陳儉清,高凌飛,任涌志,盛尊來,姜　巖,高　利,李艷華

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

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響應(yīng)面法優(yōu)化丁香葉總皂苷提取工藝

陳儉清,高凌飛,任涌志,盛尊來,姜巖,高利,李艷華*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

采用響應(yīng)面分析法對(duì)丁香葉總皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以總皂苷提取率為考察指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法對(duì)乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,乙醇回流提取總皂苷的最佳工藝條件為:乙醇濃度82%、液料比25∶1 mL/g、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間116 min、提取次數(shù)2次,在此條件下總皂苷提取率為(69.655±0.0145) mg/g,與理論值僅相差0.461 mg/g,表明此模型準(zhǔn)確可靠,是提取丁香葉總皂苷的可行方法。

丁香葉,總皂苷,響應(yīng)面,提取工藝

丁香葉為木樨科(Oleaceae)丁香屬(Syringa)紫丁香的干燥葉片。我國(guó)是丁香的栽培起源中心,種質(zhì)資源豐富,丁香屬植物約有32種,我國(guó)產(chǎn)27種,其中特有種22種,而歐洲僅產(chǎn)2種,亞洲其它國(guó)家和地區(qū)(如日本、朝鮮、尼泊爾、巴基斯坦、阿富汗等)產(chǎn)4種,美洲則完全沒有。藥用價(jià)值早為民間所認(rèn)知,其水煎劑用于治療暴火眼和痢疾。對(duì)丁香葉大量研究發(fā)現(xiàn),其具有抗菌、抗病毒、清熱、燥濕、抗氧化、解毒、消炎和麻醉等作用。通過對(duì)丁香葉化學(xué)成分進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),丁香葉含有多種活性成分,例如:有機(jī)酸類、揮發(fā)油、總黃酮、總酚酸和總皂苷等成分[1-3],而目前對(duì)于丁香葉成分研究主要集中在前幾種物質(zhì)上,對(duì)總皂苷的研究較少。

皂苷類物質(zhì)具有抗菌、抗氧化、免疫系統(tǒng)的雙向調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗癌、降血糖、抗艾滋病毒等藥物活性,此外總皂苷還可以用于高級(jí)化妝品、化工原料和食品添加劑中[4-5]。丁香葉中含有豐富的皂苷類物質(zhì),而且與丁香葉的多種活性功能有關(guān)[3]。為了使丁香葉更廣泛的應(yīng)用于功能性食品的開發(fā),本實(shí)驗(yàn)在原有丁香葉總皂苷提取工藝研究基礎(chǔ)上[3],采用響應(yīng)面(response surface methodology,RSM)分析法對(duì)丁香葉總皂苷的提取方法進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)選出丁香葉總皂苷最佳提取方法和工藝[6],旨為丁香葉的綜合開發(fā)利用提供一定理論參考。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

丁香葉采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi),經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)李彥冰教授鑒定為丁香葉,采收期為2013年9月;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品上海金穗生物科技有限公司(純度≥98%);乙醇等試劑均為分析純?cè)噭?/p>

UV-8000A紫外分光光度計(jì)上海市元析儀器有限公司;DH6000A電熱恒溫水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司;CPA225D分析天平賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;KQ3200E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1丁香葉總皂苷提取將丁香葉葉片打碎,粗粉粒徑過2#藥篩,不過3#藥篩,稱取丁香葉粗粉5.0 g,置250 mL圓底燒瓶中,乙醇回流法提取,提取液抽濾后,合并提取液,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,定容至100 mL容量瓶中,備用[5]。

1.2.2波長(zhǎng)的選擇精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品11.04 mg置于25 mL容量瓶中,加入甲醇5 mL,超聲處理5 min,用甲醇定容至刻度,其濃度為0.44 mg/mL,以其作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.05 mL及供試品溶液1 mL于10 mL具塞試管中,水浴揮干溶劑,精密加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,加塞,搖勻,于60～65 ℃水浴中加熱15 min,取出,流水冷卻至室溫后,加入冰乙酸5 mL,搖勻,在450～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。確定測(cè)定波長(zhǎng)[3]。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL分別加入5支具塞試管中,即各試管中標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.044、0.066、0.088、0.110、0.132 mg/mL,按照“1.2.2”項(xiàng)下操作,測(cè)定吸光度[3]。

1.2.4丁香葉總皂苷提取單因素實(shí)驗(yàn)分別考察乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)5個(gè)因子對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響[6]。

1.2.4.1乙醇濃度對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響當(dāng)提取溫度60 ℃、時(shí)間1 h、液料比20∶1(mL/g)、提取次數(shù)為1次時(shí),考察0、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響。

