周純潔,趙　博,吳　丹,鄧美林,黃思瑜

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院,重慶 401121)

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QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蔬菜中6種植物生長調(diào)節(jié)劑

周純潔,趙博,吳丹,鄧美林,黃思瑜

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院,重慶 401121)

為提高高沸點極性植物生長調(diào)節(jié)劑的檢驗效率,建立同時測定蔬菜中6種羧酸類植物生長調(diào)節(jié)劑(吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、2,4-D、α-萘乙酸、赤霉酸、4-氯苯氧乙酸)殘留量的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法。樣品采用含1%乙酸的乙腈提取,無水硫酸鎂-氯化鈉鹽析,無水硫酸鎂-石墨化炭黑(GCB)分散固相萃取(d-SPE)凈化。液相色譜以BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)為分析色譜柱,乙腈和0.01%乙酸水溶液作流動相進行梯度洗脫。質(zhì)譜分析采用電噴霧負離子電離、多反應監(jiān)測模式,以基質(zhì)匹配標準曲線外標法定量。6種植物生長調(diào)節(jié)劑在各自濃度范圍內(nèi)線性良好(r>0.99),以黃瓜和番茄為代表性基質(zhì)進行3個水平加標回收實驗,回收率在81.6%～108%之間,相對標準偏差(RSD)在1.3%～8.4%之間,方法檢出限為0.5～6 μg/kg。該方法操作簡便、耗時短、靈敏度和準確性好,可滿足蔬菜中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的快速測定的需要。

植物生長調(diào)節(jié)劑,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,蔬菜,QuEChERS

隨著植物生長調(diào)節(jié)劑的廣泛使用,其安全性受到越來越多的關注[1-2]。植物生長調(diào)節(jié)劑殘留對蔬菜質(zhì)量安全的影響已經(jīng)逐漸引起了各國的重視,其殘留限量標準也在不斷被加強[3-4]。我國國家標準GB 2763《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對蔬菜中部分植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留限量進行了規(guī)定,比如,番茄中α-萘乙酸為0.1 mg/kg,幾種常見蔬菜中2,4-D的殘留限量在0.05～0.5 mg/kg之間。目前我國針對植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測方法主要有液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5-10]。液相色譜法靈敏度較低,且不能提供分析物結(jié)構(gòu)方面的信息;氣相色譜-質(zhì)譜法在針對沸點較高、極性較大的植物生長調(diào)節(jié)劑的測定時往往需要衍生化,操作繁瑣且檢驗周期較長;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度和準確性均較高,且對于極性化合物具有良好的色譜保留能力,在高沸點極性化合物的分析方面具有獨特的優(yōu)勢。

表1　6種植物生長調(diào)節(jié)劑的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)

注:*定量離子。

附劑時黃瓜(羧酸類植物生長調(diào)節(jié)劑(吲哚乙酸類、苯氧乙酸類、萘乙酸類、赤霉酸類等)通常具有較高的沸點和極性,且其色譜保留行為和提取試劑pH對其溶解性的影響均具有一定的相似性。因此,有必要建立一套針對蔬菜中羧酸類植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的簡便、快速、準確的測定方法。本實驗采用QuEChERS技術[11-13]對樣品進行前處理,建立同時檢測蔬菜中6種羧酸類植物生長調(diào)節(jié)劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法,對色譜條件和樣品前處理過程進行了優(yōu)化,以期得到簡便快速,回收率、靈敏度和重現(xiàn)性均能滿足日常檢測要求的羧酸類植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

α-萘乙酸、2,4-D、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸和4-氯苯氧乙酸純度均>98%,購于Dr. Ehrenstorfer公司;赤霉酸純度>99%,J&K Scientific公司;無水硫酸鎂和氯化鈉均為分析純,購于成都市科龍化工試劑廠;無水乙酸鈉分析純,天津市大茂化工試劑廠;C18粉和PSA購于Welch公司;GCB購于Supelco公司;乙酸銨色譜純,CNW公司;乙酸色譜純,Thermo-Fisher公司;甲酸色譜純,ACS公司;乙腈色譜純,Merck公司;實驗用水超純水;蔬菜樣品黃瓜、番茄、四季豆、萵筍、油麥菜、白菜市售。

