蔣會(huì)芳,冉火苗,孔望君,辛志宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

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腐敗楊梅中兩株細(xì)菌的分離與鑒定

蔣會(huì)芳,冉火苗,孔望君,辛志宏*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

以腐爛楊梅為研究對(duì)象,采用平板劃線分離與斜面純化技術(shù),篩選出兩株編號(hào)為YMS-7和YMN-5的細(xì)菌,分別提取兩株菌的DNA后,擴(kuò)增16S rDNA序列并克隆測(cè)序,獲得的基因序列在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì),構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)合生理生化分析,將YMS-7和YMN-5分別鑒定為類芽孢桿菌Paenibacillusagaridevorans與嗜氣芽孢桿菌Bacillusaerophilus。

楊梅,菌株鑒定,16S rDNA基因,系統(tǒng)發(fā)育分析

楊梅(MyricarubraSieb. et Zucc.)別名樹(shù)梅、珠紅、系楊梅科楊梅屬植物[1],主要產(chǎn)自我國(guó)的浙江、福建等省[2]。楊梅果實(shí)色澤鮮艷,味道甜美,富含多種營(yíng)養(yǎng)成分。又因其性平、無(wú)毒且有止咳生津、消食利尿等功能,深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。然而,楊梅果實(shí)多汁柔嫩,極易在采摘、運(yùn)輸過(guò)程中造成果實(shí)腐爛,嚴(yán)重制約了楊梅的異地銷售和鮮果出口[3-4],據(jù)報(bào)道,楊梅采后4 d,其病變率達(dá)到43.7%[5]。研究表明導(dǎo)致楊梅不易儲(chǔ)存的主要原因有:楊梅果實(shí)外表無(wú)結(jié)構(gòu)致密的皮層,在采收、貯運(yùn)過(guò)程中,極易受到碰傷、積壓等物理性因素的損害,使果實(shí)衰老劣變加速。楊梅采后自身生理生化特性的變化,進(jìn)一步促進(jìn)果實(shí)的衰老[6-7]。加之楊梅成熟時(shí)高溫多雨,適于微生物在果實(shí)中快速附著、定殖,尤其是病原微生物的生長(zhǎng)繁殖,加速了楊梅的腐敗[8]。因此,分離鑒定浸染微生物是確定楊梅腐敗變質(zhì)的關(guān)鍵問(wèn)題。張宏等從楊梅中分離出微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)、托姆青霉(P.thomii)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、尖鐮孢(Fusariumoxysporium)、鏈格孢(Alternariaalternata)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等六種病原真菌[9];王根鍔等從常溫貯藏的楊梅中分離出楊梅輪帚霉(Verticicladiellaabietina(Peck)Hughes)、桔青霉(P.CitrinumTom)、綠色木霉(TrichodermaViridepers.exFr.)等三種病原真菌[5]。曹宜[10]等從腐敗楊梅中分離出4株病原細(xì)菌和2株病原真菌,然而,其并未對(duì)病原細(xì)菌的種屬地位進(jìn)行鑒定,只是從形態(tài)學(xué)的角度進(jìn)行了初步的分類。因此,目前有關(guān)楊梅腐敗菌的研究,大多集中在病原真菌的分類鑒定方面,對(duì)腐敗細(xì)菌的分類鑒定研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類鑒定主要通過(guò)觀察菌種的形態(tài)和生理生化等表型特征來(lái)確定其種屬地位。然而,細(xì)菌種類繁多、形態(tài)特征較為相似,且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定,僅依靠形態(tài)、生理生化等表型特征來(lái)鑒定細(xì)菌,既需要豐富的細(xì)菌鑒定工作經(jīng)驗(yàn)又需要較長(zhǎng)的檢驗(yàn)時(shí)間,顯然,這種傳統(tǒng)的方法不能高效地分離鑒定出菌株的種屬地位,存在一定的局限性。20世紀(jì)60年代末,C R Woese開(kāi)始采用寡核苷酸編目法對(duì)生物進(jìn)行分類,他認(rèn)為16S rRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適[11]。自此以后,隨著核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)的日益完善,分子生物學(xué)鑒定技術(shù)成為細(xì)菌分類和鑒定的有力工具。