1.2.4.2液料比對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響當(dāng)乙醇濃度80%、提取時(shí)間1 h、溫度60 ℃、提取次數(shù)為1次時(shí),考察20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1的液料比對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響。

1.2.4.3提取溫度對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響當(dāng)乙醇濃度80%、時(shí)間1 h、液料比30∶1、取次數(shù)為1次時(shí),考察50、60、70、80、90、100 ℃的溫度對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響。

1.2.4.4提取時(shí)間對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響當(dāng)乙醇濃度80%、溫度80 ℃、液料比30∶1、提取次數(shù)為1次時(shí),考察30、60、90、120、150、180 min對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響。

1.2.4.5提取次數(shù)對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響當(dāng)乙醇濃度80%、提取時(shí)間120 min、溫度80 ℃,液料比30∶1時(shí),考察提取次數(shù)1、2、3、4次對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響。

1.2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提取次數(shù)為2次時(shí),總皂苷提取率較高,因此確定提取次數(shù)為2次的前提下,采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0.6,根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)為自變量,丁香葉總皂苷提取率(Y)為響應(yīng)值,采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平設(shè)計(jì)見表1[6-13]。

表1　丁香葉總皂苷提取響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表

1.2.6總皂苷提取率的計(jì)算

總皂苷提取率(mg/g)=提取液中有效成分的濃度×提取液的終體積/原藥材的質(zhì)量[6]

1.3數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Origin7.5軟件繪制趨勢(shì)曲線圖;響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1測(cè)定波長(zhǎng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

2.1.1測(cè)定波長(zhǎng)的確定齊墩果酸對(duì)照品在553 nm處有最大吸收,樣品溶液在546 nm處有最大吸收,但在553 nm處也有強(qiáng)吸收,故選擇553 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品齊墩果酸的測(cè)定,得到吸光度與濃度的方程:A=4.9364C-0.0436,r=0.9996,在0.044～0.132 mg/mL范圍內(nèi)齊墩果酸對(duì)照品顯色后的吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1乙醇濃度對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響由圖1可看出,隨乙醇濃度的升高,總皂苷提取率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)提取率最大,即80%乙醇有利于丁香葉中總皂苷類物質(zhì)的溶出。將80%定為乙醇濃度優(yōu)化的中心點(diǎn)。

圖1　乙醇濃度對(duì)總皂苷提取率實(shí)驗(yàn)的影響Fig.1　Effects of ethanol concentration on total saponins extraction rate

2.2.2液料比對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響由圖2可看出,隨液料比增加,總皂苷提取率呈先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)液料比為30∶1時(shí)達(dá)到峰值。溶劑量的增加使物料與溶劑接觸面積、溶劑傳質(zhì)推動(dòng)力均增大,濃度梯度變大,有利于總皂苷的溶出,從而使其溶出速度和提取率變大。當(dāng)液料比一定時(shí),提取率最高,隨著液料比繼續(xù)增加,溶劑體積增加使得物料吸附溶劑的量也逐漸變大,從而導(dǎo)致總皂苷被物料吸附而不易溶出[11]。將液料比30∶1定為液料比優(yōu)化的中心點(diǎn)。

圖2　液料比對(duì)總皂苷提取率的影響Fig.2　Effect of liqued/material ratio on total saponins extraction rate

2.2.3提取溫度對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響由圖3可看出,隨著溫度升高總皂苷提取率也逐漸升高,這是由于溫度升高有助于傳質(zhì)過程,使分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)激烈,加快溶質(zhì)的擴(kuò)散和溶劑的滲透,有利于總皂苷類物質(zhì)的溶出。在80 ℃時(shí)提取率最高,90 ℃時(shí)提取率下降,是由于該溫度可能使部分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的總皂苷類物質(zhì)被破壞[3,13]。因此將80 ℃定為溫度優(yōu)化的中心點(diǎn)。

圖3　提取溫度對(duì)總皂苷提取率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on total saponins extraction rate

2.2.4提取時(shí)間對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響由圖4可看出,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),總皂苷提取率迅速上升,在120 min時(shí)提取率達(dá)到最高,隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),提取率開始下降,這可能是由于總皂苷類物質(zhì)發(fā)生了氧化和降解等反應(yīng)[3,10,13]。將120 min定為提取時(shí)間的優(yōu)化中心點(diǎn)。

圖4　提取時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的影響Fig.4　Effect of extraction time on total saponins extraction rate

