曹莉莎，張　芳，羅　文，陳　靜，何淼泉，王繼生（綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，四川綿陽(yáng)　621000）

抑郁大鼠海馬組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

曹莉莎，張芳，羅文，陳靜，何淼泉，王繼生
（綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，四川綿陽(yáng)621000）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.040.html

目的比較慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）大鼠與健康大鼠的海馬組織，篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)。以期從蛋白質(zhì)組學(xué)角度闡明其發(fā)病機(jī)制，并為尋找生物標(biāo)志物提供靶標(biāo)。方法采用CUMS建立大鼠抑郁模型。運(yùn)用8標(biāo)ITRAQ技術(shù)，結(jié)合2D LC-MS/MS分析CUMS大鼠與健康大鼠的海馬組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

結(jié)果共鑒定出5 109個(gè)蛋白，差異蛋白33個(gè)，其中8個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，25個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。結(jié)論ITRAQ結(jié)合LCMS/MS技術(shù)能快速有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為我們研究抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物提供了有力平臺(tái)。

ITRAQ；蛋白質(zhì)組學(xué)；抑郁；海馬組織；質(zhì)譜；CUMS

抑郁癥（depression）是一種表現(xiàn)為抑郁心境低落的綜合征，以心境低落、思維遲緩、認(rèn)知功能損害、意志活動(dòng)減退和軀體癥狀為主要特征，嚴(yán)重后果的患者可能引起自殺。目前，關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制存在著很多假說(shuō)，如單胺神經(jīng)遞質(zhì)及其受體學(xué)說(shuō)、下丘腦-垂體-腎上腺（PHA）軸功能失調(diào)學(xué)說(shuō)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子學(xué)說(shuō)等。但沒(méi)有一種學(xué)說(shuō)能完全解釋抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，發(fā)病機(jī)制的不清，導(dǎo)致診斷不明確，誤診和漏診率較高，對(duì)抑郁癥的治療也存在藥效延遲、部分抑郁患者療效不佳、復(fù)發(fā)率高等現(xiàn)象。因此，我們必須更好地了解抑郁癥的發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制，從而能夠有效地對(duì)抑郁癥進(jìn)行徹底治療。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁患者會(huì)出現(xiàn)記憶下降、學(xué)習(xí)能力降低等情況，而海馬與學(xué)習(xí)記憶有著密切關(guān)系。因此，研究海馬組織對(duì)于研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制有著重大的意義［1］。前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及參考文獻(xiàn)，引出本文蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

抑郁癥的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程包含了細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的協(xié)同改變，研究這些機(jī)制的有效辦法就是從整體角度思考這些復(fù)雜的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)通過(guò)對(duì)整體蛋白質(zhì)的大規(guī)模分析，研究生物學(xué)過(guò)程相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能的改變［2］。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，ITRAQ）聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，可同時(shí)對(duì)多達(dá)8種樣品進(jìn)行定量研究，并且與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究相比較，ITRAQ技術(shù)中運(yùn)用的定性和定量方法重復(fù)性更好，特別適用于低峰度蛋白質(zhì)的研究，而且能夠通過(guò)同位素標(biāo)記的方法，準(zhǔn)確把握差異表達(dá)蛋白的動(dòng)態(tài)變化，能夠更好地對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量測(cè)定［3］。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)♂SD大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，從重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買，合格證書編號(hào)SCXK（渝）2012-0001。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境為25℃，給予所有大鼠正常飲食、飲水，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)黑暗與光照交替出現(xiàn)，黑暗12 h，光照12 h，所有大鼠飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。

