沈志華,崔　春,潘子強

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640;2.電子科技大學中山學院化學與生物工程學院,廣東中山 528400)

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羅非魚下腳料酶解液特定腐敗菌的分離和鑒定

沈志華1,2,崔春1,*,潘子強2

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640;2.電子科技大學中山學院化學與生物工程學院,廣東中山 528400)

采用PCR-DGGE和PCR-RFLP技術研究了羅非魚下腳料酶解液冷藏過程中的特定腐敗菌。結果表明:酶解液在冷藏條件下,在20 d左右腐敗,細菌總數(shù)在0～12 d里逐漸增加(8.71×102～8.13×107cfu/g),12 d之后趨向穩(wěn)定。16S rRNA的PCR-RFLP及序列比對分析結果顯示,隨機挑取的18株細菌分成三個分型,其中分型1占61%,與Genbank核酸數(shù)據(jù)庫的假單胞菌(Pseudomonassp.)有最大相似性;PCR-DGGE圖譜顯示酶解液的細菌菌相隨時間的延長而逐漸減少,腐敗終點菌相單一。DGGE主要條帶測序結果表明,酶解液存在三個類群的細菌,分別是假單胞菌屬、氣單胞菌屬(Aeromonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter),其中在酶解液腐敗終點,熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)占絕對優(yōu)勢,與RFLP結果相符。

羅非魚下腳料,酶解液,特定腐敗菌,RFLP,PCR-DGGE

水產品加工過程中所使用的原料、加工方法和產品的貯藏條件不同的差異會導致殘存不同的腐敗細菌,產生不同的腐敗類型。據(jù)報道,未冷藏鮮魚的特定腐敗菌(Specific Spoilage Organism,SSO)為弧菌科(Vibrionaceae)等革蘭氏陰性細菌,而冷藏后優(yōu)勢腐敗菌則變?yōu)楦锾m氏陰性嗜冷菌或腸細菌(Enterobactericeae)[1],其中熱帶淡水魚的SSO多為假單胞菌,海洋溫帶水域魚的SSO多為腐敗希瓦氏菌[2]。冷藏貝類和甲殼類的SSO多為假單胞菌(Pseudomonassp.)或者腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)[3]。而經(jīng)過真空或氣調包裝冷藏后水產品的SSO多為磷發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)、乳酸菌(Lactobacillus)和熱殺索氏菌(Brochothrixthermosphacta)[1]。許鐘等報道,冷藏養(yǎng)殖羅非魚、大黃魚、三文魚片等貨架期終點的特定腐敗菌為假單胞菌[4-8]。徐麗敏等[9]發(fā)現(xiàn)4 ℃冷藏南美白對蝦的優(yōu)勢腐敗菌是假單胞菌與氣單胞菌(Aeromonassp.)。

在加工后的水產品中,特定腐敗菌為乳酸菌如乳桿菌(Lactobacillus)、肉食桿菌(Carnobacillus),以及發(fā)酵型革蘭氏陰性細菌如磷發(fā)光桿菌、適冷的腸桿菌等居多。在半保藏產品如醋漬魚或暴腌魚中,乳酸菌和酵母菌居多。輕度加熱處理制作的真空蒸煮袋產品在貯藏中,芽袍桿菌屬(Bacilus)或梭菌屬芽抱桿菌(Clostridium)多為優(yōu)勢腐敗菌[10]。許鐘等[11]報道淡腌大黃魚5 ℃保藏,缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminute),10 ℃和15 ℃貯藏時,微小球菌(Micrococcusrose)為優(yōu)勢腐敗菌。

目前,以羅非魚下腳料為原料,通過控制酶解制備呈味基料、功能性肽和改性蛋白已成為國內外研究的熱點之一[12-13]。但是酶解液的保鮮防腐、酶解液的菌相及特定腐敗菌的研究鮮有報道,研究和了解不同加工條件及貯藏條件下的酶解液的菌相及腐敗菌,可為蛋白水解物的保存和防腐提供理論依據(jù)。因此本實驗采用PCR-DGGE和PCR-RFLP技術研究冷藏條件下羅非魚下腳料酶解液的特定腐敗菌可為其保鮮技術提供研究基礎,為優(yōu)化羅非魚下腳料酶解液冷藏鏈技術參數(shù)和快速預測產品品質提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅非魚購于中山市厚興市場;Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、100 bp和500 bp DNA Ladder Marker、MspⅠ限制性內切酶(10 U/μL)、27F和1492R引物大連寶生物工程有限公司;瓊脂糖、PCA培養(yǎng)基、EDTA、Tris北京鼎國生物技術有限公司;E.Z.N.A. Cycle-Pure kitOmega Bio-tek,USA;胰蛋白酶(2×105U/g)、Flavourzyme500MG風味蛋白酶(5×104U/g)諾維信。

