周　艷，王曉紅，王同坤，范得躍，劉俊芳

(河北科技師范學(xué)院 河北省板栗工程技術(shù)研究中心,河北 秦皇島,066600)

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鹽酸提取法和微波提取法提取燕山板栗多糖的最佳工藝及比較

周艷，王曉紅，王同坤*，范得躍，劉俊芳

(河北科技師范學(xué)院 河北省板栗工程技術(shù)研究中心,河北 秦皇島,066600)

為探明燕山板栗多糖的最佳提取工藝，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了鹽酸提取法和微波提取法提取板栗多糖的最佳條件，并采用苯酚-硫酸法和高效液相色譜法比較了兩種提取方法在多糖得率和分子量分布上的差異。結(jié)果表明：鹽酸提取法提取板栗多糖的最佳工藝為：鹽酸濃度為0.72 mol/L，提取時(shí)間為40 min，提取溫度為70 ℃，提取劑用量為20 mL/g，多糖得率為18.66%±2.54%；微波提取法提取板栗多糖的最佳提取工藝為：提取時(shí)間為50 s，微波強(qiáng)度為800 W/g，提取劑用量為30 mL/g，多糖得率為11.87%±0.87%；在最佳條件下鹽酸提取法可顯著提高板栗多糖得率，且分子量測定結(jié)果顯示鹽酸提取法對(duì)板栗多糖的降解作用小。因此，兩種提取方法中，鹽酸提取法是燕山板栗多糖提取工藝的較優(yōu)方法。

板栗多糖；提取工藝;鹽酸提取法；微波提取法；得率；分子量分布

板栗(CastaneamollissimaBlume)原產(chǎn)于中國，是我國的主要經(jīng)濟(jì)樹種之一，目前板栗多糖的提取方法主要有熱水提取法[1,2]、加壓溶劑萃取法[3]、亞臨界提取法[4]、超聲提取法[5,6]等。鹽酸提取法是通過鹽酸作用，使植物細(xì)胞吸水溶脹導(dǎo)致細(xì)胞破裂進(jìn)而釋放游離的多糖；微波提取法是根據(jù)微波在傳輸過程中遇到不同性質(zhì)的物質(zhì)時(shí)，會(huì)在微波的反射、穿透和吸收上產(chǎn)生差異，進(jìn)而選擇性地使細(xì)胞內(nèi)的極性分子的溫度升高，細(xì)胞內(nèi)壓增大，最終使細(xì)胞內(nèi)的有效成分自動(dòng)流出的原理進(jìn)行提取。目前，尚無有關(guān)鹽酸提取法和微波提取法提取板栗多糖的相關(guān)報(bào)道。

因此，為比較兩種方法對(duì)板栗多糖提取率及多糖分子量分布的影響，筆者采用正交試驗(yàn)優(yōu)化鹽酸提取法和微波提取法提取板栗多糖的工藝條件，并通過兩種提取方法的比較，篩選出板栗多糖的最佳提取方法和提取條件，為板栗資源的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料、儀器

板栗采自河北省遷西縣白廟子鄉(xiāng)李興莊優(yōu)種板栗示范采穗園的成熟期的燕龍板栗；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，硫酸，苯酚，鹽酸等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

JA2003N電子天平(上海精密科學(xué)有限公司生產(chǎn))；722S型可見光分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))；HHiS21電熱恒溫水浴鍋(山東醫(yī)療器械廠生產(chǎn))；YLA-2000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(黃山市恒豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司生產(chǎn))；Jsp-200金穗牌高速多功能粉碎機(jī)(浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠生產(chǎn))；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(美國安捷倫公司生產(chǎn))；G80W23YCSL-Q3格蘭仕微波爐(廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司生產(chǎn))。

1.2方法

1.2.1原料預(yù)處理將采集后的成熟燕龍板栗置于超低溫冰箱，-78 ℃保存30 d。取出后，將板栗去皮，切丁，40 ℃烘48 h，粉碎，過40目篩，放入干燥器中，備用[7]。

