李建華,劉文靜,李 寧

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沼液中溶解游離氨基酸的測定——柱前衍生-反相高效液相色譜法

李建華,劉文靜,李 寧*

(同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200092)

針對沼液特點(diǎn)開發(fā)pH值調(diào)節(jié)(pH 10.2)旋蒸濃縮(去除氨氮和揮發(fā)性生物胺)聯(lián)合3K Millipore超濾離心分離的預(yù)處理方法.并以鄰苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)為柱前衍生化試劑,結(jié)合反向高效液相色譜和熒光檢測分析,對沼液中溶解游離氨基酸(DFAA)進(jìn)行了定性和定量考察.該方法保證了各氨基酸在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2均大于0.99),標(biāo)準(zhǔn)樣品中所選用的24種氨基酸,除谷氨酸回收率為70.5%外,其它氨基酸回收率為89%~115%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%~5.0%.用所建立的方法對樣品中溶解游離氨基酸的測定結(jié)果為:原料即剩余污泥中的溶解游離氨基酸量為2.0mol/L,5%和20%含固率反應(yīng)器的沼液中的溶解游離氨基酸量分別為0.04mol/L和1.94mol/L,且種類不同,初步表明了不同厭氧消化反應(yīng)系統(tǒng)中氨基酸的利用和產(chǎn)生機(jī)制的差異.

超濾；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；反相高效液相色譜；溶解游離氨基酸；沼液

近年來,剩余污泥的產(chǎn)生量伴隨著城鎮(zhèn)污水處理能力的不斷提升而迅速攀升.厭氧消化作為一種在實(shí)現(xiàn)污泥穩(wěn)定化同時還可產(chǎn)生綠色能源-沼氣的技術(shù),一直被認(rèn)為是污泥處理處置的合適選擇之一.而污泥經(jīng)過厭氧消化后所產(chǎn)生的沼渣和沼液中各種有益和有害物質(zhì)的含量將直接影響其土地利用的前景.氮是沼渣和沼液中重要營養(yǎng)元素之一,主要以氨態(tài)氮(NH3-N和NH4+-N)和有機(jī)氮(氨基酸、環(huán)己胺和氨基化合物等)的形態(tài)存在,此外還有少量的為NO3--N/NO2--N等[1].蛋白質(zhì)作為污泥中有機(jī)氮的主要組成在厭氧消化過程中能被分解為溶解游離氨基酸并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮(NH3-N,NH4+).由于氨基酸對植物生長特別是光合作用具有獨(dú)特的促進(jìn)作用進(jìn)而提高作物品質(zhì),如增加維生素C和糖的含量[2],把握沼液和沼渣中氮基酸組分的存在形態(tài)及含量對指導(dǎo)污泥的綜合利用尤為重要,而建立起快速、有效的沼液中氨基酸測定方法即為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié).

在眾多的氨基酸測定方法中, 沼液中總氨基酸量的測定主要通過茚三酮比色法[3],而沼液中的氨基酸組分的測定,主要以氣相色譜法[4]和高效液相色譜法[5-6]為主.由于大多數(shù)氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特征,為提高分析檢測靈敏度和分離選擇特性,通常需將氨基酸進(jìn)行柱前或柱后衍生化,并選用陽離子交換或反相液相色譜法對其進(jìn)行分離并經(jīng)紫外或熒光檢測(OPA/FMOC-Cl/RT-HPLC)來實(shí)現(xiàn)各組分的測定[7-11].能使氨基酸產(chǎn)生熒光的衍生劑有鄰苯二甲醛(OPA)、9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、丹酰氯(DANSYL-Cl)等.沼液中溶解游離氨基酸的含量較低,并且沼液中復(fù)雜的其它成分以及所包含的許多細(xì)小固體懸浮物會對衍生化過程產(chǎn)生干擾:如高濃度氨氮和揮發(fā)性胺容易與某些待測氨基酸形成熒光副產(chǎn)物,干擾氨基酸的分析與測定.孟慶國等[4]采用氣相色譜法測定了沼液中的18種溶解游離氨基酸,然而,該研究中所采用的分析方法較為繁瑣,且未涉及樣本加標(biāo)回收率、精密度等參數(shù)的進(jìn)一步分析.氨基酸是一類包含至少一個羧基和一個氨基官能團(tuán)的化合物(等電點(diǎn)2.8~10.8),它在不同的pH條件下,會以陽離子、陰離子和中性分子的形式存在.可針對氨基酸這一特點(diǎn)選用被廣泛地應(yīng)用于目標(biāo)物質(zhì)分離和富集[12-13]的固相萃取法(SPE)以快速、經(jīng)濟(jì)、靈活和高效的方式去除其他干擾物并對氨基酸進(jìn)行富集.然而,對污泥中溶解游離氨基酸進(jìn)行測定的研究較少,前處理部分樣本上樣條件及其洗脫條件等的信息也十分缺乏,限制了該方法在沼液中溶解游離氨基酸分析前處理中的應(yīng)用.