2.2.5提取次數(shù)對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響由圖5可看出,隨著提取次數(shù)大于2次時(shí),總皂苷的提取率沒有發(fā)生明顯的改變,而且提取次數(shù)越多,將會(huì)給濃縮帶來影響,并造成大量人力、動(dòng)力和溶劑等的浪費(fèi)[6]。因此提取次數(shù)的最佳工藝確定為2次。

圖5　提取次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響Fig.5　Effect of extracting times on total saponins extraction rate

2.3丁香葉總皂苷提取工藝優(yōu)化

2.3.1數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)基于單因素實(shí)驗(yàn),采用響應(yīng)面法對(duì)丁香葉總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)和提取時(shí)間(D)為自變量,丁香葉總皂苷提取率(Y)為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,得出丁香葉總皂苷提取率的四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果(見表2)。采用Design expert8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件,對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行了多元回歸擬合,得下列函數(shù)關(guān)系:Y=66.76+1.45A-1.2B+0.39C-2.05D+0.97AB+1.52AC+(2.500E-003)AD-3.22BC+(5.000E-003)BD+1.76CD-6.47A2+0.21B2-3.72C2-4.12D2

表3　方差分析結(jié)果

注:*:差異性顯著p<0.05,**:差異性極顯著p<0.01。

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性分析檢驗(yàn),得方差分析表(表3)。由表3可知,方程總模型和方程二次型p=0.0107<0.05,表明該模型顯著,對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響顯著;回歸失擬項(xiàng)p=0.0993>0.05,表明未知因素對(duì)該實(shí)驗(yàn)的影響較小。除提取時(shí)間外,其余三個(gè)因子對(duì)總皂苷提取率的影響均不顯著,由F值可得各因素對(duì)丁香葉總皂苷提取率的影響順序?yàn)?提取時(shí)間>乙醇濃度>液料比>提取溫度;其中交互項(xiàng)影響均不顯著；二次項(xiàng)影響:B2影響不顯著,C2影響顯著,A2、D2影響極顯著。

2.3.2丁香葉總皂苷提取工藝條件的優(yōu)化由該軟件優(yōu)化的最佳工藝條件為:乙醇濃度81.84%、液料比25.00∶1、提取溫度84.70 ℃、提取時(shí)間115.55 min、提取2次?？紤]到實(shí)際操作,將以上理論組合校正為:乙醇濃度82%、液料比25∶1、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間116 min、提取次數(shù)2次。進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到總皂苷提取率為(69.655±0.0145) mg/g,接近預(yù)測(cè)值69.194 mg/g,表明該工藝優(yōu)化合理。

表2　丁香葉總皂苷提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3　結(jié)論

將響應(yīng)面分析法用于丁香葉總皂苷提取工藝參數(shù)優(yōu)化,確定的最佳提取工藝為:乙醇濃度82%、液料比25∶1、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間116 min、提取2次。在此條件下丁香葉總皂苷提取率為(69.655±0.0145) mg/g,與理論值接近,表明此優(yōu)化工藝可為進(jìn)一步開發(fā)功能性食品提供可靠依據(jù)。

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Optimization of extraction process of total saponins fromSyringaoblateLindl. leaves by response surface methodology

CHEN Jian-qing,GAO Ling-fei,REN Yong-zhi,SHEN Zun-lai,JIANG Yan,GAO Li,LI Yan-hua*

(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Total saponins extraction fromSyringaoblateLindl. leaves was performed using the ethanol reflux extraction. Response surface methodology(RSM),based on a three level,four variable Box-Behnken design(BBD),was employed to obtain the best possible combination of ethanol concentration,liqued/material ratio,extraction temperature and extraction time. The optimum extraction conditions were as follows:ethanol concentration of 82%,liqued/material ratio of 25∶1 mL/g,extraction temperature of 85 ℃,extraction time of 116 min and extraction times of 2. Under these conditions,the experimental yield was(69.655±0.0145) mg/g. The difference of extract rate between actual value and theoretical value was 0.461 mg/g,therefore the extraction process obtained by response surface methodology was stable and reasonable,accurate and reliable. It was a feasible method to extract the total saponins fromSyringaoblateLindl. leaves.

SyringaoblateLindl. leaves;total saponins;response surface methodology(RSM);extraction process

2015-07-21

陳儉清(1982-)，男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：動(dòng)物藥學(xué)，E-mail:chen-jianqing@hotmail.com。

李艷華(1970-)，女，博士，教授，研究方向：病原微生物耐藥性研究及新獸藥研發(fā)，E-mail:Liyanhua1970@163.com。

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12543021)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)10-0320-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.057