1.2試劑與儀器H2O（HPLC級(jí)別）（美國(guó)Sigma公司），ITRAQ標(biāo)記試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems公司），BCA試劑盒（中國(guó)碧云天公司），胰酶（美國(guó)Sigma公司），Cocktail蛋白酶抑制劑（美國(guó)羅氏公司），全蛋白提取試劑盒（上海生工），蛋白裂解液（中國(guó)碧云天公司），尿素（美國(guó)Sigma公司），Anti-GABA Transporter（ab431），聚偏氟乙烯膜（PVDF）0.45 μm（Merck Millipore，IPVH00010），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）（碧云天生物技術(shù)研究所，P0015），魯米諾化學(xué)發(fā)光液底物100 mL（Merck Millipore，WBLUC0100），TBST緩沖液（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），電泳/電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad公司，041BR88778）。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為測(cè)試儀、強(qiáng)迫游泳行為測(cè)試儀、高架十字迷宮（重慶醫(yī)科大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室制）。低溫冰箱（-20℃）（德國(guó)西門子），Aallegra臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司），超低溫冰箱（-80℃）（美國(guó)Thermo Fisher），高效液相色譜儀（島津半制備型HPLC系統(tǒng)），RVT4104低溫冷凍干燥器（美國(guó)Thermo Fisher），SpeedVac真空離心器（美國(guó)Applied Biosystems公司），MALDI/TOF/TOF5800蛋白分析儀及配套軟件Mascot軟件（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.3方法

1.3.1慢性溫和不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激大鼠模型♂SD大鼠20只，先進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，按曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將其分為正常組和模型組，每組10只。正常組正常飼養(yǎng)，模型組孤立喂養(yǎng)并接受21 d各種不同溫和刺激，包括禁水24 h、禁食24 h、4℃冰水游泳5 min、晝夜顛倒、熱刺激（45℃，5 min）、濕墊料、異味刺激、45°鼠籠傾斜24 h，每天隨機(jī)選擇1種刺激，相同刺激不得重復(fù)出現(xiàn)，同種刺激不能超過(guò)3次。造模完成后，即d 22時(shí)，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，以判斷造模是否成功。模型成功后，大鼠斷頸處死，冰臺(tái)上迅速分離出海馬組織，液氮速凍，-80℃冰箱保存。

1.3.2海馬組織蛋白質(zhì)的提?、?Lysis buffer中加入5 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和10 μL PMSF混勻。②冰上預(yù)冷玻璃勻漿器，2支lysis buffer。③取凍存的大鼠海馬組織，每組3只，PBS清洗，按組放入玻璃勻漿器，分別加預(yù)冷的 lysis buffer，手動(dòng)研磨，至均質(zhì)勻漿。④ 加入TCA-冰丙酮，-20℃沉淀2 h后，3 000×g，4℃，離心30 min，棄上清液，取沉淀。再加入丙酮，-20℃沉淀30 min，4℃，離心30 min，反復(fù)操作，至沉淀變?yōu)榘咨?80℃凍存。

1.3.3ITRAQ標(biāo)記①蛋白溶解，定量：取凍存的2組樣品，各加入40 mL裂解液和20 mL變性劑，震蕩混懸溶解，離心去除沉淀。用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整溶液的蛋白濃度，使每組蛋白樣品量為40 μg，體積20 μL。②還原，封閉：按試劑盒提供方案進(jìn)行還原、封閉。③酶解：向各組蛋白溶液中加入1 μg胰酶，37℃溫育16 h。④標(biāo)記：各試管標(biāo)記試劑中加入50 μL異丙醇，混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應(yīng)1 h，之后各加入3倍體積水，使標(biāo)記試劑分解。真空冷凍干燥。⑤ 除鹽：將相關(guān)buffer和標(biāo)記試劑的鹽除去。

1.3.4肽段的分離和鑒定①第一維強(qiáng)陽(yáng)離子柱（SCX）分離：流動(dòng)相A液：10 mmol·L-1KH2PO4，25%CAN，pH=2.6；B液：10 mmol·L-1KH2PO4，350 mmol·L-1KCl和25%ACN，pH=2.6。80 μL A液中溶解凍干樣品，上樣。將紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為214 nm/280 nm，然后將流速設(shè)置為200 μL· min-1。線性梯度洗脫：5～40 min，5% ～25%B；40 ～45 min，25% ～80%B；45～50 min，80%B；50～60 min，0%B。根據(jù)峰形和時(shí)間共收取20個(gè)梯度，真空離心濃縮后，每餾分用50 μL反相液相色譜的A相溶解，進(jìn)樣量20 μL。②第二維反相液相色譜：流動(dòng)相A液包含：5%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈和0.1%甲酸溶液。流動(dòng)相B液包含：95%乙腈和0.1%甲酸溶液。RPLC柱線性梯度洗脫：0～5 min，上樣；5～70 min，5%～35%B；70～75 min，35%～80%B；75～80 min，80%B；80～81 min，80%～5%B；90 min停止。③質(zhì)譜鑒定：噴霧針直接連接于反相色譜柱末端作為噴霧接口，噴霧電壓2.2 kV。MS掃描范圍：400～1 800 m/z，一個(gè)譜圖選擇4個(gè)最強(qiáng)母離子進(jìn)行串級(jí)掃描，MS/MS掃描范圍100～2 000 m/z。

