宋　陽，詹　磊，黃　成，李　?。?安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院疼痛科，安徽合肥　300；.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥　3003；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽合肥　3060）

瞬時感受器電位離子通道香草素受體
亞家族4調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化增殖作用研究

宋陽1，詹磊2，3，黃成2，李俊2
（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院疼痛科，安徽合肥230022；2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230032；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽合肥230601）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.034.html

目的探討瞬時感受器電位離子通道香草素受體亞家族4（transient receptor potential vanilloid receptor 4，TRPV4）對肝星狀細(xì)胞（hepatic stelate cell，HSC）活化增殖的作用及可能的作用機制。方法以含50%CCl4的花生油溶液（1 mL·kg-1）皮下注射，建立大鼠肝纖維化模型。應(yīng)用蛋白印跡等方法在體觀察TRPV4及肌動蛋白α（α-smooth muscle actin，α-SMA）的蛋白表達(dá)變化。以轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）（10 μg·L-1）刺激肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6），離體觀察TRPV4及α-SMA的蛋白表達(dá)變化。應(yīng)用TRPV4非特異性抑制劑釕紅（ruthenium red，Ru）及TRPV4-siRNA特異性沉默TRPV4，觀察HSC-T6增殖及α-SMA、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）蛋白表達(dá)變化。結(jié)果肝纖維化組織與TGF-β1活化的HSC中TRPV4 及α-SMA蛋白表達(dá)明顯增加。阻斷 TRPV4可明顯抑制HSC增殖，且α-SMA、Akt蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論TRPV4參與調(diào)控HSC的活化增殖，調(diào)控Akt蛋白磷酸化。

肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；TRPV4；Akt；釕紅；活化增殖

肝星狀細(xì)胞（hepatic stelate cell，HSC）活化增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，抑制HSC活化增殖是防治肝纖維化的重要措施之一［1］。研究證實［2-3］，抑制瞬時感受器電位M7，可抑制人胚肺成纖維細(xì)胞株（MRC-5）、大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）活化增殖，促進其凋亡。提示離子通道蛋白可影響HSC增殖活化，可能在肝纖維化進程中發(fā)揮作用。HSC細(xì)胞膜上的離子通道成為調(diào)控HSC增殖與凋亡的新靶點。

瞬時受體電位通道（transient receptor potential channels，TRP channels）是位于細(xì)胞膜上的一類重要的陽離子通道，TRPV為TRP家族中的一個亞家族，TRPV廣泛存在于人體各種組織中，如心臟、肝、脾、腎、大腦、子宮等，參與人體的生理功能和病理變化。瞬時感受器電位離子通道香草素受體亞家族4 （transient receptor potential vanilloid receptor 4，TRPV4）屬TRPV家族成員，TRPV4不僅參與炎癥和神經(jīng)性疼痛的痛覺調(diào)控，還能感知熱知覺，并且可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長死亡等生理作用，具有重要的臨床和藥理學(xué)研究價值［4］。TRPV4在肝纖維化中的作用及可能的作用機制還不明確。本研究通過在體、離體觀察TRPV4在肝纖維化組織及活化的HSC中的表達(dá)變化，通過阻斷、沉默TRPV4，觀察其對HSC活化增殖的影響，及對蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt/PKB）蛋白表達(dá)的影響，探討其可能的作用機制。

1　材料

1.1實驗動物♂Spague-Dawlay（SD）大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。動物自由飲食，飲用自來水，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫（18～26）℃，常規(guī)飼養(yǎng)觀察1周后使用。

1.2細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫。以DMEM高糖培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素），在37℃含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育。實驗取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3試劑CCl4，汕頭西隴化工廠，臨用前用花生油1∶1稀釋；釕紅（ruthenium red，Ru），Sigma公司產(chǎn)品；重組人轉(zhuǎn)化生長因子（recombinant human TGF-β1），PeproTech公司產(chǎn)品；透明質(zhì)酸（HA）、層黏連蛋白（LN）、Ⅳ型膠原（CⅣ），北京北方生物技術(shù)研究所；羥脯氨酸（Hyp），南京建成生物工程研究所；MTT（3，4，5-dimethylthiazo-2-yl-2，5-diphenyltetrazolium bromide）粉，美國Sigma公司，用PBS配制成5 g·L-1，過濾除菌，4℃避光保存；TRIzol Reagent試劑，Invitrogen Life Technology公司；Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；抗TRPV4抗體，美國Abcam公司產(chǎn)品；抗β-actin抗體、抗Akt抗體，Santa Cruz公司產(chǎn)品；抗α-SMA抗體，博士德公司產(chǎn)品；辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的兔抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

