李園，劉艷，段振華（海南大學食品學院，海南?？?70228）

雙酶法制備牡蠣抗氧化酶解液的工藝優(yōu)化

李園，劉艷，段振華*
（海南大學食品學院，海南?？?70228）

以牡蠣肉為原料，用無花果蛋白酶和風味蛋白酶水解牡蠣肉制備抗氧化酶解液，以DPPH·清除率、氨基酸態(tài)氮含量和蛋白質回收率為指標進行單因素和正交試驗，探究總酶量、pH、酶解時間和酶比對酶解效果的影響。得到雙酶制備牡蠣抗氧化酶解液的最佳工藝條件為：總酶量12%，pH6.0，酶解時間3.0 h，無花果蛋白酶與風味蛋白酶的比例為5∶1（質量比）；該酶解液具有較高抗氧化活性和蛋白質回收率，其氨基酸態(tài)氮含量為0.223 g/100 mL，DPPH·清除率可達89.42%、蛋白質回收率達到了79.81%。

風味蛋白酶；無花果蛋白酶；牡蠣；抗氧化活性

牡蠣（Oyster）俗稱蠔、海蠣子，牡蠣肉中含有豐富的蛋白質、活性肽、糖原、?；撬帷⒍嘉逑┧幔‥PA）、二十二碳六烯酸（DHA），具有重要的食用價值和藥用價值［1］。以牡蠣肉為原料，通過酶解制取的生物活性肽、活性多糖、優(yōu)質蛋白質、氨基酸及多種維生素、礦物質等營養(yǎng)成分易于人體的消化吸收。研究發(fā)現(xiàn)牡蠣肉酶解產物有很好的降血壓［2］、降血脂［3］、醒酒護肝［4］、抗氧化［5］以及抗癌效果［6］。在加工海洋保健功能制品方面，具有誘人的發(fā)展前景［7］。牡蠣抗氧化活性肽的制備，主要是單酶水解和雙酶水解，由于蛋白酶對肽鍵作用的專一性，因此僅采用單酶水解，水解度較低。復合酶解的方法有較好的酶解效果，因此本文采用無花果蛋白酶與風味蛋白酶的復合酶解，根據不同酶對肽鍵的酶切位點的不同，避免了水解度過低的問題，并根據優(yōu)化試驗得到較高抗氧化活性的酶解液，為開發(fā)牡蠣功能性食品提供了重要參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

長牡蠣（Crassostrea gigas）：?？谑醒亟髀忿r貿市場；花果蛋白酶（酶活力1.0×105U/g）：河南百盛化工產品有限公司；風味蛋白酶（酶活力1.5×104U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。1.2儀器與設備

HH-S26S電熱恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠；1085-1恒溫磁力攪拌器：金壇市富華儀器有限公司；EL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C型實驗室pH計：上海偉業(yè)儀器廠；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；722可見分光光度計：上海奧譜勒儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1氨基酸態(tài)氮的測定

氨基酸態(tài)氮含量測定：中性甲醛電位滴定法［8］。

1.3.2DPPH·清除率的測定

取牡蠣酶解上清液2 mL，加入2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液2 mL，混勻后在室溫下避光反應30 min，在517 nm下測定吸光度Ai，樣品組以等體積無水乙醇溶液代替DPPH溶液，測定吸光度Aj，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調零，平行測3次取平均值［9］。

式中：A0為對照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

1.3.3蛋白質回收率

蛋白質含量的測定：采用GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法。

式中：m為酶解液中蛋白質含量，g/100 g；M為蛋白質總量，g/100 g。

1.3.4牡蠣水解條件的優(yōu)化

1.3.4.1工藝流程

新鮮牡蠣肉→清洗→勻漿→調料水比（1∶2，g/mL）→調pH→加酶→50℃保溫下酶解→滅酶（95℃～100℃，10 min）→離心（6 000 r/min，15 min）→取上清液即酶解液→指標測定

1.3.4.2單因素試驗

單因素及其水平為：總酶量（6%、8%、10%、12%、14%）、酶比（無花果蛋白酶∶風味蛋白酶=5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5，均為質量比）、酶解時間（1、2、3、4、5 h）、pH （5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）。采取控制變量法，按上述設計的不同水平值依次進行，與此同時另外3個因素取中間水平，分析單因素各水平對酶解液的氨基酸態(tài)氮含量以及DPPH·清除率的影響。