1.3.5生物信息學(xué)鑒定利用Protein.pilot3.0軟件檢索質(zhì)譜分析所得數(shù)據(jù)，差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：①肽段≥3，②模型組與正常組大鼠海馬組織蛋白分子質(zhì)量比≥2.0或≤0.5，③P＜0.05。運(yùn)用Uniport軟件分析各蛋白生物學(xué)過(guò)程及分子功能，運(yùn)用DAVID軟件從生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能注釋對(duì)蛋白進(jìn)行分類，選擇KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白所涉及的通路進(jìn)行分類和富集分析。

1.3.6Western blot驗(yàn)證通過(guò)文獻(xiàn)檢索，選擇了差異蛋白 Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。按照碧云天SDSPAGE凝膠試劑盒提供配方制備凝膠；選取凍存大鼠海馬組織，每組3只，提取蛋白并定量，調(diào)整每管蛋白濃度至均值，加入含2-巰基乙醇和溴酚藍(lán)的2×蛋白上樣緩沖液，100℃孵育10 min，冷卻到室溫后，將變性蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)；蛋白上樣后電壓設(shè)置在100 V，時(shí)間設(shè)定為90～120 min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳；然后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，按1∶1加入AB顯影液，室溫放置5 min后，吸盡膜上水分，將膜放入暗盒，曝光5 min，在Bio-Rad的化學(xué)發(fā)光成像儀上顯影，然后分析灰度值，再計(jì)算灰度系數(shù)比。

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)前期的研究結(jié)果顯示［4］，21 d造模后，在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)較正常組減少。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠禁止不動(dòng)時(shí)間較正常組增加。在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，模型組大鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)及停留時(shí)間百分率明顯縮短，進(jìn)入高架十字迷宮總次數(shù)明顯減少。說(shuō)明CUMS致大鼠出現(xiàn)抑郁行為。

2.2ITRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)設(shè)定的 Protein.pilot3.0軟件，共鑒定到5 109個(gè)蛋白，其中差異蛋白33個(gè)，模型組較正常組表達(dá)上調(diào)的蛋白8個(gè)，下調(diào)的蛋白25個(gè)。Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)分析各個(gè)蛋白生物學(xué)過(guò)程及分子功能，見(jiàn)Tab 1。

2.3生物學(xué)功能分析通過(guò)DAVID富集分析系統(tǒng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的33種差異蛋白進(jìn)行GO分析和pathway分析。對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO分析，研究這些蛋白的功能，BP分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白大多參與物質(zhì)的代謝、能量的產(chǎn)生、機(jī)體免疫及神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)。MF分析揭示這些蛋白大多數(shù)與體內(nèi)分子的結(jié)合與捆綁相關(guān)，CC分析得出差異蛋白主要分布在細(xì)胞膜和線粒體上（Fig 1）。通過(guò)KEGG PATHWAY發(fā)現(xiàn)，共有23個(gè)蛋白，參與了7個(gè)生物代謝通路，有7個(gè)蛋白參與了檸檬酸循環(huán)，6個(gè)蛋白參與了丙酮酸代謝，4個(gè)蛋白參與了糖酵解和糖異生，5個(gè)蛋白參與了鈣信號(hào)途徑，5個(gè)蛋白參與了亨廷頓舞蹈癥，4個(gè)蛋白參與了帕金森病，4個(gè)蛋白參與了阿爾茨海默病。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果ITRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋白Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3在CUMS大鼠海馬組織中表達(dá)上調(diào)3.05倍。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于正常大鼠海馬組織蛋白，Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3在CUMS大鼠海馬組織中明顯高表達(dá)。見(jiàn)Fig 2。

