王新軍　楊卓　楊如意　袁小威孫利坤牛曉陽(yáng)

腦膠質(zhì)瘤組織SNAT1蛋白表達(dá)及其意義☆

王新軍*楊卓*楊如意*袁小威*孫利坤**牛曉陽(yáng)**

目的探討人鈉耦合中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（human sodium coupled neutral amino acid transporter 1，SNAT1）在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)，預(yù)后的關(guān)系。方法 用免疫組織化學(xué)法，蛋白質(zhì)印跡法觀察89例膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織和瘤周組織中的SNAT1的表達(dá)與分布，其中低級(jí)別膠質(zhì)瘤55例（WHO Ⅰ-Ⅱ），高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅢ-Ⅳ）34例，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析蛋白質(zhì)印跡中SNAT1的表達(dá)，采用單因素χ2檢驗(yàn)分析SNAT1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法觀察SNAT1的不同表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響，并建立Cox回歸模型。結(jié)果 膠質(zhì)瘤組織中SNAT1的表達(dá)明顯高于瘤周組織（t=-9.803，P=0.001），高病理級(jí)別組織中SNAT1的表達(dá)明顯高于低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織（t=-6.682，P=0.003）；SNAT1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤直徑，病理級(jí)別有關(guān)（χ2=4.963，8.527，P＜0.05）；Cox回歸模型顯示腫瘤病理級(jí)別，SNAT1蛋白不同表達(dá)為影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論 SNAT1蛋白的表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別及患者預(yù)后密切相關(guān)，有望成為判斷膠質(zhì)瘤生物學(xué)特征及評(píng)價(jià)患者預(yù)后的分子新靶點(diǎn)。

SNAT1膠質(zhì)瘤 病理參數(shù) 預(yù)后

【Abstract】Objective To explore the expression of human sodium coupled neutral amino acid transporter 1 （SNAT1）in human glioma tissues and its relationship with clinical pathological parameters and prognosis.Methods Immu?nohistochemical and western blotting were used to detect SNAT1 expression in glioma tissue and tumor peripheral tissue from 89 cases of glioma patients including 55 cases of low grade gliomas（WHO I-II），and 34 cases of high grade gliomas （WHO grade III-IV）.χ2test and was used to analyze the relationship between expression and clinical pathological param?eters of SNAT1.Kaplan-Meier method was used to analyze the effect of different expression of SNAT1 on the prognosis of patients and to establish the Cox regression model.Results The expression of SNAT1 was significantly higher in gliomas than in tumor peripheral tissue（t=-9.803，P=0.001）.The expression of SNAT1 was significantly higher in high pathologi?cal grade tissues than in low grade of glioma tissues（t=-6.682，P=0.003）.SNAT1 expression was associated with tumor di?ameter and pathological grade（χ2=4.963，8.527，P＜0.05）；Cox regression model showed that the tumor pathological grade and different SNAT1 protein expression were independent risk factors for the prognosis of patients with glioma.Conclu?sions The expression of SNAT1 protein is closely associated with the pathological grade of gliomas and the prognosis of the patients，which may be a new target to judge the biological characteristics and to evaluate the prognosis of gliomas.

【Key Words】SNAT1 Gliomas Pathological parameters Prognosis

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，患者的生存期短，死亡率高，預(yù)后差［1］。人鈉耦合中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（human sodium cou?pled neutral amino acid transporter 1，SNAT1），又稱SLC38A1，ATA1等，是一種Na+偶聯(lián)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)小分子物質(zhì)如谷氨酸，丙氨酸等［2］，主要在胎盤，大腦和脊髓中表達(dá)［3］。近些年研究證明SNAT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤［4］，肝癌［5］，乳腺癌［6］中均異常高表達(dá)，本研究中我們通過(guò)免疫組織化學(xué)法，蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中SNAT1的表達(dá)與分布，并探討SNAT1的表達(dá)與臨床參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2008年1月至2011年12月于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科治療的89例膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織及瘤周組織的石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)為初發(fā)病例，鏡下手術(shù)全切除，術(shù)前未接受放療，化療及其他治療，術(shù)后均接受化療。病理學(xué)分級(jí)中WHOⅠ級(jí)16例，其中毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤13例，室管膜下巨細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤3例；Ⅱ級(jí)39例，其中少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤14例；Ⅲ級(jí)20例，其中少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤10例；Ⅳ級(jí)14例，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤11例，髓母細(xì)胞瘤3例。對(duì)所有納入研究的患者進(jìn)行為期40個(gè)月的隨訪，均未有失訪，以患者死亡作為終點(diǎn)事件，其中低病理級(jí)別（WHO Ⅰ-Ⅱ）35例，高病理級(jí)別（WHOⅢ-Ⅳ）32例發(fā)生終點(diǎn)事件。所有事項(xiàng)已獲患者及其家屬同意。兔抗人SNAT1單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，鼠/兔通用型S-P超敏試劑盒購(gòu)于福州邁新公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液購(gòu)于上海拜沃生物科技有限公司，PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Milipore公司，熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2SNAT1分布檢測(cè) 89例標(biāo)本在離體后經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。標(biāo)本做連續(xù)切片，置于防脫劑預(yù)處理后的載玻片上，滴加SNAT1抗體4℃過(guò)夜，磷酸緩沖液（PBS）清洗后滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育20min，PBS清洗加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15min，DAB顯色液顯色，沖洗，蘇木精復(fù)染等后于顯微鏡下觀察。PBS液代替一抗染色做陰性對(duì)照。選擇每張切片免疫反應(yīng)較強(qiáng)的區(qū)域，高倍鏡視野（×400）觀察5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)SNAT1陽(yáng)性細(xì)胞。其中：陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)染色程度評(píng)分：無(wú)染色者為0分，淡黃色者為1分，黃色或棕黃色者為2分，褐色者為3分。最后以兩者評(píng)分的總和為最終評(píng)分，0分為陰性，1～7分為陽(yáng)性，其中1～3分為低表達(dá)，4～7分為高表達(dá)。