1.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 g/L)0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，依次置于25 mL試管中，加水補(bǔ)足至2.0 mL，以2.0 mL的純凈水為空白對(duì)照。搖勻后分別加入質(zhì)量濃度為50 g/L的苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，混勻，冷卻至室溫，于490 nm處測定各溶液吸光度(A)。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過線性擬合得到回歸方程為：Y=0.047 3x-0.009 8 (R2=0.998)，式中Y表示吸光值；x表示葡萄糖濃度，該方程線性關(guān)系良好(R2=0.998)，可以用此方程計(jì)算待測溶液中多糖質(zhì)量濃度。計(jì)算板栗總多糖得率。計(jì)算公式如下：

Y=[(C×V×稀釋倍數(shù))/M]×104

式中:Y為多糖得率(%)，C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的多糖質(zhì)量濃度(g/L)，V為樣品溶液體積(mL)，M為栗粉總質(zhì)量(g)。

1.2.3鹽酸提取法提取板栗多糖工藝條件優(yōu)化

① 提取工藝稱取板栗粉1 g (精確到0.0001)于三角瓶中，按比例加入一定體積的純凈水，用電熱恒溫水浴鍋提取板栗多糖，通過調(diào)節(jié)鹽酸濃度、提取時(shí)間、提取溫度及液料比確定最佳工藝。

② 單因素試驗(yàn)選取不同的鹽酸濃度(0.24，0.48，0.72，0.96，1.20 mol/L)，不同的提取時(shí)間(20，30，40，50，60 min)，不同的提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)，不同的提取劑用量(20，30，40，50，60 mL/g)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。采用苯酚-硫酸法[8]測定提取液的吸光度值，并計(jì)算多糖的得率。

③ 正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇鹽酸濃度、提取時(shí)間、提取溫度和提取劑用量為試驗(yàn)因素，以板栗多糖得率為試驗(yàn)指標(biāo)，采用4因素3水平即L9(34)正交表試驗(yàn)(表1)，優(yōu)化確定最佳提取工藝條件。

表1　鹽酸提取法提取板栗多糖的正交試驗(yàn)因素及水平

1.2.4微波提取法提取板栗多糖工藝條件優(yōu)化

①提取工藝稱取板栗粉1 g(精確到0.000 1)于三角瓶中，按比例加入一定體積的純凈水，用微波爐提取板栗多糖。

②單因素試驗(yàn)選取不同的提取時(shí)間(30，40，50，60，70，80 s)，不同的微波強(qiáng)度(800，640，480，320，160 W/g)，和不同的提取劑用量(20，30，40，50，60，70 mL/g)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。采用苯酚-硫酸法[6]測定提取液的吸光度值，并計(jì)算多糖的得率。

③正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間、微波強(qiáng)度和提取劑用量為試驗(yàn)因素，以板栗多糖得率為試驗(yàn)指標(biāo)，采用3因素3水平即L9(33)正交表試驗(yàn)(表2)。優(yōu)化確定最佳提取工藝條件。

表2　微波提取法提取板栗多糖的正交試驗(yàn)因素及水平

1.2.5不同提取方法對(duì)所得板栗多糖分子量分布的測定取適量板栗純多糖(提取所得多糖經(jīng)Sevage法去蛋白[9,10]、大孔樹脂AB-8吸附法去色素[11]后得到純多糖)溶于適量蒸餾水中，采用液相色譜法測定兩種提取方法所得板栗純多糖的分子量分布情況。在該方法中以蒸餾水為流動(dòng)相，以Agilent PL aquagel-OH MIXED-H 8 um 300×7.5 mm為固定相，以Agilent GPC/SEC Calibration Kits為標(biāo)樣，在流速為0.8 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測器溫度為35 ℃的條件下在RID檢測器上進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1鹽酸提取法提取工藝優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1單因素試驗(yàn)結(jié)果單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸濃度為0.96 mol/L，提取時(shí)間為40 min，提取溫度為60 ℃，提取液料比為30 mL/g時(shí)，板栗多糖得率最高(圖1)。此為鹽酸提法提取板栗多糖的最佳工藝條件。