3　討論

抑郁癥是臨床常見(jiàn)的精神障礙性疾病，發(fā)病率逐年增加。目前藥物治療是抑郁癥的主要治療手段，但經(jīng)過(guò)藥物治療的患者存在著復(fù)發(fā)率高，治療不徹底的現(xiàn)象。因此研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效的藥物，是國(guó)內(nèi)外一個(gè)重要的研究方向。ITRAQ技術(shù)作為一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，在蛋白質(zhì)定量方面顯出無(wú)可比擬的優(yōu)越性，運(yùn)用該技術(shù)尋找和發(fā)現(xiàn)CUMS大鼠海馬組織區(qū)別于正常生理狀態(tài)下的疾病特異表達(dá)蛋白，有利于疾病發(fā)病機(jī)制的闡明及尋找生物標(biāo)志物。Chung等［5］運(yùn)用ITRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)尋找出了人類肺腺癌潛在的生物標(biāo)志物AGR2。

Fig 1　Rat hippocampus proteome classified according to GO annotations

Tab 1　Differentially expressed proteins between CUMS group and normal control group

Fig 2　P31647 expression in rat hippocampus revealed by Western blot analysis

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激建立大鼠抑郁模型，該模型是一種經(jīng)典的動(dòng)物抑郁模型，被國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，能模擬出人類抑郁的核心癥狀，與人類抑郁發(fā)病機(jī)制較為接近［6］。行為學(xué)結(jié)果顯示：曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)較正常組減少。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠禁止不動(dòng)時(shí)間較正常組增加。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，模型組大鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)及停留時(shí)間百分率明顯縮短，進(jìn)入高架十字迷宮總次數(shù)明顯減少。說(shuō)明CUMS致大鼠出現(xiàn)抑郁行為。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用ITRAQ技術(shù)結(jié)合2D LC-MS/MS分析CUMS大鼠與健康大鼠的海馬組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)。共鑒定出5 109個(gè)蛋白，差異蛋白33個(gè)，其中8個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，25個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)參與神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的蛋白共6個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的是Myelin proteolipid protein；表達(dá)下調(diào)的有Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Neurocan core protein、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3。參與神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸?shù)牡鞍子?個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的蛋白是 Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3；表達(dá)下調(diào)的蛋白有Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A。參與突觸傳導(dǎo)的蛋白是Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Neurocan core protein、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3，都表達(dá)下調(diào)并且也參與了細(xì)胞間信號(hào)的傳導(dǎo)。參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平的蛋白共有3個(gè)，都表達(dá)下調(diào)，蛋白包括Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白 Neurocan core protein、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3參與了3種生物學(xué)過(guò)程，Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A參與了5種生物學(xué)過(guò)程。并且蛋白Synaptic vesicle glycoprotein 2B、Neurocan core protein、Synaptotagmin-1、Ras-related protein Rab-3A、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3分別在CUMS大鼠海馬組織表達(dá)是正常大鼠的19%、35%、44%、13%、13%。這些蛋白表達(dá)的降低與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)。Abumaria等［7］的研究中也發(fā)現(xiàn)抑郁樣癥狀的大鼠synaptic vesicle glycoprotein 2b蛋白會(huì)減少。Dimatelis等［8］通過(guò)ITRAQ聯(lián)合MALDI-MS/MS實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與突觸可塑性相關(guān)的Neurocan core protein參與調(diào)節(jié)大鼠母嬰分離所帶來(lái)的焦慮及抑郁癥狀。Baker等［9］也證實(shí)，Synaptotagmin-1與人類運(yùn)動(dòng)的控制及認(rèn)知的發(fā)展密切相關(guān)。