1.3SNAT1蛋白印跡檢測(cè) 取冰凍組織300mg，剪碎放于勻漿器中，加入預(yù)放置的蛋白裂解酶，在冰上進(jìn)行勻漿，使SNAT1蛋白充分裂解，嚴(yán)格按照蛋白印跡法操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，檢測(cè)出SNAT1蛋白的表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)分析由SPSS 21.0軟件完成。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，腫瘤組織與瘤周組織，低病理級(jí)別與高病理級(jí)別組織中SNAT1的表達(dá)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；SNAT1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用單因素χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法并建立Cox回歸模型分析SNAT1的不同表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05。

2　結(jié)果

2.1SNAT1在腦組織中的表達(dá)分布SNAT1在腫瘤組織中的表達(dá)主要在胞漿中，可見(jiàn)黃色或棕黃色的顆粒物質(zhì)，如圖1。得出標(biāo)本中SNAT1光密度條帶值與對(duì)照GAPDH條帶比值，作為SNAT1蛋白表達(dá)水平，如圖2，在瘤周組織中為0.11±0.02，低病理級(jí)別中為0.32±0.13，高病理級(jí)別中為0.52± 0.09，瘤周組織與膠質(zhì)瘤組織（t=-9.803，P= 0.001），低病理級(jí)別與高病理級(jí)別（t=-6.682，P= 0.003），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其表達(dá)情況如表1。

2.2SNAT1的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

SNAT1的表達(dá)與病理級(jí)別，腫瘤直徑有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡，性別，膠質(zhì)瘤細(xì)胞成分，部位無(wú)關(guān)（P＞0.05），如表2。

2.3SNAT1的表達(dá)與預(yù)后的的關(guān)系 通過(guò)Ka?plan-Meier法制作生存曲線，如圖3，可知SNAT1的不同表達(dá)對(duì)患者的預(yù)后有不同影響（Log-Rank= 19.953，P＜0.05），低表達(dá)組（陰性和低表達(dá)合并）1年生存率為86.7%（39/45），3年生存率為31.1% （14/45），高表達(dá)組1年生存率為61.4%（27/44），3年生存率為6.8%（3/44）。將可能影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的因素納入單因素Cox回歸模型中顯示，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后與腫瘤直經(jīng)、病理級(jí)別、SNAT1蛋白有關(guān)系（P＜0.05）；將以上相關(guān)因素納入多因素Cox回歸模型中顯示：SNAT1蛋白不同表達(dá)和腫瘤病理級(jí)別是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見(jiàn)表3。

圖1　膠質(zhì)瘤組織和瘤周組織中SNAT1的表達(dá)（SP，×400） A：瘤周組織中SNAT1的少量染色；B：膠質(zhì)瘤組織中SNAT1的陽(yáng)性染色；C：低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中SNAT1的低表達(dá)；D：高病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織SNAT1的高表達(dá)

圖2　蛋白印跡法檢測(cè)腦組織中SNAT1蛋白的表達(dá)水平。1：瘤周組織；2：膠質(zhì)瘤組織；3：低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織；4：高病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶，作為對(duì)照

表1　SNAT1在腫瘤組織和瘤周組織中的表達(dá)