API 4000型三重四級桿質(zhì)譜(配電噴霧離子源)AB SCIEX公司;ACQUITY超高效液相色譜儀Waters公司;VORTEX GENIUS 3型旋渦振蕩器IKA公司;CF15RXⅡ型高速冷凍離心機HITACHI公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制分別準確稱取6種植物生長調(diào)節(jié)劑(α-萘乙酸、2,4-D、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、4-氯苯氧乙酸、赤霉酸)標準品,用甲醇配成濃度各為1 mg/mL的標準儲備液,-18 ℃儲存,有效期3個月。

1.2.2樣品前處理提取:準確稱取5 g(精確至0.01 g)已均質(zhì)的蔬菜樣品于50 mL具塞離心管中,加入10 mL含1%乙酸的乙腈,渦旋1 min混勻。

分配:加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉的混合粉末,迅速振搖,渦旋振蕩1 min,以4000 r/min離心5 min。

凈化:轉(zhuǎn)移2 mL上清液至裝有200 mg無水硫酸鎂和10 mg石墨化炭黑(GCB)的具塞離心管中,渦旋混合1 min,以10000 r/min離心2 min。取上清液過0.22 μm有機系濾膜,待測。

1.2.3儀器條件ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相:A為乙腈,B為0.01%乙酸水溶液;柱溫40 ℃;流速0.4 mL/min;進樣量5 μL;梯度洗脫程序:0～0.5 min,10% A;0.5～1.5 min,10% A～95% A;1.5～3.0 min,95% A;3.0～4.0 min,95% A～10% A。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,負離子模式(ESI-),多反應監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓(IS):-4500 V;離子源溫度:550 ℃;霧化氣(GS1):2.8×105Pa;輔助氣(GS2):3.5×105Pa;氣簾氣(CUR):2.1×105Pa;定性離子對、定量離子對、去簇電壓(Declustering potential)和碰撞能(Collision energy)見表1。

1.3數(shù)據(jù)處理

用空白樣品基質(zhì)溶液將標準儲備液稀釋得到不同濃度的基質(zhì)混合標準工作溶液,按1.2.3所述方法測定。采用Analyst? 1.5.2軟件進行數(shù)據(jù)處理,得到基質(zhì)匹配標準曲線,外標法定量。

2　結(jié)果與討論

2.1流動相的選擇

首先考察了乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時,6種植物生長調(diào)節(jié)劑混合標準溶液的分離效果。實驗發(fā)現(xiàn),乙腈-水作為流動相時，赤霉酸和4-氯苯氧乙酸在色譜柱上的保留時間分別為0.75 min和0.77 min，保留效果較差，乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液作流動相時，兩種化合物的保留時間分別為1.35 min和1.58 min，而乙腈-0.1%甲酸水溶液作流動相時，保留效果較好，兩種化合物保留時間分別為1.63 min和1.86 min，但其它4種化合物響應值均有不同程度的降低,見圖1。該結(jié)果表明,流動相中甲酸的引入有利于化合物在色譜柱上的保留,但由于質(zhì)譜采用的是電噴霧電離負離子模式采集數(shù)據(jù),甲酸的引入大大降低了各化合物的離子化效率。因此,考慮采用乙腈-乙酸水溶液作流動相。

圖1　不同流動相時6種植物生長調(diào)節(jié)劑的相對峰面積Fig.1　Relative peak area of 6 plant growth regulators using different mobile phase

由于α-萘乙酸和4-氯苯氧乙酸在m/z 184.7/140.8離子對監(jiān)測時均有響應,4-氯苯氧乙酸保留時間變大可能導致其與α-萘乙酸的色譜峰發(fā)生重疊,影響分離效果,本實驗還對流動相中乙酸的濃度進行了優(yōu)化。圖2為乙腈-水、乙腈-0.001%乙酸水溶液、乙腈-0.01%乙酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液作流動相時m/z 184.7/140.8離子對的色譜圖。圖2表明,隨著乙酸濃度的增大,4-氯苯氧乙酸的保留時間逐漸變大,但采用乙腈-0.1%乙酸水溶液作流動相時,α-萘乙酸和4-氯苯氧乙酸已無法實現(xiàn)基線分離。因此,本實驗選擇乙腈-0.01%乙酸水溶液作流動相,可兼顧各化合物的質(zhì)譜響應及色譜保留效果。