KEGG PATHWAY分析發(fā)現(xiàn)，CUMS大鼠海馬組織與三羧酸循環(huán)相關(guān)的7個(gè)蛋白Dihydrolipoyl dehydrogenase、Succinate dehydrogenase［ubiquinone］flavoprotein subunit、2-oxoglutarate dehydrogenase、Pyruvate carboxylase、Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta、Aconitate hydratase、Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex均是低表達(dá)，這些蛋白的表達(dá)下調(diào)主要影響三羧酸循環(huán)的正常進(jìn)行，在能量供給方面發(fā)揮著負(fù)面作用，與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。與Kaibara等［10］的研究結(jié)果相符。參與了鈣信號(hào)通路的5個(gè)蛋白Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2、Sodium/calcium exchanger 2、ADP/ATP translocase 2、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3、Isoform 2 of calcineurin subunit B type 1，均是低表達(dá)。Gavi?o等［11］的研究顯示，突觸前膜鈣通道和鈣流入的減少會(huì)導(dǎo)致突觸穩(wěn)態(tài)的自我調(diào)節(jié)功能減弱，繼而影響到學(xué)習(xí)記憶睡眠質(zhì)量的降低。隨之可能帶來(lái)精神方面的負(fù)面影響，引起抑郁。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白 ADP/ATP translocase 2、Succinate dehydrogenase［ubiquinone］flavoprotein subunit、ATP synthase-coupling factor 6、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3、AP-2 complex subunit beta參與了亨廷頓舞蹈癥，蛋白 ADP/ATP translocase 2、Succinate dehydrogenase［ubiquinone］flavoprotein subunit、ATP synthase-coupling factor 6、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3參與了帕金森病，而蛋白Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2、Isoform 2 of calcineurin subunit B type 1、Succinate dehydrogenase［ubiquinone］ flavoprotein subunit、ATP synthase-coupling factor 6參與了阿爾茨海默病。這3種疾病都是由于神經(jīng)變性疾病引起的大腦退化性疾病，并且當(dāng)病情發(fā)展到一定程度都會(huì)引起抑郁癥狀的發(fā)生［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)參與這3種疾病代謝通路的蛋白表達(dá)均降低，并且蛋白ADP/ATP translocase 2、Isoform 2 of voltage-dependent anion-selective channel protein 3參與2種疾病的代謝通路，而蛋白 Succinate dehydrogenase［ubiquinone］flavoprotein subunit、ATP synthase-coupling factor 6甚至參與了3種代謝通路。這些參與2種，甚至3種的蛋白質(zhì)會(huì)不會(huì)是引起神經(jīng)退行性病變的關(guān)鍵蛋白，從而引導(dǎo)其他蛋白進(jìn)入相應(yīng)的代謝通路，值得我們進(jìn)一步研究，從而尋找抗抑郁藥物的靶蛋白，并以此為基礎(chǔ)研發(fā)新型的抗抑郁藥物。

（致謝：本項(xiàng)目是在重慶醫(yī)科大學(xué)完成。感謝重慶醫(yī)科大學(xué)為本實(shí)驗(yàn)提供的儀器設(shè)備的支持，及技術(shù)上的幫助。感謝實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予過(guò)無(wú)私幫助的老師及同學(xué)們。）

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Analysis of CUMS-induced differentially
expressed proteins in rat hippocampus by ITRAQ

CAO Li-sha，ZHANG Fang，LUO Wen，CHEN Jing，HE Miao-quan，WANG Ji-sheng
（Dept of Clinical Pharmacy，the Third Hospital of Mianyang，Mianyang Sichuan621000，China）

AimsTo compare hippocampus between CUMS rats and normal rats，to find differentially expressed proteins and to explore the pathogenesis of depression in the protein levels and biological marker. MethodsChronic unpredicted mild stress was taken to establish rat depression model.The ITRAQ-labeled proteins and peptides were separated by the cation column，and differentially expressed proteins were detected and identified by 2D LC-MS/MS.The functions of proteins were analyzed by bioinformatics.ResultsTotally 5 109 proteins were identified，33 differentially expressed proteins were identified，the expressions of 8 proteins were increased and 25 proteins downregulated. ConclusionITRAQ based sereening is effective in discovering the nosogenesis of depression and new biological marker.

ITRAQ；proteomics；depression；hippocampus；mass spectrum；CUMS

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.020

A

1001-1978（2016）05-0697-06

R-322；R322.11；R341；R749.42；R977.6

2016-02-03，

2016-03-04

四川省衛(wèi)生廳科研課題（No 120320）

曹莉莎（1987-），女，碩士，藥師，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)，E-mail：285714739@qq.com；王繼生（1974-），男，博士，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)與藥物蛋白質(zhì)組學(xué)，通訊作者，E-mail：24475434@qq.com