LRH-250-GB型培養(yǎng)箱韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司;TD5A-WS型離心機湖南賽特湘儀公司;T100型PCR儀、DCode型突變檢測系統(tǒng)美國BIO-RAD公司;DYY-6C電泳儀及DYCP-31DN型水平電泳槽北京六一儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1材料及樣品前處理方法羅非魚新鮮宰殺后取魚頭、魚骨、魚尾下腳料搗碎后,料液比1∶2,pH7.5,于50 ℃的恒溫水浴鍋中,先加入胰蛋白酶水解2 h后再加入風味蛋白酶繼續(xù)酶解2 h(酶用量均為700 U/g原料),然后于90 ℃水浴滅酶10 min,冷卻后,8000 r/min離心15 min,去除上層油脂與下層殘渣,取中間層酶解液備用[14]。

1.2.2微生物培養(yǎng)及細菌生長總數(shù)變化分別取0、2、4、6、8、12、16、20 d的樣品,將含菌體的樣液低速離心,除去固體雜質后取中間清液在PCA培養(yǎng)基中進行稀釋涂布,倒置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h,然后進行菌落計數(shù)。

將冷藏20 d(腐敗終點)的酶解液按上述方法培養(yǎng)細菌,挑選出形態(tài)色澤一致且占優(yōu)勢的菌株分離純化后,保存于甘油中備用。

1.2.3DNA的提取細菌DNA的粗提:取各菌種的細菌培養(yǎng)液1 mL于離心管中進行高速離心(轉速12000 r/min)5 min,棄上清液,在離心管中加入100 μL無菌水,振蕩成懸液。將離心管置于100 ℃沸水浴中反應10 min后,再于冰浴中冷卻2 min。最后進行高速離心(轉速12000 r/min)5 min,取上清液作細菌16S rDNA基因擴增的模板。

酶解液細菌總DNA的提取:操作方案參照江蕓[15]文獻完成,該DNA將用于PCR-DGGE技術分析。

1.2.4限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術分析以1.2.3中獲得的細菌DNA的粗提液作模板,利用細菌通用引物27F和1492R擴增16S rRNA基因。上游引物27F:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′,下游引物1492R:5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。50 μL的PCR反應體系成分參照潘子強文獻[16]操作。

PCR反應條件:94 ℃,5 min;94 ℃,45 s;53 ℃,45 s;72 ℃,1.5 min;循環(huán)30次;最后72 ℃延伸10 min。

PCR產物直接用5 U MspⅠ限制性內切酶消化,反應條件為37 ℃恒溫水浴6 h。酶切產物用3%瓊脂糖凝膠電泳來分析酶切圖譜。

1.2.5PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術分析把1.2.3中獲得的DNA進行16S rDNA擴增。用細菌通用引物B338f和B518r擴增酶解液中腐敗菌的16S rRNA V3可變區(qū)。引物B338f帶GC夾:5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′,5′GC夾:5′CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G,引物B518r:5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′,PCR反應體系及條件同1.2.4中。

配制凝膠:按照DGGE說明書組裝梯度制膠器。PCR結束后,取出PCR產物,用PCR產物純化試劑盒進行純化。將PCR產物進行電泳。

電泳:預電泳電壓20 V,時間30 min。正式電泳電壓70 V,時間16～18 h。

染色:加入250 mL固定液中,放置在搖床上搖蕩,脫色15 min。倒掉固定液,用去離子水沖洗2次,倒掉后加入250 mL銀染液中,放置在搖床上搖蕩,染色15 min。倒掉銀染液,用去離子水沖洗2次,倒掉后加入250 mL顯色液,待條帶出現(xiàn)后停止顯色。倒掉顯色液,用去離子水沖洗2次,加固定液終止5 min。倒掉固定液,用去離子水沖洗2次。

