魏　娟,蘇海蘭,張溪桐,畢　陽

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

?

姜黃精油的抗氧化活性研究

魏娟,蘇海蘭,張溪桐,畢陽*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

姜黃為姜科姜黃屬的多年生草本植物,是一種藥食兩用材料。采用水蒸汽蒸餾法提取了姜黃精油,研究了其對ABTS+自由基、羥自由基的清除率及其抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化的能力,通過MTS法研究了其對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,采用流式細(xì)胞技術(shù)評估了其在細(xì)胞水平的抗氧化能力。結(jié)果表明:姜黃精油對ABTS+自由基具有良好的清除效果,但其清除能力低于VE;對羥自由基的清除效果非常明顯,與VE的清除能力相當(dāng);并且能有效抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化。姜黃精油在0.02%(v/v)濃度范圍內(nèi)沒有明顯的細(xì)胞毒作用,在此濃度范圍內(nèi)能有效清除HepG2細(xì)胞內(nèi)的活性氧。由此表明,姜黃精油具有開發(fā)為安全天然的食品抗氧化劑的潛力。

姜黃,精油,抗氧化

精油是植物的次生代謝產(chǎn)物,分子量小,可隨水蒸汽蒸出,一般由幾十種甚至幾百種化合物組成。由于其成分復(fù)雜,具有多種生物學(xué)活性,被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品及制藥行業(yè)[1]。多種精油具有明顯的抗氧化活性,Goze等發(fā)現(xiàn),1 g/L刺山柑和海茴香精油可以抑制脂質(zhì)過氧化,其效果與2,6-二叔丁基甲酚(BHT)類似[2]。Mechergui等發(fā)現(xiàn),牛至精油可有效清除DPPH自由基,具有良好的抗氧化活性[3]。另外,異株百里香和擬百里香精油對羥基自由基也具有較好的清除效果[4]。

姜黃(CurcumalongaL.)為姜黃屬的多年生草本植物,在亞洲地區(qū)分布廣泛,我國和印度為主產(chǎn)國。姜黃可藥食兩用,作為中藥,具有活血降壓、驅(qū)寒消炎、抗癌等功效,另外由于其色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好而在食品工業(yè)中被廣泛用作天然著色劑[5]。姜黃的主要活性成分是姜黃素和精油。姜黃精油主要由芳姜黃酮、姜黃酮、姜黃烯、沒藥烯、梓檬烯、倍半水斧烯、莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮及桉油精等成分構(gòu)成[6]。有報道指出,姜黃精油具有抗腫瘤、抗突變、抑菌的功效。姜黃精油可以有效抑制人急性早幼粒白細(xì)胞(HL-60)和肝癌細(xì)胞(HepG2)的增殖[7],保護(hù)細(xì)胞免受損傷又能促使已突變細(xì)胞的DNA修復(fù)[8],還可抑制黃曲霉的生長及其毒素的產(chǎn)生[9]。但關(guān)于姜黃精油的抗氧化活性還未見報道。

本研究以姜黃為原料,采用水蒸汽蒸餾法提取姜黃精油,在生化水平研究姜黃精油對ABTS+自由基、羥自由基的清除效果及其抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化的能力,在細(xì)胞水平研究姜黃精油對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及其對細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除效果,以期為姜黃精油作為一種天然抗氧化劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

姜黃2014年7月購自甘肅省蘭州市安寧區(qū)黃河藥材市場;人肝癌HepG2細(xì)胞株上海拜力生物有限公司;DMEM、FBS、0.25%胰酶(含EDTA,比活力(250 U/mg)Hyclone公司;MTSPromega公司;DPPH、ABTS、TPTZ、DCFH-DA、VESigma-Aldrich公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