圖2　不同乙酸水溶液作為流動相時m/z 184.7/140.8離子對的色譜圖Fig.2　Chromatogram of ion pair m/z 184.7/140.8 using an aqueous phase containing acetic acid注:(A)0%,(B)0.001%,(C)0.01%,(D)0.1%。

2.2QuEChERS樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取劑的選擇6種植物生長調(diào)節(jié)劑在水中溶解性均較小,因此本實驗采用有機溶劑作為提取劑。由于蔬菜中通常含有大量的色素,若采用非極性有機溶劑容易將色素同時提取出來,所以考慮采用乙腈提取。乙腈對于不同極性的物質(zhì)均有一定的溶解能力,且所提取的色素等干擾物質(zhì)較少,滿足多種物質(zhì)同時檢測時提取劑的要求[14]?？紤]到待測化合物分子結(jié)構(gòu)中均含有羧基,乙酸的加入有利于其存在形態(tài)從離子態(tài)向分子態(tài)轉(zhuǎn)變,從而增加其在乙腈中的溶解度,以增加乙腈的提取效率。實驗分別考察了用乙腈和1%乙酸乙腈作為提取劑時,各化合物的回收率結(jié)果見表2,發(fā)現(xiàn)乙酸的加入對赤霉酸的提取效率影響較大,其回收率可由35%提高到90%。因此,實驗選擇用1%乙酸乙腈作為提取劑。

表2　不同提取劑提取時6種植物生長調(diào)節(jié)劑的加標回收率(50 μg/kg)

2.2.2分配劑的選擇QuEChERS方法主要包括提取、分配和凈化三部分,其中分配步驟中加入的鹽可以促使有機相與水相分層,降低待測物在水相中的溶解度,并除去提取液中的水分。本實驗分別考察了加入無水硫酸鎂-氯化鈉和無水硫酸鎂-無水乙酸鈉時各化合物的回收率。結(jié)果見圖3,表明采用無水硫酸鎂-無水乙酸鈉體系作為分配劑時,6種化合物的回收率均較低。這可能是由于緩沖體系的使用使提取液中雜質(zhì)增多,且弱堿性乙酸鈉的引入抑制了各化合物由離子態(tài)向分子態(tài)的轉(zhuǎn)變所致。因此,實驗選擇在提取步驟中加入無水硫酸鎂-氯化鈉作為分配劑。

圖3　不同分配劑時黃瓜(A)和番茄(B)中6種化合物的加標回收率(50 μg/kg)Fig.3　The recoveries of 6 plant growth regulators (spiked 50 μg/kg)in cucumber(A)and tomato(B) using different distribution agents

2.2.3吸附劑的選擇與傳統(tǒng)的固相萃取方法不同,QuEChERS技術是將適量的吸附劑直接作用于提取液中,以除去樣品提取液中大部分雜質(zhì)。常用的吸附劑主要有乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、C18粉等。PSA可以有效去除提取液中的脂肪酸和糖類的干擾,GCB主要用于去除色素的干擾,而C18粉具有良好的脫脂能力[15]。本實驗考察了無水硫酸鎂+PSA、無水硫酸鎂+C18粉和無水硫酸鎂+GCB的凈化效果,結(jié)果表明,GCB可以有效去除提取液中的色素,但C18粉和PSA脫色效果不明顯,提取液和凈化液顏色差異很小。如圖4所示,當采用無水硫酸鎂+PSA作為吸附劑時,赤霉酸、2,4-D和4-氯苯氧乙酸的回收率明顯降低;而采用無水硫酸鎂+C18粉作為吸附劑時,吲哚-3-丁酸的回收率相對較低。雖然GCB對吲哚-3-丁酸也有一定的吸附作用,但為了有效去除提取液中大量的色素,延長色譜柱的使用壽命,本實驗選擇無水硫酸鎂+GCB作為吸附劑。由于GCB的用量與其吸附能力相關,本實驗還對GCB的加入量進行了優(yōu)化,當加入1.25 mg/mL GCB時,脫色效果較差;隨著GCB加入量的增加,脫色效果逐漸增強,當加到5 mg/mL GCB以上時,提取液中的色素脫除效果比較理想,凈化后溶液呈淡黃色。繼續(xù)增加GCB的用量,雖然脫色效果更好,但各化合物的回收率明顯降低。如圖5所示,當加入10 mg/mL以上的GCB時吲哚-3-丁酸、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、α-萘乙酸和吲哚-3-乙酸的回收率逐漸降低,因此本實驗吸附劑GCB的用量選擇5 mg/mL。