本研究對比分析了SPE固相萃取在不同pH值條件下的處理效果,同時,針對氨基酸相對于其他干擾物分子量小(70~204)的特點(diǎn),通過pH值調(diào)節(jié)結(jié)合旋蒸去除高濃度氨氮和揮發(fā)性胺的方式,并進(jìn)一步采用3K Millipore超濾離心作為沼液中氨基酸分析前處理的重要手段,最終確立了pH值調(diào)節(jié)旋蒸聯(lián)合超濾離心并OPA/FMOC-Cl- RT-HPLC分析這種簡單、快速、重現(xiàn)性好、回收率高的污泥中溶解游離氨基酸的檢測方法,實(shí)現(xiàn)了沼液中24種溶解游離氨基酸(天冬氨酸、絲氨酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、正纈氨酸、賴氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸及苯丙氨酸)的同步分析.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent-1260液相色譜儀,配有在線脫氣機(jī),四元梯度泵,標(biāo)準(zhǔn)自動進(jìn)樣器,熒光及紫外檢測器(FLD和UV)及Agilent化學(xué)工作站.超濾離心管(3K,Millipore),SCX-SPE固相萃取柱購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司.

17種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)包括:天冬氨酸、絲氨酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸(ILE)、亮氨酸及苯丙氨酸.補(bǔ)充氨基酸包括:天門冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、正纈氨酸、賴氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸.衍生化試劑為鄰苯二甲醛(OPA,HPLC)、3-巰基丙酸(3-MPA,HPLC)和9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl,HPLC),均為Sigma (St Louis, MO, USA)產(chǎn)品.甲醇、乙腈為HPLC 級試劑(阿拉丁),實(shí)驗(yàn)用水是Milli-Q水( Millipore,USA),其他試劑均為優(yōu)級純.

1.2 試劑配制

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制是將濃度為2.5nmol/μL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.1mol/L HCl配制成濃度分別為5、25、50、100、200、450pmol/μL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.

OPA衍生化試劑的配制是將80mg OPA 溶解在7mL pH值為10.2的40mmol/L硼酸緩沖液中,加入125μL 3-巰基丙酸和1ml乙腈.該溶液避光陳化90min 以上,以降低試劑空白.配置好的OPA衍生化試劑保存在-20℃冰箱中,最長可使用1年.

FMOC-Cl衍生化試劑的配制是將50mg FMOC-Cl溶解在10ml乙腈溶液中.該溶液保存在-20℃冰箱中,最長可使用1年.

1.3 RT-HPLC色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbox Eclipse AAA柱(3.5μm,4.6mm×150mm).流動相A為0.04mol/L的NaH2PO4(用10mol/L NaOH 將pH值調(diào)至7.8); B為超純水:乙腈:甲醇以10:45:45(V /V/V)的比例配置的混合溶液.熒光檢測波長的條件設(shè)置為:x= 340nm,m= 460nm, PMT=10; 15.25min更換波長為x= 266nm,m=305nm, PMT=9.流動相的流速為2mL/min,柱溫設(shè)置為40 ℃.流動相洗脫梯度見表1.

1.4 樣品前處理

使用0.22μm濾膜過濾沼液樣品.過濾后的沼液用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10.2,旋蒸濃縮至干后用0.1mol/L HCl重新溶解;SCX固相萃取實(shí)驗(yàn)用的樣品在過濾后通過1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.2待用.