CN69M/FW80型高效樣品粉碎機(jī)北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司;水蒸汽蒸餾裝置常州普天儀器制造有限公司;15284型iMARK多功能酶標(biāo)儀美國BIO-RAD公司;UV-2450型可見-紫外分光光度計(jì)日本島津公司;移液器德國Eppendorf公司;GC6890N/MS5973N型氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5 ms氣相色譜毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)安捷倫科技有限公司;BD FACSCanto II型流式細(xì)胞儀美國 BD Biosciences。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1姜黃精油的提取參照Singh等的方法[10],采用水蒸汽蒸餾法以料液比為1/10對姜黃粉末進(jìn)行蒸餾,冷凝水冷凝收集精油粗提液后經(jīng)無水乙醚萃取、無水硫酸鈉干燥,最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑獲得姜黃精油,避光保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2HepG2細(xì)胞培養(yǎng)配制含10%小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,將人肝癌HepG2細(xì)胞株加入細(xì)胞培養(yǎng)液中置于含5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。

1.2.3姜黃精油對ABTS+自由基的清除能力測定參照Chun等的方法[11]。將ABTS+水溶液與過硫酸鉀溶液配制成ABTS+儲備液。使用前將ABTS+儲備液用無水乙醇稀釋得到ABTS+工作液并于室溫避光保存。用無水乙醇分別配制濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的姜黃精油樣品溶液,以抗氧化劑VE溶液(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL)作為陽性對照溶液。將1.9 mL ABTS+工作液與0.1 mL樣品溶液混合均勻,暗處反應(yīng)4 min,于734 nm處測定吸光度值A(chǔ)。用無水乙醇替代樣品溶液,于734 nm處測定吸光度值A(chǔ)0。ABTS自由基清除率計(jì)算公式為:

清除率(%)=(A0-A)/A0×100

1.2.4姜黃精油對羥自由基的清除能力測定參照劉駿的方法[12]。用無水乙醇分別配制濃度為1.0×10-3mg/mL的姜黃精油溶液和VE溶液作為樣品液。在10 mL比色管中分別加入0.3 mL 0.4 mmol/L 結(jié)晶紫溶液、0.6 mL 2.0 mmol/L過氧化氫溶液以及1.2 mL 1.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液。用pH=4.0磷酸檸檬酸緩沖液將上述溶液定容至10 mL,靜置0.5 h后,在580 nm處測其吸光度Ab。在上述體系加過氧化氫之前分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的樣品液,測定其吸光度As,按下式公式計(jì)算清除率:

清除率(%)=(As-Ab)/(A0-Ab)×100

其中:A0為上述體系中加入0.3 mL 0.4 mmol/L結(jié)晶紫溶液、1.2 mL 1.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液,不加過氧化氫,再用pH=4.0磷酸檸檬酸緩沖液定容至10 mL,測出580 nm處的吸光度值。平行測定三次,取平均值。

1.2.5姜黃精油抑制亞油酸過氧化能力測定參照Zainola等的方法[13]。用無水乙醇分別配制4 mg/mL的姜黃精油溶液、VE溶液作為樣品液。取4 mL樣品液,加入4.1 mL 2.5%亞油酸(v/v),8 mL 磷酸緩沖液(pH=7.0),3.9 mL蒸餾水,放于40 ℃恒溫下培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)液1 mL,加入l mL 20%三氯乙酸,靜置20 min。然后加入2 mL 0.3%硫代巴比妥酸(TBA)溶液,在沸水中恒溫10 min,取出室溫下冷卻。3000 r/min離心20 min,取上清液在532 nm下測定吸光度值。平行測定三次,取平均值。以無水乙醇為取代樣品測吸光值作為空白對照組。

1.2.6MTS法檢測姜黃精油對HepG2細(xì)胞的毒性取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液并以1×105/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的姜黃精油溶液,每組濃度設(shè)定6個平行孔,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加入20 μL/100 μL MTS試劑,37 ℃、5% CO2條件下孵化1～4 h后,使用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度值OD1,以單純培養(yǎng)液作為空白孔,測定吸光度值為OD0,以未做任何處理作為對照,測定吸光度值OD。細(xì)胞存活率按公式計(jì)算:

細(xì)胞存活率(%)=(OD1-OD0)/(OD-OD0)×100

1.2.7姜黃精油細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性測定DCFH-DA作為一種氧化指示劑,當(dāng)其被細(xì)胞吸收并被細(xì)胞酯酶去脂化生成DCFH后,細(xì)胞中的ROS能將其氧化成帶有熒光的DCF,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光定量,以熒光強(qiáng)度或陽性細(xì)胞率來指示細(xì)胞內(nèi)ROS的水平[14]。參照張紅城等的方法[15],取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞制備細(xì)胞懸液1×105/mL接種于6孔板中于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,加入0.001%、0.005%、0.01%的姜黃精油乙醇溶液處理30 min,再加入25 μmol/L DCFH-DA溶液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)30 min,使探針被完全吸收,棄去培養(yǎng)液后用預(yù)冷的D-Hanks清洗三次,以充分洗去未進(jìn)入的熒光探針,加入10 mmol/L H2O2刺激30 min,用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm。以細(xì)胞培養(yǎng)液為空白組(BLANK),以未用DCFH-DA刺激的HepG2細(xì)胞為陰性對照組(NTC),以用DCFH-DA刺激、但未用精油處理的HepG2細(xì)胞為陽性對照組(PTC),A、B、C分別為0.001%、0.005%、0.01%(v/v)姜黃精油處理組。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0 處理數(shù)據(jù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差并作圖,圖中豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(SD±SE)。

2　結(jié)果與分析

2.1姜黃精油對ABTS+自由基的清除能力

圖1顯示姜黃精油對ABTS+自由基具有良好的清除能力,其清除能力隨著精油濃度的升高逐漸增大,當(dāng)濃度為10.0 mg/mL時可以清除52%的ABTS+自由基。但與陽性對照抗氧化劑VE相比,姜黃精油對ABTS+自由基的清除能力要低于VE,而2 mg/mL的VE對ABTS+自由基的清除率就達(dá)到了98%。

圖1　不同濃度VE和姜黃精油對ABTS+自由基的清除能力Fig.1　Scavenging capacity against ·OH radicals of different concentrations of VE and turmeric essential oi

2.2姜黃精油對羥自由基的清除能力

由圖2可知,姜黃精油和VE對由Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基均有較好的清除效果,清除能力隨濃度增加逐漸加強(qiáng)。當(dāng)濃度為3×10-4mg/mL時,姜黃精油和VE對羥自由基的清除效果均顯著增加,清除率接近100%,且姜黃精油與VE的清除能力相當(dāng)。

圖2　不同濃度VE和姜黃精油對羥自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity against ·OH radicals of different concentrations of VE and turmeric essential oil

2.3姜黃精油抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化的能力

由圖3可知,姜黃精油和VE均表現(xiàn)出一定的抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化的能力,而且姜黃精油抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化的能力與相同濃度的VE的抑制效果相當(dāng)。4 mg/mL的姜黃精油和VE對亞油酸過氧化的抑制率均超過了50%。

圖3　VE和姜黃精油對亞油酸脂質(zhì)過氧化的抑制能力Fig.3　The inhibitory capacity of VE and turmeric essential oil against linoleic acid oxidation

2.4姜黃精油的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性

2.4.1姜黃精油的細(xì)胞毒性圖4顯示,姜黃精油在0.02%(v/v)濃度范圍以內(nèi)時,HepG2細(xì)胞的細(xì)胞存活率與對照組基本一致,說明當(dāng)姜黃精油濃度低于0.02%(v/v)時,對細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定在0.02%(v/v)濃度以內(nèi)進(jìn)行。

圖4　不同濃度姜黃精油對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用Fig.4　Cytotoxicity of different concentrations of turmeric essential oil on HepG2 cells assayed by MTS test

2.4.2姜黃精油的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性采用流式細(xì)胞儀對HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧含量進(jìn)行分析,分析圖譜見圖5,對分析圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì),統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖6。由圖5、圖6可知,細(xì)胞培養(yǎng)液(空白組,BLANK)自身的熒光強(qiáng)度非常弱,未用DCFH-DA刺激的HepG2細(xì)胞(陰性對照組,NTC)自發(fā)熒光也較弱,其陽性細(xì)胞率僅為5.74%,當(dāng)用DCFH-DA刺激、但未用精油處理后HepG2細(xì)胞(陽性對照組,PTC)的陽性細(xì)胞率達(dá)到了85.34%,而用0.001%,0.005%,0.01%(v/v)濃度的姜黃精油處理后,相比陽性對照組(PTC)其陽性細(xì)胞率分別降低到了22.36%、10.64%和14.29%。結(jié)果證明了姜黃精油能有效降低HepG2細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA的熒光強(qiáng)度,降低陽性細(xì)胞率,清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧,具有一定的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性。