1.2.6PCR產物純化、測序及序列分析采用E.Z.N.A. Cycle-Pure kit(Omega Bio-tek,USA)純化DGGE主要條帶的PCR產物和RFLP不同分型的16S rRNA PCR產物。純化產物送上海英駿生物技術有限公司測序,測序結果用Vector NTI Advance 11.0中的ContigExpress拼接,去掉兩端質量低于40 bp的序列,將得到的16S rDNA序列用blastn比對NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫。

表1　各分型16S rDNA序列比對分析結果

2　結果與分析

2.1酶解液細菌生長總數(shù)變化

實驗樣品腐敗時間共20 d,在第20 d,酶解液呈黃色且表面發(fā)粘,并發(fā)出惡臭味。通過氣味、顏色和粘稠度可基本判斷酶解液已經(jīng)腐敗。

細菌生長總數(shù)變化如圖1所示。酶解液初始帶菌量為8.71×102cfu/g,細菌總數(shù)變化隨著冷藏時間延長逐漸增加,在第12 d細菌總數(shù)達到8.13×107cfu/g,隨后在12～20 d細菌總數(shù)趨向穩(wěn)定,在8.13×107～9.77×107cfu/g之間。參照國際食品微生物標準委員會(International Commission of Microbiological Specializations on Food,ICMSF)的水產品貨架期終點細菌總數(shù)參考值(7.0×107cfu/g),本實驗在第8 d即達到7.0×107cfu/g,但此時的酶解液在氣味、顏色和質感還沒有達到感官評價的腐敗現(xiàn)象,直到第20 d才達到ICMSF標準的參考水平。因此我們根據(jù)ICMSF的標準及感官評價確定在4 ℃冷藏條件下,酶解液在第20 d時腐敗。

圖1　羅非魚下腳料酶解液在4 ℃冷藏過程中細菌生長總數(shù)變化Fig.1　The number of bacteria from Tilapia wastes enzymatic hydrolysates storaged at 4 ℃

2.2特定腐敗菌的16S rDNA RFLP分析

冷藏的第20 d,將酶解液勻漿液梯度稀釋后涂布在PCA平板培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜后,隨機從平板上挑選18株細菌,經(jīng)微生物方法分離純化得到純種后,提取細菌DNA,利用通用引物27F/1492R進行PCR擴增,其PCR產物用Msp I酶切,進行RFLP分析。RFLP結果(圖2)顯示18株細菌的16S rDNA被分成3種RFLP分型,編號1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17作為分型1,共11個,占總數(shù)的61%;編號2、12、15、16作為分型2,共4個,占總數(shù)的22%;編號13、14、18作為分型3,共3個,占總數(shù)的17%。結果表明分型1的細菌是酶解液在4 ℃冷藏條件下的優(yōu)勢菌。

圖2　酶解液的16S rDNA基因Msp I酶切圖譜Fig.2　Profiles of 16S rDNA gene enzymed by Msp I

2.3RFLP序列分析

將RFLP不同分型的菌株的16S rDNA序列用blast比對NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫,結果見表1。

從表1中可以看出,分型1的細菌與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescensstrain Y1)有最大的相似性,分型2的細菌與氣單胞菌屬的Aeromonassp. REm-amp_42、Aeromonasveroniistrain A7、Aeromonasallosaccharophilastrain S5-33有最大的相似性,而分型3的細菌則與芽孢桿菌Bacillussp. TF1-3有最大的相似性。已有研究表明,假單胞菌、氣單胞菌及芽孢桿菌都是可以作為潛在的腐敗菌。因此,這三種菌是酶解液在冷藏條件下的腐敗菌,而占總體61%的分型1則是在這種條件下的優(yōu)勢菌,即特定腐敗菌。