2　方法

2.1大鼠肝纖維化模型的建立大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組，每組10只。CCl4（分析純）與花生油1∶1配制成植物油溶液，模型組于大鼠背部皮下注射含50%CCl4的花生油1 mL ·kg-1，每周2次，連續(xù)12周。正常組注射花生油1 mL·kg-1。12周末，大鼠禁食8 h處死，取血及肝臟組織，檢測HA、LN、CⅣ、Hyp、病理及α-SMA、Akt、TRPV4蛋白表達(dá)情況。

2.2纖維化指標(biāo)檢測按試劑盒說明書要求規(guī)范操作，測定血清HA、LN、CⅣ含量以及肝組織勻漿Hyp含量。

2.3病理學(xué)檢測取肝左葉相同部位的肝臟組織，大小為5 mm×5 mm，置于4%多聚甲醛中固定24 h。樣品經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯透明后，用石蠟包埋，制備5 μm連續(xù)切片后，HE、Masson染色切片，光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化情況。

2.4MTT法檢測細(xì)胞增殖0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔1×104個細(xì)胞，培養(yǎng)液體積為200 μL，培養(yǎng)細(xì)胞密度至80%～90%進行實驗。實驗組加入1 μmol ·L-1的Ru，對照組加入等體積的DMEM，每組設(shè)5個平行孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL濃度為5 g·L-1的MTT，吸去上清液，加入DMSO，每孔200 μL，混勻10 min后，酶標(biāo)儀570 nm處測定各孔吸光度A值。對照組細(xì)胞存活率為100%，其余各組按：存活率/%=［（各實驗組吸光度值-本底吸光度值）/（對照組吸光度-本底吸光度值）］×100%，實驗重復(fù)3次。

2.5TRPV4 siRNA的轉(zhuǎn)染靶向目的基因TRPV4的序列設(shè)計正義鏈：5'-CCGUGUCCUUCUACAUCAATT-3'，反義鏈：5'-UUGAUGUAGAAGGACACGGTT-3'；陰性對照組正義鏈：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義鏈：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。應(yīng)用BLAST檢索Gen-Bank表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)庫，確定siRNA序列唯一性，上海吉瑪制藥有限公司合成。實驗分正常組、模型組、對照組和TRPV4-siRNA轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞傳代至6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液體積為2 mL，每孔2× 105個細(xì)胞，模型組加入20 μL濃度為1 mg·L-1的TGF-β1，使其終濃度為10 μg·L-1，對照組轉(zhuǎn)染scrambled-RNAi并加入相同量的TGF-β1，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染TRPV4-siRNA并加入相同量的TGF-β1。以O(shè)pti-MEM和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體與siRNA量均為5 μL，siRNA終濃度為100 pmol·L-1，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)染6 h后，正常組加入完全培養(yǎng)基，其余每組加入含TGF-β1的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞，實驗重復(fù)3次。

2.6Western blot提取組織、細(xì)胞總蛋白，進行12%SDS-PAGE電泳，0.45 μm PVDF膜轉(zhuǎn)移，一抗4℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。成像結(jié)果應(yīng)用Image J軟件分析，通過分析α-SMA、TRPV4、p-Akt、Akt、β-actin的灰度值，計算各蛋白的含量變化是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗重復(fù)3次。

2.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

3　結(jié)果

3.1大鼠肝纖維化模型建立以CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，觀察血清HA、LN、CⅣ及肝組織勻漿中Hyp表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（Tab 1、Tab 2），與正常組相比，模型組血清HA、LN、CⅣ明顯增加（P＜0.01），肝組織勻漿中Hyp亦明顯增加（P＜0.01）。HE染色顯示（Fig 1），正常組大鼠肝細(xì)胞完整，肝組織無異常纖維增生；模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，假小葉形成，肝組織中有明顯炎性細(xì)胞浸潤。Masson染色結(jié)果顯示，正常大鼠肝細(xì)胞完整，無纖維組織增生；模型組大鼠有較多的成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，纖維結(jié)締組織增生，肝索排列紊亂并伴有假小葉形成。提示大鼠肝纖維化模型建立成功。

Tab 1　Sermu levels of HA，LN，CⅣin CCl4induced liver fibrosis（±s，n=10）

**P＜0.01 vs normal group

Group　HA/μg·L-1　LN/μg·L-1　CⅣ/μg·L-1Normal　53.63±14.23　107.52±21.12　51.42±12.42 Model　326.48±71.36**153.84±34.26**106.43±24.16**