1.3.4.3酶解工藝條件的優(yōu)化

利用正交試驗對單因素試驗結果進行條件優(yōu)化，并添加蛋白質回收率這一指標，確定制備酶解液的最佳條件。采用四因素三水平L9（34）正交表，正交試驗的因素和水平見表1。

表1　正交試驗因素與水平Table 1　Orthogonal test factors and levels

2　結果與分析

2.1總酶量對牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響

在酶解底物pH為6.5，無花果蛋白酶與風味蛋白酶的比例為1∶1（質量比），總酶量分別為6%、8%、10%、12%、14%，在50℃酶解3.0 h，總酶量對酶解效果的影響見圖1。

圖1　 總酶量對DPPH·清除率和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1　The effect of enzyme dosage on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

由圖1可知，氨基酸態(tài)氮含量隨著酶量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在總酶量10%～12%，氨基酸態(tài)氮含量上升趨勢加快，說明此時總酶量與底物濃度成正比反應，反應速率逐漸增加。而總酶量達12%后，大量產生的水解產物可能影響酶的活性，因此氨基酸態(tài)氮含量也急劇下降；DPPH·清除率隨總酶量的增加而逐漸增加，當總酶量超過10%，DPPH·清除率開始不斷下降，可能是由于水解過度，肽進一步水解變成游離氨基酸導致的［11］。此外，總酶量增加到一定量時，酶分子間碰撞的機會增加，可能還會引起酶自溶，不利于反應的進行，同時也增加了生產成本［12］，因此總酶量10%是單因素的最佳條件。

2.2不同pH對牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響

在總酶量10%，無花果蛋白酶與風味蛋白酶的比例為1∶1（質量比），50℃酶解3.0 h的情況下，酶解底物pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，pH對酶解效果的影響見圖2。

圖2　pH對DPPH·清除率和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2　The effect of pH on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

由圖2可知，隨著pH升高，氨基態(tài)氮含量與DPPH·清除率都呈先增后降的趨勢，兩種酶都是中性酶［13-14］，因此在中性條件下對牡蠣水解效果最好；不同的是兩指標開始下降的點有差異，可能由于pH過了6.5水解程度較高，導致肽過多分解為氨基酸，根據郭冬青等［15］的研究，pH6.5是無花果酶活性最穩(wěn)定條件，綜合考慮選擇pH6.5為最適pH。

2.3不同時間對牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響

在酶解底物pH6.5，無花果蛋白酶與風味蛋白酶的比例為1∶1（質量比），酶總量10%的前提下，在50℃下分別酶解1、2、3、4、5 h，結果如圖3所示。

圖3　時間對DPPH·清除率和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3　The effect of time on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

由圖3可知，隨時間的增加氨基酸態(tài)氮含量呈逐漸增加的趨勢，但在3 h之前增長速率較快，之后逐漸平穩(wěn)但并沒有下降的趨勢，說明時間越長酶解程度越高，但在3 h后變化不明顯，有可能是酶與底物濃度接近飽和狀態(tài)；DPPH·清除率同樣在3 h后增長趨勢發(fā)生變化，但先平緩后下降，其原因可能是酶解時間過長將增加多肽水解成氨基酸的可能性，失去了清除自由基的能力［13］，因此酶解最適時間選擇3 h。

2.4不同加酶比對牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量和DPPH·清除率的影響

在酶解底物pH6.5，總酶量10%，50℃酶解3 h的條件不變，分別以質量比為5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5的比例加入無花果酶和風味蛋白酶，結果見圖4。

圖4　雙酶酶比對DPPH·清除率和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4　The effect of proportion of two enzymes on amino acidnitrogen and DPPH radical scavenging activity