圖4　加入不同吸附劑時黃瓜(A)和番茄(B)中6種化合物的加標回收率(50 μg/kg)Fig.4　The recoveries of 6 plant growth regulators(spiked 50 μg/kg)in cucumber(A)and tomato(B) when adding different sorbents

圖5　加入不同量GCB作為吸附劑時黃瓜(A)和番茄(B)中6種化合物的加標回收率(50 μg/kg)Fig.5　The recoveries of 6 plant growth regulators (spiked 50 μg/kg)in cucumber(A) and tomato(B)when adding different quantities of GCB as sorbents

2.3線性方程、方法檢出限及定量限

取陰性蔬菜樣品,按照1.2.2步驟進行樣品前處理得到空白基質(zhì)溶液,配制6種化合物的標準系列工作溶液,以峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸分析,這6種化合物在相應的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好,線性相關系數(shù)(r)均大于0.99。以3倍信噪比(S/N=3)濃度估算方法檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N=10)所對應濃度作為方法定量限(LOQ),6種植物生長調(diào)節(jié)劑方法檢出限在0.5～6 μg/kg之間,方法定量限在1.5～18 μg/kg之間,見表3。

表3　6種化合物的線性范圍、回歸方程、方法檢出限和定量限

表4　6種植物生長調(diào)節(jié)劑的平均回收率和相對標準偏差(n=6)

[1]張鋒,潘康標,田子華. 植物生長調(diào)節(jié)劑研究進展及應用對策[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2012(1):193-195.

[2]史曉梅,金芬,黃玉婷,等. 水果中常用植物生長調(diào)節(jié)劑的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(4):417-422.

[3]朱杰麗,楊柳,柴振林,等. 國內(nèi)外植物生長調(diào)節(jié)劑限量標準分析研究[J]. 生物災害科學,2013,36(2):232-237.

[4]王嵐,林海丹,徐娟,等. 國內(nèi)外植物生長調(diào)節(jié)劑殘留限量標準的比對分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學,2015,42(3):70-73.

[5]陳衛(wèi)軍,張耀海,李云成,等. 果蔬中常用植物生長調(diào)節(jié)劑分析方法研究進展[J]. 食品科學,2012,33(11):283-289.

[6]王一茜,張廣華,何洪巨. 蔬菜中主要生長調(diào)節(jié)劑殘留檢測方法的研究進展[J]. 現(xiàn)代儀器,2012,18(2):6-10.

[7]劉婧婧,宮萍,張曉梅,等. 液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜法快速測定草莓中6種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量[J]. 色譜,2012,30(10):1012-1016.

[8]牟艷莉,郭德華,丁卓平,等. 固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對瓜果中7種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的測定[J]. 分析測試學報,2013,32(8):935-940.

[9]吳平谷,譚瑩,張晶,等. 分級凈化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定豆芽中10種植物生長調(diào)節(jié)劑[J]. 分析化學,2014,42(6):866-871.

[10]蔡軼平,孫志偉,王小艷,等. 同位素編碼衍生-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬樣品中的羧酸類植物生長調(diào)節(jié)劑[J]. 分析化學,2015,43(3):419-423.

[11]Wilkowska A,Biziuk M. Determination of pesticide residues in food matrices using the QuEChERS methodology[J]. Food Chem,2011,125(3):808-812.

[12]Sack C,Smoker M,Chamkasem N,et al. Collaborative Validation of the QuEChERS Procedure for the Determination of Pesticides in Food by LC-MS/MS[J]. J Agric Food Chem,2011,59(12):6383-6411.

[13]李麗娟,吳青,翁柔丹,等. 氣相色譜方法同時測定果蔬及糧谷中6種除草劑殘留[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(18):84-88.

[14]申秀麗,孫寶利,董一威,等. QuEChERS-GC/ECD法分析土壤中殘留有機氯農(nóng)藥[J].現(xiàn)代科學儀器,2009(1):84-87.