表2　SNAT1蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

3　討論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素多環(huán)節(jié)的病理改變過(guò)程，由于其分子特征異常復(fù)雜，導(dǎo)致其在臨床上的治療效果和預(yù)后不容樂(lè)觀［7］，在腫瘤細(xì)胞中，蛋白質(zhì)主要參與增殖，遷移等重要活動(dòng)，并為其提供充足的營(yíng)養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞中氨基酸的活動(dòng)需要通道載體蛋白即氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與，而SNAT1蛋白作為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白載體A家族中的成員，不僅為細(xì)胞活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)，也參與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸。本研究表明，SNAT1在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)為79.78%（71/89），明顯高于瘤周組織中的表達(dá)37.08%（33/89），SNAT1在高病理級(jí)別中的陽(yáng)性表達(dá)為97.06%（33/34），明顯高于低病理級(jí)別中的表達(dá)69.09%（38/55），為進(jìn)一步驗(yàn)證，我們通過(guò)檢測(cè)不同級(jí)別中蛋白水平，更加明確了SNAT1蛋白在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且隨著腫瘤病理級(jí)別的升高而升高。因此，能否利用SNAT1蛋白衡量膠質(zhì)瘤的惡性程度及生物學(xué)特性，我們還繼續(xù)做深入探索。通過(guò)Kaplan—Meier法制作的生存曲線可以看出，SNAT1高表達(dá)患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)患者，本組SNAT1低表達(dá)患者術(shù)后1年，3年生存率明顯高于高表達(dá)患者（P＜0.05）。有文獻(xiàn)報(bào)道［8］，膠質(zhì)瘤患者中位生存期低于15個(gè)月，本組SNAT1低表達(dá)患者中位期為20個(gè)月，高表達(dá)者中位期為17個(gè)月，較高于文獻(xiàn)報(bào)告值，可能獲益于腫瘤全切除以及術(shù)后規(guī)范的化學(xué)治療，這也是我們醫(yī)院治療膠質(zhì)瘤患者遵循的原則，尤其是對(duì)中晚期患者，盡管沒(méi)有提高總體生存期，但對(duì)于延長(zhǎng)患者無(wú)進(jìn)展生存期具有較為重要的意義［9］。由于術(shù)中很難在肉眼下辨別膠質(zhì)瘤邊界，不保證做到全切［10］，從而成為膠質(zhì)瘤日后侵襲進(jìn)展的根源，因此，在術(shù)中能否根據(jù)SNAT1蛋白的不同表達(dá)作為快速判斷膠質(zhì)瘤邊界的定量指標(biāo)，將給我們?nèi)心z質(zhì)瘤組織提供新突破口。Cox模型提示膠質(zhì)瘤病理級(jí)別，SNAT1蛋白作為影響患者預(yù)后的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與文獻(xiàn)報(bào)告一致［11，12］。根據(jù)以往研究［13］，腫瘤的復(fù)發(fā)與細(xì)胞有絲分裂增加促使細(xì)胞膜代謝異?；钴S，SNAT1作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能增加了細(xì)胞膜的活動(dòng)，從而增加了腫瘤惡性進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。SNAT1有望成為臨床上對(duì)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后判斷的分子新靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中SNAT1的表達(dá)與病理級(jí)別，腫瘤直徑有關(guān)（P＜0.05），而與年齡，性別，膠質(zhì)瘤細(xì)胞成分，腫瘤部位無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。SNAT1的表達(dá)隨著腫瘤直徑的增大而增加，根據(jù)SIDORYK等［14］的觀點(diǎn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白給其提供谷氨酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可能是SNAT1滿足了腫瘤生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與腫瘤同向變化。據(jù)此我們猜測(cè)SNAT1蛋白表達(dá)水平增高促進(jìn)了膠質(zhì)瘤病理級(jí)別以及體積的改變。因此，SNAT1蛋白有望作為判斷膠質(zhì)瘤生物學(xué)特征的分子靶點(diǎn)。

綜上所述，該研究揭示了SNAT1蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響，對(duì)研究膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)機(jī)制，侵襲進(jìn)展提供了理論依據(jù)和參考，然而SNAT1蛋白通過(guò)何種途徑增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的生物活性，能否通過(guò)下調(diào)SNAT1蛋白活性來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，尚需要我們進(jìn)一步的探索。

表3　影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后因素的Cox模型分析

圖3　SNAT1蛋白不同的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響

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（責(zé)任編輯：甘章平）

Expression and significance of SNAT1 protein in brain glioma tissue.

WANG Xinjun，YANG Zhuo，YANG Ruyi，YUAN Xiaowei，SUN Likun，NIU Xiaoyang.
Department of Neurosurgery，The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou Uni?versity，No.3 Kang-fu qian street，Er qi Distract，Zhengzhou 450052，China.Tel：0371-66916449.

R739.41

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.07.009

☆河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：14A320078）；鄭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20150390）資助

*鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（鄭州450052）

**鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院血管外科

（E-mail：wangxj@zzu.edu.cn）

2016-04-01）