圖5　不同濃度姜黃精油處理后HepG2細(xì)胞陽性細(xì)胞率的流式細(xì)胞儀分析圖譜Fig.5　Flow cytometry analysis of different concentrations of turmeric essential oil on positive cell ratio of HepG2 cells注：BLANK為空白，NTC為陰性對照，PTC為陽性對照，A、B、C分別為0.001%、0.005%、0.01%(v/v)姜黃精油處理組。

圖6　不同濃度姜黃精油對HepG2細(xì)胞陽性細(xì)胞率的影響.Fig.6　Effect of different concentrations of turmeric

3　討論

羥基自由基是活性氧類物質(zhì)中化學(xué)活性最強(qiáng)的物質(zhì)[11],本研究結(jié)果顯示姜黃精油對羥自由基具有很高的清除率,與VE的清除效果相當(dāng),在濃度為3×10-4mg/mL時,對羥自由基的清除率就達(dá)到了100%。脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致很多食品酸敗變質(zhì)的原因[16],本研究結(jié)果顯示,姜黃精油可以很好地抑制亞油酸的脂質(zhì)過氧化,與VE的作用效果相當(dāng)。姜黃精油具有較好的抗氧化活性,在某些方面與VE的效果相當(dāng)。

目前ABTS法、羥自由基法、抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化等方法來都是通過化學(xué)反應(yīng)來檢測物質(zhì)的抗氧化活性,其優(yōu)點(diǎn)是快速簡便。但是這些方法并不能真實(shí)的反應(yīng)有機(jī)體對物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、代謝,及其在有機(jī)體內(nèi)有效的作用濃度。因此細(xì)胞水平的抗氧化實(shí)驗(yàn)提供了一種更接近生物有機(jī)體體內(nèi)水平的一種抗氧化研究方法[17]。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃精油在濃度低于0.02%(v/v)時,其對HepG2細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒作用,證明姜黃精油作為一種食品抗氧化劑是安全的。我們的研究結(jié)果顯示不同濃度的姜黃精油均可以有效降低H2O2刺激HepG2產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平,證明了姜黃精油在細(xì)胞內(nèi)也具有較好的抗氧化能力。

4　結(jié)論

4.1姜黃精油對ABTS+自由基具有良好的清除效果,但其清除能力低于VE;對羥自由基的清除效果非常明顯,與VE的清除能力相當(dāng);并且能有效抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化。

4.2姜黃精油能有效清除HepG2細(xì)胞內(nèi)的活性氧,并且沒有明顯的細(xì)胞毒作用,具有開發(fā)為天然安全的食品抗氧化劑的潛力。

[1]Maria G M. Antioxidant and anti-inflammatory activities of essentialoils:a short review[J]. Molecules,2010,15(12):9252-9287.

[2]Goze I,Alim A,Cetinus SA,et al. Antimicrobial,antioxidant,and antispasmodic activities and the composition of theOriganumacutidens(Hand.-Mazz.)letswaart[J]. Journal of Medicinal Food,2010,13(3):705-709.

[3]Mechergui K,Coelho J A,Serra M C,et al. Essential oils ofOriganumvulgareL. subsp. glandulosum(Desf.)letswaart from Tunisia:chemical composition and antioxidant activity[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2010,90(10):1745-1749.

[4]Jia H L,Ji Q L,Xing S L,et al. Chemical composition and antioxidant,antimicrobial activities of the essential oils ofThymusmarschallianusWill. andThymusproximusSerg[J]. Journal of Food Science,2010,75(1):59-65.

[5]孫乃有,張衛(wèi). 姜黃有效成分的提取及其油基色素制備[J]. 食品工業(yè)科技,2003,24(7):49-50.