Tab 2　Liver levels of Hyp in CCl4induced liver fibrosis（±s，n=10）

Tab 2　Liver levels of Hyp in CCl4induced liver fibrosis（±s，n=10）

**P＜0.01 vs normal

Group　Hyp/μg·g-1Normal　121±18.34 Model　376±34.21**

3.2TRPV4在肝纖維化大鼠肝組織中表達(dá)變化

進一步觀察TRPV4的表達(dá)變化。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)（Fig 2A），與正常組相比，模型組大鼠肝組織α-SMA、TRPV4蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。進一步以TGF-β1（10 μg·L-1）刺激HSC-T6細(xì)胞株，亦發(fā)現(xiàn)TGF-β1可明顯促進α-SMA、TRPV4蛋白表達(dá)（Fig 2B）。提示肝纖維化HSC活化增殖過程中，TRPV4表達(dá)增高。

Fig 1　Pathological observation of experimental rat liver sections stained with hematoxylin and eosin（HE）staining and Masson staining（×200）

Fig 2　Up-regulation of TRPV4 and α-SMA in CCl4-treated rats and TGF-β1-treated HSC-T6 cells

Fig 3　Ru prevented the proliferation and activation of HSC-T6 cells in vitro

3.3阻斷TRPV4對HSC活化增殖的影響為觀察TRPV4對HSC活化增殖的影響，應(yīng)用TRPV4非特異性抑制劑釕紅（Ru 1 μmol·L-1）作用于TGF-β1刺激的HSC-T6細(xì)胞，24 h后，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)（Fig 3A），與TGF-β1（10 μg·L-1）刺激的HSC-T6細(xì)胞比較，經(jīng)釕紅處理后，TRPV4蛋白水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。MTT及Western blot結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，與TGF-β1（10 μg·L-1）刺激的HSCT6細(xì)胞比較，釕紅可明顯抑制 TGF-β1（10 μg· L-1）刺激的HSC-T6細(xì)胞株增殖及α-SMA的蛋白表達(dá)。提示TRPV4可能參與肝纖維化HSC活化增殖的過程（Fig 3B、3C）。

3.4沉默TRPV4抑制HSC活化增殖為了進一步研究TRPV4對HSC活化增殖的影響，應(yīng)用TRPV4-siRNA特異性沉默TRPV4。轉(zhuǎn)染特異性TRPV4-siRNA 48 h后，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組TRPV4蛋白表達(dá)明顯降低（P ＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig 4A）。MTT及Western blot實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組HSC-T6細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，α-SMA蛋白水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig 4B、4C）。提示TRPV4參與肝纖維化HSC活化增殖的過程。

3.5沉默TRPV4抑制p-Akt蛋白表達(dá)研究證實，Akt通路在肝纖維化過程中發(fā)揮著重要的作用［5-6］。如Fig 5所示，應(yīng)用TRPV4-siRNA特異沉默TRPV4，可明顯抑制p-Akt的表達(dá)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。此結(jié)果提示TRPV4可抑制p-Akt的蛋白表達(dá)。

4　討論

肝纖維化是慢性肝病共有的病理過程，其持續(xù)發(fā)展可形成肝硬化、甚至肝細(xì)胞癌。深入研究肝纖維化發(fā)病機制，可能為慢性肝病的防治提供新的思路。HSC的活化、增殖，平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達(dá)增加，合成和分泌ECM增多是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［7］。因此，抑制HSC活化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的形成是治療肝纖維化的重要策略之一。TGF-β1作為TGF-β超家族中的重要成員之一，是致肝纖維化發(fā)生發(fā)展主要的細(xì)胞因子之一［8］。本實驗研究亦發(fā)現(xiàn)，以濃度為10 μg·L-1的TGF-β1刺激 HSC-T6細(xì)胞株，α-SMA表達(dá)明顯升高；同時，MTT實驗顯示，TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞株能明顯促進HSC-T6細(xì)胞的增殖。