2.4酶解液中細菌的DGGE圖譜分析及主要條帶測序分析

DGGE電泳圖譜上不同條帶代表不同的細菌,條帶顏色越重反映細菌的數(shù)量越多。從圖3中可以看出,隨著儲存時間的延長,細菌菌相也不斷變化,條帶b出現(xiàn)在第2 d。條帶c在第2 d被微弱檢出,到第4 d為主要優(yōu)勢菌,然后隨冷藏時間的增加而逐漸減弱。條帶f從第16～20 d菌相變得單一,且顏色變得非常濃,明顯處于優(yōu)勢地位,但是在第16 d之前條帶f都是處于劣勢地位的,說明條帶f所代表的菌種是酶解液在冷藏條件下的特定腐敗菌。

從DGGE凝膠上切下5個主要條帶,經(jīng)過重新PCR及DGGE的確定、測序,5個條帶的序列經(jīng)Genbank比對后的結果列于表2。

表2　DGGE主要條帶序列比對分析結果

圖3　酶解液在4 ℃冷藏過程中細菌的DGGE圖譜Fig.3　The DGGE profiles of bateria from enzymatic hydrolysates storaged at 4 ℃注:a～f表示條帶位置。

從表2比對的結果看,酶解液存在三個類群的細菌,分別是假單胞菌屬(d、f條帶)、氣單胞菌屬(a和c條帶)和不動桿菌屬(b條帶),其中f條帶熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)在酶解液腐敗終點占絕對優(yōu)勢,而這個菌常常是多種水產品的特定腐敗菌。這與前面RFLP分析結果是相符的。

3　結論

運用PCR-DGGE和RFLP分析技術對羅非魚下腳料酶解液特定腐敗菌進行了分析鑒定。結果顯示:酶解液在20 d腐敗。在RFLP分析中,發(fā)現(xiàn)酶解液在4 ℃冷藏條件下的腐敗菌有3種,其中分型1有11個,占總數(shù)的61%,分型2有4個,占總數(shù)的22%,分型3有3個占總數(shù)的17%,表明分型1的細菌是酶解液4 ℃冷藏下的優(yōu)勢腐敗菌。測序及序列比對分析顯示分型1、2、3分別與假單胞菌(Pseudomonassp.)、氣單胞菌(Aeromonassp.)和芽孢桿菌(Bacillussp.)的序列有最大的相似性。DGGE主要條帶測序結果表明,酶解液存在三個類群的細菌,分別是假單胞菌屬、氣單胞菌屬和不動桿菌屬(Acinetobacter),其中在酶解液腐敗終點,熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)占絕對優(yōu)勢。假單胞菌屬是一類好氧且適應能力極強的革蘭氏陰性致腐菌,生長率相對于其他菌有明顯的優(yōu)勢,在有氧條件下分解蛋白質的能力極強,是水產加工產品類的特定腐敗微生物。

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Isolation and identification of specific spoilage organism from Tilapia wastes enzymatic hydrolysates

SHEN Zhi-hua1,2,CUI Chun1,*,PAN Zi-qiang2

(1.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.Zhongshan Institute,University of Electronic Science and Technology,Zhongshan 528400,China)

Specific spoilage organism of Tilapia Wastes enzymatic hydrolysates during chilled storage was studied by PCR-DGGE and PCR-RFLP. Results indicated that Tilapia enzymatic hydrolysates spoilaged about 20 days at 4 ℃,and the total number of bacteria increased during 0～12 days(8.71×102～8.13×107cfu/g)gradually,became stable during 12～20 days. There were three types of bacteria by PCR-RFLP analysis of 16S rRNA from 18 strains of bacteria selected randomly. Type one which dominated 61% of the total bacteria was highly similar withPseudomonas. The maps of PCR-DGGE showed that the bacteria reduced gradually before spoilaged,and there was only one single band of bacteria at last. Sequencing analysis results of DGGE bands showed that there were three types of bacteriaPseudomonassp.,AeromonasandAcinetobacterin the Tilapia Wastes enzymatic hydrolysates,Pseudomonasfluorescenswas the predominant bacteria when spoilaged,this conclusion was consistent with RFLP.

Tilapia wastes;enzymatic hydrolysates;specific spoilage organism;restriction fragment length polymorphism(RFLP);PCR-DGGE

2015-11-09

沈志華(1982-),男,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:shenzhihua123@126.com。

崔春(1978-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技術,E-mail:cuichun@scut.edu.cn。

國家863項目(2014AA093602)。

TS264.9

A

1002-0306(2016)10-0199-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.032