[6]湯敏燕,汪洪武,孫凌峰. 中藥姜黃揮發(fā)油化學(xué)成分研究[J]. 江西師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2000,24(3):274-276.

[7]石雪蓉,顧健,譚睿. 姜黃揮發(fā)油抗腫瘤作用機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床,2003,19(6):15-16.

[8]趙澤貞,溫登瑰,魏麗珍,等. 姜黃油抗突變作用機(jī)理進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究[J]. 癌變、畸變、突變,1999,11(2):75-77.

[9]Sindhu S,Chempakam B,Lee N K,et al. Chemoprevention by essential oil of turmeric leaves(CurcumalongaL.)on the growth ofAspergillusflavusand aflatoxin production[J]. Food and Chemical Toxicology,2011,49(5):1188-1192.

[10]Singh S,Dass S S,Singh G,et al. Composition,invitroantioxidant and antimicrobial activities of essential oil and oleoresins obtained from black cumin seeds(NigellasativaL.)[J]. Biomed Research International,2014,209(2):1-10.

[11]Chun S S,Vattem D A,Lin Y T,et al. Phenolic antioxidants from clonal oregano(Origanumvulgare)with antimicrobial activity againstHelicobacterpylori[J]. Process Biochemistry,2005,40(9):809-816.

[12]劉駿. 結(jié)晶紫分光光度法測定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基[J]. 武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2005,24(2):53-55.

[13]Zainola M K,Abd-Hamida A,Yusof S. Antioxidative activity and total phenolic compounds of leaf,root and Petiole of four aeeessions ofCentellaasiatiea(L.)Urban[J]. Food Chemistry,2003,81(4):575-581.

[14]Royall J A,Ischiropoulos H. Evaluation of 2′,7′-dichlorofluorescin and dihydrorhodamine 123 as fluorescent probes for intracellular H2O2in cultured endothelial cells[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,1993,302(2):348-355.

[15]張紅城,趙亮亮,胡浩,等. 蜂膠中多酚類成分分析及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué),2014,35(13):59-65.

[16] 施琳,尉芹,趙忠,等. 苦杏殼木醋液多酚對核桃油過氧化的抑制作用[J]. 食品科學(xué),2013,34(5):76-80.

[17]Wolfe K L,Liu R H. Cellular antioxidant activity(CAA)assay for assessing antioxidants,foods,and dietary supplements[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(22):8896-8907.

Study on antioxidant activity of turmeric essential oil

WEI Juan,SU Hai-lan,ZHANG Xi-tong,BI Yang*

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Turmeric(CurcumalongaL.)is a plant belonging to the family of Zingiberaceae,it has been commonly used in Chinese traditional medicine and food coloring. In this study,the turmeric essential oil was extracted by steam distillation,and its antioxidant capacity was evaluated based on ABTS radical and hydroxyl free radical(·OH)scavenging activities,inhibition of lipid peroxidation in linoleie acid. Its cytotoxic effect on HepG2 cells was evaluated by mitochondrial-respiration-dependent 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium(MTS)assay,the antioxidant effect in cell levels was investigated by flow cytometry. The results indicated that turmeric essential oil exhibited good scavenging activities against ABTS free radicals,but the scavenging rate was lower than that of VE. The essential oil could significantly scavenge ·OH radicals,the scavenging rate was similar with that of VE. And it could inhibit lipid peroxidation in linoleie acid. Within the concentration of 0.02%(v/v),the essential oil had no obvious cytotoxicity on HepG2 cells,and could scavenge the reactive oxygen in them. It is suggested that turmeric essential oil could be developed as a food addictive of natural antioxidants.

turmeric;essential oil;antioxidant

2015-11-09

魏娟(1982-)，女，碩士，講師，研究方向：果蔬采后生物學(xué)與技術(shù)，天然產(chǎn)物生物學(xué)活性，E-mail：weijuan@gsau.edu.cn。

畢陽(1962-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬采后生物學(xué)與技術(shù)，E-mail：biyang@gsau.edu.cn。

甘肅省青年科技基金計(jì)劃(1208RJYA095)；國家自然科學(xué)基金(31360382)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0141-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.019