表1 流動相洗脫梯度 Table 1 Scheme of elution gradient for HPLC-FLD analysis

1.4.1 SCX固相萃取小柱回收率實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)中所用SPE固相萃取小柱經(jīng)6mL甲醇和6mL水活化與平衡,控制流速小于3mL/min.取5mL沼液樣品調(diào)節(jié)pH值至10.2并過SCX-SPE固相萃取小柱,控制流速小于1mL/min,此步驟不收集過濾液,然后用6mL 2%甲酸沖洗固相萃取小柱,最后先用5mL甲醇洗脫(此步驟亦不收集洗脫液),再用5%氨化甲醇洗脫,收集洗脫液.取洗脫液5ml于50mL茄型旋蒸瓶中,裝上防爆瓶,于40℃水浴下負(fù)壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干.然后用5mL 0.1mol/L HCl重新溶解.

1.4.2 3K Millipore超濾膜前處理 將上述pH值調(diào)節(jié)至10.2的沼液5mL轉(zhuǎn)移至50mL茄型旋蒸瓶中,裝上防爆瓶,于40℃水浴下負(fù)壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,然后用5mL 0.1mol/LHCl重新溶解.渦旋30s以混合均勻,取上述液體200μL,采用離心的方式通過3K Millipore超濾離心管,收集濾液.

1.5 氨基酸的衍生化

依據(jù)文獻(xiàn)中所報道的方法對OPA的衍生化步驟進(jìn)行了部分調(diào)整[14].首先將0.5μL的樣品混合0.5μL的OPA和0.5μL的FMOC,而后用32μL的混合溶液(100mL流動相A加400μL的磷酸) 進(jìn)行稀釋,將所得溶液通過HPLC進(jìn)行分析.整個過程耗時近2min,該混合過程可通過安捷倫HPLC自動進(jìn)樣程序完成以嚴(yán)格控制各反應(yīng)時間.

1.6 回收率試驗(yàn)

將100μmol/L的氨基酸標(biāo)樣溶解于空白水體中,進(jìn)行上述兩種方法的回收率試驗(yàn).另取同樣濃度的氨基酸標(biāo)樣加于樣品中測定樣本加標(biāo)回收率.

2 結(jié)果和討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

采用保留時間法對樣品中氨基酸進(jìn)行定性分析.即在相同的色譜分析條件下,樣品中氨基酸的色譜峰與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)的色譜峰保留時間相同或相近,則認(rèn)為樣品中含有此類氨基酸.在每次衍生化反應(yīng)之前,采用外標(biāo)工作曲線法對樣品中溶解游離氨基酸的濃度進(jìn)行定量分析.

2.1.1 SCX-SPE條件的優(yōu)化及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 由于氨基酸在不同的pH條件下會以陽離子、陰離子和中性分子的形式存在.文獻(xiàn)中一般選用(強(qiáng))陽離子基質(zhì)的SPE柱提取血漿中的氨基酸[15]和果汁、果醬中的氨基酸[16-17].但不同文獻(xiàn)中所選用的樣品pH值不同,且缺少對樣品pH值影響的深入討論.為此,本研究中采用同一沼液樣品,比較不同pH值對其中氨基酸提取效果的影響.如圖1所示,在pH值為2.2時,樣本中氨基酸的保留效果最好.

如表1所示,即便在最優(yōu)pH值(pH 2.2)的條件下,采用SCX-SPE法得到的空白樣品各氨基酸加標(biāo)回收率差異較大(0%~96%),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%~8%.對于天門冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、正纈氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸,該方法具有較高的回收率(大于80%),可用于這些氨基酸的定性和定量分析;而對天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的回收率較低(小于80%,0~76%不等).因而,采用SCX-SPE法前處理對部分氨基酸的選擇性較強(qiáng),對其他氨基酸進(jìn)行定量分析時會存在較大的誤差.而采用3K Millipore超濾離心管前處理方法得到空白水體中各氨基酸加標(biāo)回收率為97.9%~110.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%~2.7%(表2),24種氨基酸可同步定性和定量分析.