2.1.2正交試驗(yàn)結(jié)果在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇鹽酸濃度、提取時(shí)間、提取溫度和提取劑用量等4個(gè)因素按L9(34)正交表進(jìn)行板栗多糖提取的正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，各因素對(duì)板栗多糖得率影響的主次順序依次為：提取溫度，提取劑用量，鹽酸濃度，提取時(shí)間(表3)。通過試驗(yàn)結(jié)果理論分析可得最佳組合為：鹽酸濃度0.72 mol/L，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間40 min，提取劑用量20 mL/g。

為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，根據(jù)最佳提取條件進(jìn)行了驗(yàn)證性試驗(yàn)。在最佳提取條件下，板栗多糖的實(shí)際得率為18.66 %±2.54%。與預(yù)測值相差不大，表明正交試驗(yàn)優(yōu)化鹽酸法提取板栗多糖的條件是可行的，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖1　鹽酸提取法提取板栗多糖的單因素試驗(yàn)結(jié)果a. 鹽酸濃度對(duì)板栗多糖得率的影響；b. 提取時(shí)間對(duì)板栗多糖得率的影響；c. 提取溫度對(duì)板栗多糖得率的影響；d. 提取劑用量對(duì)板栗多糖得率的影響

2.1.3方差分析結(jié)果經(jīng)過正交處理后，用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表4)表明，提取溫度、提取時(shí)間、鹽酸濃度及提取劑用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均達(dá)到了極顯著的水平。

表3　鹽酸法提取板栗多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

注：0.72，0.96，1.20為鹽酸濃度的3個(gè)水平；30，40，50為提取時(shí)間的3個(gè)水平； 50，60，70為提取溫度的3個(gè)水平；20，30，40為提取劑用量的3個(gè)水平。

表4　鹽酸法提取板栗多糖方差分析結(jié)果

2.2微波提取法提取工藝優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間為50 s，微波強(qiáng)度800 W/g，提取劑用量為40 mL/g時(shí)，板栗多糖得率最高(圖2)。此為微波提取法提取板栗多糖的最佳工藝條件。

2.2.2正交試驗(yàn)結(jié)果在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間、微波強(qiáng)度和提取劑用量等3個(gè)因素按L9(33)正交表進(jìn)行板栗多糖提取的正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，各因素對(duì)板栗多糖得率影響的主次順序依次為：提取劑用量，微波強(qiáng)度，提取時(shí)間(表5)。通過試驗(yàn)結(jié)果理論分析可得最佳組合為:提取時(shí)間50 s，微波強(qiáng)度800 W/g，提取劑用量30 mL/g。

為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，根據(jù)最佳提取條件進(jìn)行了驗(yàn)證性試驗(yàn)。在最佳提取條件下，板栗多糖的實(shí)際得率為11.87 %±0.87%。與預(yù)測值相差不大，表明正交試驗(yàn)優(yōu)化微波法提取板栗多糖的條件是可行的，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖2　微波提取法提取板栗多糖的單因素試驗(yàn)結(jié)果a. 提取時(shí)間對(duì)板栗多糖得率的影響；b. 微波強(qiáng)度對(duì)板栗多糖得率的影響；c. 提取劑用量對(duì)板栗多糖得率的影響

表5　微波法提取板栗多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

注：40，50，60為提取時(shí)間的3個(gè)水平；480，640，800為提取溫度的3個(gè)水平； 20，30，40為提取劑用量的3個(gè)水平。

2.2.3方差分析結(jié)果經(jīng)過正交處理后，用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表6)表明，提取時(shí)間、提取劑用量及微波強(qiáng)度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著。