Fig 4　TRPV4-siRNA inhibited HSC-T6 proliferation and α-SMA expression

Di Sario等［9］報道，選擇性的Na/H+泵（NHE）抑制劑 cariporide可明顯抑制在體及離體狀態(tài)下PDGF誘導(dǎo)的大鼠 HSC增殖。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，抑制瞬時受體電位 M7通道（transient receptor potential melastatin 7，TRPM7）可抑制MRC5、HSC-T6細(xì)胞株活化增殖，促進其凋亡，上述研究提示，離子通道功能的改變影響細(xì)胞的增殖、凋亡等生理功能［2-3，10-12］。瞬時受體電位通道是位于細(xì)胞膜上的一類重要的陽離子通道，TRPV為TRP家族中的一個亞家族。研究發(fā)現(xiàn)，TRPV家族成員TRPV4不僅參與炎癥和神經(jīng)性疼痛的痛覺調(diào)控，感知熱知覺，并且可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、死亡等生理作用，具有重要的臨床和藥理學(xué)研究價值。但TRPV4在肝纖維化中的作用還不明確。我們研究發(fā)現(xiàn)，CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型中，大鼠肝纖維化組織中TRPV4表達(dá)明顯升高。進一步以HSC-T6為研究對象，以轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)其活化，結(jié)果亦證實，HSC中存在TRPV4的表達(dá)，并且活化的HSC中，TRPV4表達(dá)明顯升高。應(yīng)用TRPV4阻斷劑釕紅作用于HSC-T6，實驗發(fā)現(xiàn)，釕紅可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖，并且HSC活化的特異標(biāo)志物α-SMA的蛋白表達(dá)亦明顯降低。提示TRPV4可能參與了HSC活化增殖。進一步應(yīng)用TRPV4-siRNA特異性沉默TRPV4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特異性沉默TRPV4可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖與α-SMA的表達(dá)。上述的實驗表明，TRPV4蛋白具有調(diào)控HSC活化增殖的功能。

Fig 5　TRPV4-siRNA decreased p-Akt expression

文獻(xiàn)及實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，Akt信號通路在維持細(xì)胞存活、增殖過程中具有關(guān)鍵性作用［5-6，13］，可調(diào)控HSC活化增殖。前期實驗發(fā)現(xiàn)，TRP家族成員，TRPM7可以通過Akt通路抑制HSC增殖、促進其凋亡。作為TRP家族成員TRPV4是否調(diào)控Akt信號通路，還未見文獻(xiàn)報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6中p-Akt表達(dá)明顯升高，TRPV4-siRNA特異沉默TRPV4可明顯降低p-Akt的蛋白表達(dá)，表明TRPV4調(diào)控p-Akt的蛋白表達(dá)。

綜上所述，TRPV4作為陽離子通道蛋白，在HSC活化增殖過程中具有重要作用，阻斷其表達(dá)可抑制HSC活化增殖。并且阻斷TRPV4可抑制p-Akt蛋白表達(dá)。本實驗為研究離子通道蛋白在肝纖維化中的作用提供了實驗參考。

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Regulatory effects of TRPV4 on liver fibrosis of rats

SONG Yang1，ZHAN Lei2，3，HUANG Cheng2，LI Jun2
（1.Dept of Pain，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022，China；2.School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei230032，China；3.Dept of Gynaecology and Obstetrics，the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601，China）

AimTo investigate the effect of TRPV4 onhepatic fibrosis of rats.MethodsLiver fibrosis modelof rats was induced by 50%CCl4twice a week for 12 weeks.HE and Masson staining were used to evaluate the degree of hepatic fibrosis，and the levels of αsmooth muscle actin（α-SMA）and TRPV4 were detected in fibrotic liver tissue by Western blot.HSC-T6 cells were activated by transforming growth factor β1 （TGF-β1），and the protein levels of α-SMA，TRPV4 were detected by Western blot.After using Ru and transfected with TRPV4-siRNA，HSC-T6 was stimulated with TGF-β1，the levels of α-SMA，TRPV4 and phosphorylation level of Akt were determined by Western blot.ResultsTRPV4 was highly expressed in model liver tissues and in activated HSC-T6 induced by TGF-β1.The levels of α-SMA and phosphorylation of Akt decreased in TGF-β1-induced HSC，used with Ru or transfected with TRPV4-siRNA.ConclusionsThe expression of TRPV4 increases in fibrotic livers and activated hepatic stellate cells.Knockdown of TRPV4 can suppress the activation of hepatic stellate cells induced by TGF-β1，and decrease the phosphorylation levels of Akt.

liver fibrosis；hepatic stellate cell；TRPV4；Akt；Ru；activation and proliferation

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.017

A

1001-1978（2016）05-0681-07

R-332；R322.47；R329.24；R345.57；R392.11；R575.2

2015-12-28，

2016-01-29

國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81473268，81273526）；教育部博士點基金項目（No 20123420120001）；安徽省自然科學(xué)基金項目（No 1408085MKL31）；安徽省科技攻關(guān)項目（No 1301042212）

宋陽（1976-），男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：麻醉藥理學(xué)，E-mail：598395962@qq.com；李?。?960-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：lj@ahmu.edu.cn