yī)院(許曉燕);441021 襄陽市中心醫(yī)院(邢輝,蘭艷麗,劉韻)

劉韻

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.06.002

R737.33

A

1001-5930(2016)06-0875-04

2015-08-07

2016-04-21)