[15]Klinsunthorn N,Petsom A,Nhujak T. Determination of steroids adulterated in liquid herbal medicines using QuEChERS sample preparation and high-performance liquid chromatography[J]. J Pharm Biom Anal,2011,55(5):1175-1178.

2.4方法回收率和精密度

以黃瓜和番茄為代表基質(zhì),進行添加回收和精密度實驗。3個添加水平的回收率為81.6%～108%,相對標準偏差(RSD)均不大于8.4%,見表4。

2.5實際樣品測定

將該方法分別應用于黃瓜、番茄、四季豆、萵筍、油麥菜、白菜6種蔬菜25批次樣品的檢測,結(jié)果在3批次四季豆和1批次白菜中檢出吲哚-3-乙酸,濃度在10.2～17.2 μg/kg之間;在3批次四季豆中檢出赤霉酸,濃度在8.0 μg/kg～17.1 μg/kg之間;在1批次番茄中檢出7.6 μg/kg的2,4-D,低于GB 2763《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對番茄中2,4-D的限量要求(0.5 mg/kg)。

3　結(jié)論

本實驗采用QuEChERS樣品前處理技術,建立了同時測定蔬菜中6種羧酸類植物生長調(diào)節(jié)劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品采用含1%乙酸的乙腈提取,無水硫酸鎂-氯化鈉鹽析,無水硫酸鎂-石墨化炭黑(GCB)分散固相萃取(d-SPE)凈化。液相色譜以C18柱為分析色譜柱,乙腈和0.01%乙酸水溶液作流動相進行梯度洗脫。質(zhì)譜分析采用電噴霧負離子電離、多反應監(jiān)測模式,以基質(zhì)匹配標準曲線外標法定量。6種植物生長調(diào)節(jié)劑在各自濃度范圍內(nèi)線性良好,線性相關系數(shù)(r)均大于0.99,以黃瓜和番茄為代表性基質(zhì)進行三水平加標回收實驗,獲得了理想的回收率(81.6%～108%),相對標準偏差(RSD)在1.3%～8.4%之間。本方法簡便快速,靈敏度和準確性高,應用于日常檢測可以縮短檢測周期,降低檢測成本,對于蔬菜中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留檢測具有重要意義。

表5　蔬菜中植物生長調(diào)節(jié)劑檢出情況

注:“ND”代表未檢出。

Determination of six plant growth regulators in vegetables by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHOU Chun-jie,ZHAO Bo,WU Dan,DENG Mei-lin,HUANG Si-yu

(Chongqing Institute for Food and Drug Control,Chongqing 401121,China)

To improve the detection efficiency of polar plant growth regulators with high boiling point,a new method for the simultaneous determination of 6 carboxyl-contained plant growth regulators(indole-3-acetic acid,indole-3-butyric acid,2,4-D,α-naphthaleneacetic acid,gibberellic acid and 4-chlorophenoxyacetic acid)residues in vegetables was developed by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The analytes were extracted with acetonitrile containing 1% acetic acid,and salted out with anhydrous magnesium-sodium chloride. The extracts were cleaned up by dispersive solid phase extraction(d-SPE)using anhydrous magnesium-graphitized carbon black(GCB)as sorbents. Chromatographic analysis was carried out on BEH C18column(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)using a mobile phase comprised of acetonitrile and water(containing 0.01% acetic acid)in gradient program. The plant growth regulators were analyzed by negative electrosprary ionization(ESI-)tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring(MRM)mode. Quantification was achieved using matrix-matched external standard method. The calibration curves showed good linearity in each concentration range,and the recoveries of the 6 plant growth regulators spiked at three levels in cucumber and tomato were between 81.6% and 108%,with the relative standard deviation(RSD)ranging from 1.3% to 8.4%. The limits of detection(LODs)in vegetables were in the range of 0.5 μg/kg and 6 μg/kg. The method is simple,convenient,time-saving,sensitive and accurate,and suitable for the rapid determination of plant growth regulators residues in vegetables.

plant growth regulators;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);vegetables;QuEChERS

2015-10-19

周純潔(1985-)，女，博士，工程師，研究方向：食品安全檢測，E-mail:chunjie_45@163.com。

重慶市應用開發(fā)計劃項目(cstc2013yykfB80016)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)10-0094-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.009