本研究以腐爛楊梅為研究對(duì)象,采用稀釋梯度法和平板劃線分離技術(shù)得到兩株編號(hào)YMS-7和YMN-5的細(xì)菌,在形態(tài)學(xué)觀察和生理生化分析的基礎(chǔ)上,結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),進(jìn)行16S rDNA基因片段的擴(kuò)增,構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),對(duì)其進(jìn)行分類鑒定,確定其種屬地位。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

采自江蘇省南京市石湫鎮(zhèn)種植的楊梅裝入塑料保鮮袋,置于4 ℃冰箱保存14 d取出,選取腐爛的楊梅果肉為供試材料,分離細(xì)菌[10];微生物培養(yǎng)基所需材料購(gòu)自南京壽德試劑器材有限公司;OMEGA細(xì)菌基因組試劑盒(Bacterial DNA Kit(50))及引物16S(F)/16S(R)、M13-47/M13-RV購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司;PCR相關(guān)試劑(包括Lodding Buffer等)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;基因序列測(cè)定由上海美吉生物有限公司完成。

無(wú)菌工作臺(tái)SW-CJ-1FD蘇州凈化集團(tuán)設(shè)備有限公司;Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)美國(guó)Beckman公司;TP600型梯度PCR儀日本TaKaRa公司;DYCP-31DN電泳儀北京市六一儀器廠;JS-380C自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 10、酵母提取物 5、氯化鈉 10、瓊脂 18、pH7.0。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)(g/L):牛肉膏 5.0、蛋白胨 10.0、氯化鈉 5.0、瓊脂 18、pH7.2～7.4。

1.3菌株分離與純化

取數(shù)顆體積相同的單個(gè)腐爛楊梅,分別置于無(wú)菌研缽中研磨出汁液,得到楊梅原液,取1 mL原液置于9 mL無(wú)菌水中,制成10-1的楊梅稀釋液,同理,依次制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6楊梅稀釋液,取200 μL稀釋液分別涂布于NA培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)2～3 d,挑取平板上菌落形態(tài)規(guī)則的單個(gè)菌落接種經(jīng)劃線純化后,接于LB斜面得到單個(gè)純的菌落,置于4 ℃保藏。

1.4菌株生理生化特性測(cè)定

參考《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[12]、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[14]的方法,測(cè)定該菌株的生理生化特征。測(cè)定指標(biāo)主要包括耐鹽性、接觸酶和氧化酶反應(yīng)、淀粉水解、果膠水解、硝酸鹽還原、苯丙氨酸脫氫酶、糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸等。

1.5基因組DNA的提取

從保藏菌種的斜面培養(yǎng)基中挑取菌體轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h?；蚪MDNA的提取采用細(xì)菌基因組試劑盒,按照說(shuō)明書操作。提取的基因組DNA經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120 V,30 min),溴化乙錠(EB)染色。4 ℃保存?zhèn)溆?或于-20 ℃中長(zhǎng)期保存。

1.616S rDNA基因片段的PCR擴(kuò)增

16S區(qū)域的擴(kuò)增選擇原核生物 16S rDNA通用引物 16S(F)(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S(R)(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′),PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性 30 s,50 ℃退火45 s,72 ℃延伸100 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸7 min。

PCR擴(kuò)增采用50 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 19 μL,2×Taq Master Mix 25 μL,引物16S(F)(10μmol/L)2 μL、16S(R)(10μmol/L)2 μL,DNA 2 μL。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.716S rDNA基因片段克隆測(cè)序

采用DNA提取試劑盒Ver.3.0回收PCR產(chǎn)物,純化的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細(xì)胞中,使用氨芐抗性培養(yǎng)基LB瓊脂平板篩選白色單菌落,挑取白色單菌落于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h,取1 μL菌液直接做PCR,引物為M13-47(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13-RV(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′),電泳檢測(cè)是否含有目的片段。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。

PCR采用25 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 9.5 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μL,引物M13-47(10 μmol/L)1 μL、M13-RV(10 μmol/L)1 μL,DNA 1 μL。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,EB染色,并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.8目的DNA序列測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將16S rDNA的單克隆PCR產(chǎn)物交由上海美吉生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得基因序列后,利用DNAMAN拼接序列,在EzBioCloud中進(jìn)行EzTaxon比對(duì),下載與供試菌株序列同源性相近的模式菌株序列,利用MEGA 6.0軟件 Neighbor-Joining(N-J)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),自展數(shù)為1000。