2.3兩種提取方法所得板栗多糖的分子量分布

梁雪[11]通過GPC法測定燕龍板栗多糖的分子量為3.28×105Da；陳和生等[12]通過紙色譜和氣相色譜分析表明羅田板栗多糖平均分子量為1.64×105Da。本次研究中，鹽酸提取法所得多糖主要峰的分子量大于微波提取法所得多糖主要峰的分子量，且均小于已報(bào)道的板栗多糖的分子量。其原因可能是：微波提取法和鹽酸提取法在提取的過程中導(dǎo)致板栗多糖降解。本次研究表明：微波提取法對(duì)多糖的降解作用強(qiáng)于鹽酸提取法(圖3，表7)。因此，在提取板栗多糖時(shí)，鹽酸提取法優(yōu)于微波提取法。

表6　微波法提取板栗多糖方差分析結(jié)果

注：a.R2=0.757 (AdjustedR2=0.625)。

圖3　兩種提取方法所得板栗多糖的分子量分布圖a.鹽酸提取法；b.微波提取法

技術(shù)名稱主要峰的重均分子量Mw/Da鹽酸提取法 69776811124微波提取法 2502353

3　結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)研究確定了鹽酸輔助提取法提取板栗多糖的最佳工藝條件為：鹽酸濃度0.72 mol/L，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間40 min，提取劑用量20 mL/g；微波輔助提取法提取板栗多糖的最佳工藝條件為：提取時(shí)間50 s，微波強(qiáng)度800 W/g ，提取劑用量30 mL/g。在最佳提取工藝條件下，兩種方法提取板栗多糖的得率分別為18.66%±2.54%(鹽酸提取法)和11.87%±0.877%(微波提取法)，提取效果較為理想。與微波提取法相比，鹽酸提取法不僅原料用量少，多糖得率高，而且對(duì)板栗多糖的降解作用小。因此，兩種提取方法中，鹽酸提取法是燕山板栗多糖提取工藝的較優(yōu)方法。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Studies on Polysaccharide Extraction Technology of Yanshan Chestnut (CastaneamollissimaBlume)

ZHOU Yan,WANG Xiaohong,WANG Tongkun,FAN Deyue,LIU Junfang

(Hebei Normal University of Science & Technology,Hebei Chestnut Engineering Research Center,Qinhuangdao Hebei,066600,China)

A single-factor experiment and an orthogonal test were employed to determine the optimum conditions to extract polysaccharide from Yanshan chestnut by hydrochloric acid extraction method and microwave extraction method. Meanwhile, phenol-sulfuric acid method and High-performance liquid chromatography were used to compare the differences in polysaccharides’ yield and their molecular weight distribution. The results showed that the optimum conditions of hydrochloric acid extraction were as follows: acid concentration 0.72 mol/L, extraction time 40 min, extraction temperature 70 ℃, extracting agent 20 mL/g, polysaccharide yield 18.66%±2.54%; while the optimum conditions of microwave extraction were: extraction time 50 s, microwave power 800 W/g, extracting agent 30 mL/g, polysaccharide yield 11.87%±0.87%. The hydrochloric acid extraction could significantly increase the yield of chestnut polysaccharide under the optimum extraction conditions. Moreover, the degradation on polysaccharide molecular weight by the hydrochloric acid extraction was smaller than that by the microwave extraction. Thus, the hydrochloric acid extraction might be regarded as the better extraction process to isolate polysaccharide from Yanshan chestnut.

chestnut polysaccharide;extraction process;hydrochloric acid extraction;microwave extraction;yield;molecular weight distribution

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.01.003

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(項(xiàng)目編號(hào):201304708)；河北省科技廳項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):14236805D)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):C2015407036)；河北省教育廳平臺(tái)建設(shè)與基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):16966305D)。

，男，碩士，教授。主要研究方向：果樹種質(zhì)資源。E-mail: trcwhx@126.com。

2015-12-08; 修改稿收到日期: 2016-02-03

TQ914.1

A

1672-7983(2016)01-0014-06

周艷(1991-)，女，碩士研究生。主要研究方向：果樹種質(zhì)資源。