如圖4所示，無花果蛋白酶比例較風味蛋白酶多的時候對DPPH·清除率影響較大，隨著無花果酶比例的減少，清除率直線下降，但對風味蛋白酶的比例增大并不敏感；而氨基酸態(tài)氮含量則對風味蛋白酶高比率的條件較敏感，說明風味蛋白酶高比率的時候，肽多被水解成游離氨基酸，因此DPPH·清除率變化情況很小，而氨基酸態(tài)氮含量較高。同樣也驗證了兩種酶的切割位點不同且互補達到了較高的水解度，但綜合考慮兩個指標，在無花果酶比率較高時兩個指標的結果都是比較高的，因此選擇無花果蛋白酶與風味蛋白酶質量比為5∶1作為單因素最適酶比。

2.5正交試驗數據及其分析

正交試驗因素水平與直觀分析表，見表2。

根據表2的極差R1、R2、R3表示影響各指標的各因素主次順序，根據各試驗因子的平均值選取較優(yōu)水平。

根據表2分析的最優(yōu)水平以及主次影響可知，總酶量對蛋白質回收率和氨基酸態(tài)氮含量的影響較大，因此選擇總酶量為12%；pH對DPPH·清除率影響最大，因此優(yōu)先選擇其指標中的最優(yōu)水平即pH6.0；酶解時間對氨基酸態(tài)氮含量影響最大，故選擇酶解時間為3.0 h；酶比對蛋白質回收率影響最大，故選擇酶比為5∶1（質量比）。因此雙酶法制備牡蠣抗氧化酶解液的最佳工藝條件為A3B1C2D1，即總酶量12%，pH6.0，酶解時間3.0 h，無花果蛋白酶與風味蛋白酶的比例為5∶1（質量比）。

對最優(yōu)水平組合A3B1C2D1進行驗證試驗，制備的牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量為0.223 g/100 mL，DPPH·清除率為89.42%，蛋白質回收率為79.81%，其中DPPH·清除率與蛋白質回收率都明顯高于正交試驗所得到的所有數據，說明該優(yōu)化試驗具有可行性，能有效提高酶解液的抗氧化活性和蛋白質回收率。

表2　正交試驗因素水平與直觀分析表Table 2　The orthogonal factors level and intuitive analysis table

3　結論

以牡蠣酶解液中氨基酸態(tài)氮的含量、DPPH·清除率以及蛋白質回收率為指標，得到雙酶（無花果蛋白酶和風味蛋白酶）復合制備牡蠣酶解液的最佳工藝條件為：加酶量12%，pH 6.0，酶解時間3.0 h，酶比（無花果蛋白酶：風味蛋白酶）5∶1（質量比）。在此條件下，牡蠣酶解液氨基酸態(tài)氮的含量為0.223 g/100 mL、DPPH·清除率達89.42%、蛋白質回收率達到79.81%。選擇無花果蛋白酶與風味蛋白酶的復合酶解技術對牡蠣肉進行水解，能有效提高牡蠣酶解液的抗氧化活性和蛋白質回收率。并為無花果蛋白酶和風味蛋白酶的復合酶解技術奠定了基礎，為牡蠣酶解產生的活性肽等產物的利用和保健食品的開發(fā)提供了條件。

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Optimal Hydrolysis Process for Preparing Oyster Antioxidant Hydrolysates with Two Enzymes

LI Yuan，LIU Yan，DUAN Zhen-hua*
（College of Food Science and Engineering，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

In order to prepare oyster antioxidant hydrolysates，the oyster meat was hydrolyzed with flavourzyme and ficin simultaneously.The effects of enzyme dosage，pH，hydrolysis time and proportion of two enzymes on the hydrolysis were investigated by single-factor tests and orthogonal tests，and the indicators were protein recovery，DPPH radical scavenging activity and amino acid-nitrogen content.The optimal hydrolysis conditions were enzyme dosage 12%，pH6.0，hydrolysis time 3.0 h，and the proportion of ficin and flavourzyme were 5∶1 （mass ratio）.Under such conditions，the hydrolysates exhibited higher antioxidant activity and protein recovery. The content of amino acid-nitrogen up to 0.223 g/100 mL，DPPH radical scavenging rate reached 89.42%and the recovery of protein was 79.81%.

flavourzyme；ficin；oyster；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.028

國家“十二五”科技支撐計劃（2013BAB01B04）；海南省科技興海專項（XH201308）

李園（1993—），女（漢），大學本科，主要從事水產品食品科學技術研究工作。

2015-08-14