同時,考慮到沼液中干擾組分對回收率的影響,本研究中也設(shè)計了樣品加標(biāo)回收率的實(shí)驗(yàn).通過SCX-SPE固相萃取小柱前處理的沼液樣本中各氨基酸的加標(biāo)回收率為0%~101.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%~25.6%,各氨基酸的回收率差別較大,對超過半數(shù)的氨基酸進(jìn)行定量分析時會存在較大的誤差.而通過3K超濾離心管前處理的樣本各種氨基酸的回收率為70.5%~115.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%~5.0%(表2).除谷氨酸之外的其他23種氨基酸的同步定性和定量分析得以實(shí)現(xiàn).

2.1.2 氨氮濃度對于色譜分析結(jié)果的影響 沼液內(nèi)氨氮濃度可高達(dá)3000mg/L,相對于低含量的溶解游離氨基酸而言,高濃度氨氮在極大程度上會影響溶解游離氨基酸的分析.這是由于沼液中濃度較高的氨和揮發(fā)性胺在衍生化過程中易形成熒光副產(chǎn)物,與某些氨基酸同時洗脫出來,影響溶解游離氨基酸的定性定量分析.研究表明,衍生化反應(yīng)前,沼液中的氨和揮發(fā)性胺的濃度需低于10-5mol/L,才能解決氨基酸液相色譜圖模糊和峰重疊的問題[7].當(dāng)采用SCX-SPE前處理方法進(jìn)行分析時,由于有5%氨化甲醇洗脫及旋蒸濃縮至干的步驟,氨氮得以去除,避免氨氮及揮發(fā)性胺的影響;而當(dāng)采用3K Millipore超濾膜前處理的方法時卻易受到高濃度氨氮的影響,故需要通過調(diào)節(jié)pH和旋蒸的步驟進(jìn)一步去除氨氮.

表2 不同前處理方法的各氨基酸的樣本加標(biāo)回收率和精密度(n=3) Table 2 Spike recovery of 24amino acids in slurry samples with different pretreatments (n=3)

如圖2(a)所示,未經(jīng)氨氮去除前處理的沼液中部分氨基酸的各色譜峰無法正常分離,導(dǎo)致無法對這些氨基酸進(jìn)行定量;圖2(b)中經(jīng)過pH的調(diào)節(jié)和后續(xù)的旋蒸濃縮前處理后,高濃度氨氮的干擾得以去除,色譜圖效果明顯好于圖2(a).

2.1.3 兩種不同前處理方法對比 沼液樣品經(jīng)超濾與SCX-SPE兩種方法前處理后的對比圖如圖3所示.經(jīng)SCX前處理后,沼液中部分氨基酸流失無法定量(圖3(a));經(jīng)超濾并去除氨氮的前處理后,沼液中氨基酸損失少(圖3(b)),色譜圖效果明顯好于圖3(a).

2.2 氨基酸測定的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、精密度

24種濃度為100pmol/μL 的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜分離圖如圖4所示.從圖中可以看出,在上述衍生化和色譜條件下,實(shí)現(xiàn)了24種氨基酸的徹底分離.將所配制的5種不同濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液,按1.3的色譜條件進(jìn)行測定,以峰面積為橫坐標(biāo)(X),以氨基酸標(biāo)樣濃度為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸得到回歸方程(表3).結(jié)果表明,各氨基酸的相關(guān)系數(shù)在0.991~0.9998,即在5~450pmol/μL 的線性范圍內(nèi)氨基酸峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系.同時,混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣7次,24種氨基酸的出峰時間及氨基酸濃度RSD均在2.2%以內(nèi)(表4),說明本分析中儀器的精密度較好.

2.3 方法的應(yīng)用

將上述建立的基于超濾前處理聯(lián)合柱前衍生-HPLC測定沼液中氨基酸的分析方法用于不同反應(yīng)器沼液中溶解游離氨基酸的含量的研究.如表5所示,作為進(jìn)料的剩余污泥中溶解游離氨基酸的含量為2.0mol/L.進(jìn)料含固率為5%和20%的反應(yīng)器中溶解游離氨基酸的種類不同,含量分別為0.04mol/L和1.94mol/L,氨基酸含量和種類與含固率之間并無明顯關(guān)系.該結(jié)果初步表明,不同厭氧消化過程對氨基酸的利用和產(chǎn)生機(jī)理不同.因而,還需要在所開發(fā)的方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究厭氧消化過程中蛋白質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化的機(jī)理.

表3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性回歸分析結(jié)果 Table 3 Results of linear regression analysis of calibration data