2　結(jié)果與分析

2.1生理生化分析

菌株YMS-7在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃,形成乳白色菌落,半透明,表面光滑濕潤(rùn),邊緣整齊,菌落無(wú)色素產(chǎn)生。生理生化反應(yīng)測(cè)定指標(biāo)顯示(表1),菌株YMS-7在含2% NaCl 的培養(yǎng)基中能夠正常生長(zhǎng),但在含5% NaCl 的培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng);糖發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,YMS-7能夠利用D-葡萄糖、海藻糖、D-蔗糖、D-乳糖、D-半乳糖、D-麥芽糖等多種碳源,但是不能利用D-果糖、D-甘露醇、D-木糖等碳源;接觸酶、氧化酶、硝酸還原反應(yīng)等均為陽(yáng)性;而V-P反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、檸檬酸鈉利用、淀粉水解、果膠水解以及苯丙氨酸脫氨酶等反應(yīng)均為陰性。上述生理生化指標(biāo)與文獻(xiàn)報(bào)道的模式菌株P(guān)aenibacillusagaridevoransDSM 1355T的生理生化指標(biāo)高度相似[15]。

表1　菌株YMS-7、YMN-5與對(duì)照菌株的生理生化分析匯總表[15-16]

注:+,表示陽(yáng)性;-,表示陰性;WH,表示白色;NR,表示未報(bào)道。

菌株YMN-5在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃,形成白色菌落,不透明,表面不光滑,邊緣不整齊,菌落無(wú)色素產(chǎn)生。生理生化反應(yīng)測(cè)定指標(biāo)顯示(表1),菌株YMN-5的耐鹽性可達(dá)10%,能夠充分利用D-葡萄糖、海藻糖、D-蔗糖、D-乳糖、D-半乳糖、D-麥芽糖、D-果糖、D-甘露醇、D-木糖等多種碳源發(fā)酵產(chǎn)酸,接觸酶、氧化酶、V-P反應(yīng)、檸檬酸鈉利用、淀粉水解、硝酸還原反應(yīng)等均為陽(yáng)性,甲基紅反應(yīng)為陰性。上述生理生化特征與文獻(xiàn)報(bào)道的模式菌株Bacillusaerophilus28KT的生理生化特征基本相符[16]。

2.216S rDNA的測(cè)序結(jié)果

菌株YMS-7與YMN-5的16S rDNA 基因片段經(jīng)單克隆后得到的電泳圖譜,如圖1所示,菌株YMS-7基因片段大小約1.6 kb,基因測(cè)序之后得到該菌株的16S rDNA的基因片段全長(zhǎng)為1614 bp;菌株YMN-5基因片段大小約1.5 kb,基因測(cè)序之后得到該菌株的16S rDNA的基因片段全長(zhǎng)為1448 bp。瓊脂糖電泳檢測(cè)與序列測(cè)序得到的基因片段大小一致。

圖1　菌株YMS-7和YMN-5的16S rDNA基因的凝膠電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR products of 16S rDNA注:1,菌株YMS-7;2,菌株YMN-5;M,DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)是基于共同祖先的原則,是用來(lái)描述生物傳代譜系的常用表達(dá)方式,它可以直觀地表達(dá)分類群、物種或基因之間的親緣關(guān)系和進(jìn)化方向[17]。

菌株YMS-7與YMN-5經(jīng)PCR擴(kuò)增得到16S rDNA、克隆測(cè)序序列,將序列提交到EzBioCloud中進(jìn)行同源性搜索,結(jié)果如表2所示。從表2可以看出,菌株YMS-7與PaenibacillusagaridevoransDSM 1355T同源性最高(98.53%)。根據(jù)同源性比較結(jié)果,可以推測(cè)菌株YMS-7為類芽孢桿菌屬細(xì)菌;從表3可知,菌株YMN-5與Bacillusaerophilus28KT的16S rDNA同源性最高,達(dá)到99.31%。因此,推測(cè)菌株YMN-5為芽孢桿菌屬細(xì)菌。

表2　菌株YMS-7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所用類芽孢桿菌屬16S rDNA序列登錄號(hào)

表3　菌株YMN-5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所用芽孢桿菌屬16S rDNA 序列登錄號(hào)

YMS-7菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所用的類芽孢桿菌參考菌株16S rDNA 序列登錄號(hào)見(jiàn)表2。選取OxalophagusoxalicusDSM 5503T(Y14581)[18]作為外組。如圖2所示,每一個(gè)種都形成一個(gè)獨(dú)立的分支,且菌株YMS-7與PaenibacillusagaridevoransDSM 1355T聚為一支,其自展支持率為99%。表明菌株YMS-7與PaenibacillusagaridevoransDSM 1355T親緣關(guān)系最近。同源性比對(duì)結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析得到的結(jié)果一致。因而進(jìn)一步表明,菌株 YMS-7為類芽孢桿菌Paenibacillusagaridevorans。

圖2　基于菌株YMS-7 16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree based on the 16S gene sequence of strain YMS-7

圖3　基于菌株YMN-5 16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3　Phylogenetic tree based on the 16S gene sequence of strain YMN-5

YMN-5菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所用的芽孢桿菌參考菌株16S rDNA序列登錄號(hào)見(jiàn)表3。選取MicrococcusluteusDSM 20030T(AJ536198)[16]作為外組。如圖3所示,菌株YMN-5與Bacillusaerophilus28KT聚為一支,其自展支持率為100%。表明菌株YMN-5與Bacillusaerophilus28KT親緣關(guān)系最近。與同源性比對(duì)結(jié)果一致,進(jìn)一步表明,菌株YMN-5為嗜氣芽孢桿菌Bacillusaerophilus。

結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化結(jié)果,以及基于16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,將菌株YMS-7鑒定為細(xì)菌界Bacteria、厚壁菌門Firmicutes、細(xì)菌綱Bacilli、芽孢桿菌目Bacillales、類芽孢桿菌科Paenibacillaceae、類芽孢桿菌屬Paenibacillacillus、類芽孢桿菌Paenibacillusagaridevorans。菌株YMN-5鑒定為細(xì)菌界Bacteria、厚壁菌門Firmicutes、細(xì)菌綱Bacilli、芽孢桿菌目Bacillales、芽孢桿菌科Bacillaceae、芽孢桿菌屬Bacillus、嗜氣芽孢桿菌Bacillusaerophilus。

3　結(jié)論

采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定與現(xiàn)代的分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法,對(duì)分離來(lái)自腐爛楊梅中的兩株細(xì)菌 YMS-7與 YMN-5進(jìn)行分離鑒定。提取菌株基因組 DNA后,擴(kuò)增16S rDNA基因片段,經(jīng)過(guò)TA克隆后,進(jìn)行基因序列測(cè)序,所得測(cè)序結(jié)果提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行有效種的序列相似性搜索,下載與供試菌株16S rDNA序列同源性相近的菌株序列,構(gòu)建16S rDNA基因序列進(jìn)化樹(shù),進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性,依據(jù)細(xì)菌鑒定手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照,將菌株 YMS-7與 YMN-5分別鑒定為類芽孢桿菌P.agaridevorans和嗜氣芽孢桿菌B.aerophilus。這兩株細(xì)菌均為首次從腐爛楊梅中分離鑒定得到。今后將對(duì)這兩株細(xì)菌的致腐性進(jìn)行全面研究,了解它們的來(lái)源以及其導(dǎo)致楊梅腐敗的機(jī)理,為研制開(kāi)發(fā)出抑制楊梅腐爛速率的拮抗菌提供腐敗細(xì)菌。

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Isolation and identification of two bacteria from rottenMyricarubra

JIANG Hui-fang,RAN Huo-miao,KONG Wang-jun,XIN Zhi-hong*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In this study,two strains of bacteria coded as YMS-7 and YMN-5 were isolated from rottenMyricarubrausing plate streaking and slant culture methods. After extraction of DNA,16S rDNA from both strains were amplified for sequencing and homology analysis using EzBioCloud database. Two phylogenetic trees were established based on these sequences of 16S rDNA,combined with physiological and biochemical characteristics. Consequently,YMS-7 and YMN-5 were identified asPaenibacillusagaridevoransandBacillusaerophilus,respectively.

Myricarubra;identification;16S rDNA;phylogenetic analysis

2015-11-11

蔣會(huì)芳(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全，E-mail：2013108086@njau.edu.cn。

辛志宏(1974-)，男，博士，教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全，E-mail：xzhfood@njau.edu.cn。

2015年農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目(GJFP2015012)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)10-0260-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.044