陳　瑤，余細勇，2（.廣東省心血管病研究所、廣東省人民醫(yī)院，廣東廣州　50080；2.廣州醫(yī)科大學藥學院，廣東廣州　5436）

Hedgehog通路對心肌梗死及心肌細胞缺血缺氧的作用機制研究

陳瑤1，余細勇1，2
（1.廣東省心血管病研究所、廣東省人民醫(yī)院，廣東廣州510080；2.廣州醫(yī)科大學藥學院，廣東廣州511436）

網絡出版時間：2016-4-26 11：06網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.032.html

目的探討Sonic Hedgehog信號通路在正常心臟和缺血缺氧的心肌細胞的激活與表達。方法用左前降支結扎法構建心肌梗死模型，并用超聲心動圖鑒定。采用Western blot和免疫熒光染色分別檢測12例心肌梗死組織，9例正常心肌組織，H9C2及H2O2誘導下的H9C2細胞的Shh、Ptch-1、Smo、Gli-1的表達。注射激動劑及抑制劑于H2O2誘導的缺血缺氧H9C2的細胞模型，再次檢測Shh、Ptch-1、Smo、Gli-1的表達及強弱。結果Shh、Gli-1在心肌梗死心臟表達，Ptch-1、Smo在正常心臟及心肌梗死心臟均表達，缺血缺氧H9C2細胞模型的 Shh、Gli-1表達增加。H2O2誘導下的H9C2表達Gli-1、Shh，Ptch-1、Smo在正常H9C2和H2O2誘導下的H9C2均有表達。結論Shh信號通路在缺血與氧化應激條件下被激活，并且具有促進心肌細胞的損傷修復作用。

Hedgehog通路；心肌梗死；缺血；缺氧；H2O2；心肌細胞

Hedgehog信號家族在早期胚胎的發(fā)育及分化，特別是中胚層的分化中具有極為重要的作用［1］，并且參與細胞及組織的生理與病理的發(fā)育過程［2］。在對果蠅的基因突變進行篩查的時候，Nusslein-Vollhard和 Wieschaus于1980年發(fā)現(xiàn)了 Hedgehog基因及Patched基因。經典的Hedgehog抑制劑cyclopamine的發(fā)現(xiàn)，以及研究發(fā)現(xiàn)類固醇生物堿信號通路激活的作用方式是通過阻斷Smo受體的功能來實現(xiàn)的，也使得近年來Hedgehog信號通路的研究成為一股新的熱潮。Hedgehog家族有3個分支：Shh、Ihh、Dhh，其中，Ihh表達于內臟及軟骨細胞［3-4］，Dhh表達于間質細胞［5］，而Shh廣泛表達于很多發(fā)育過程中，是最具典型特征的一個分支［6］。因此，我們選擇Shh分支作為研究切入點。Shh信號通路在很多器官可以促進血管再生發(fā)揮組織修復作用［7-8］，在成人的心血管系統(tǒng)里，Shh主要參與動脈血管的形成并且促進血管再生［9］。Shh的膜受體蛋白Ptch-1/Smo已經被認知，Ptch是Hedgehog的結合蛋白，Smo是調控蛋白，在Shh信號通路未被激活的時候，Ptch抑制Smo的表達。兩者起著拮抗共生的作用，這種拮抗共生的現(xiàn)象被稱為刺猬現(xiàn)象，英文Hedgehog syndrome，在蛋白通路里也是少有的拮抗共生的通路，于是沿用了“刺猬”這個名詞，取名為“刺猬通路”［10］。研究表明，Shh可以激活內在的細胞內通路，與經典的心肌缺血/再灌（IR）保護作用相關［11］，但與心肌梗死的關系尚未明確。

研究表明，Shh能夠促進血管再生，改善血流灌注，這些表現(xiàn)在肌肉組織Shh及上調的下游基因十分明顯，同時伴有Ang-1及VEGF等促進血管生成的表達。Shh的信號轉導主要涉及幾種重要的信號分子：①Shh在消化道、神經系統(tǒng)等組織是以分泌型蛋白的存在起作用；②有跨膜區(qū)結構的跨膜蛋白受體patched（Ptch-1）；③Smoothened（Smo）在信號傳導的通路中十分重要；④Gli-1的鋅指結構可調節(jié)促進血管生長的目的基因。信號轉導途徑一般為：Shh下調時，Smo和Ptch-1結合，Gli-1被抑制；Shh上調時，Ptch-1與Shh結合，Smo被激活并且呈游離狀態(tài)，Gli-1成為激活因子，參與轉錄DNA結合誘導目的基因。Ptch-1、Gli-1的表達說明了Sonic Hedgehog信號通路的活性程度。本研究旨在通過缺血缺氧模型，觀察Hedgehog信號通路在激活情況下，對心臟組織及細胞的保護作用。

1　材料與方法

1.1左前降支心肌梗死模型的建立SPF級♀ SD大鼠200～250 g 24只（中山大學動物實驗中心），分為正常組（6只）、心肌梗死組（6只）、心肌梗死+ Shh激動劑組（6）、心肌梗死 +Shh拮抗劑組（6只）。

10%多聚甲醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，氣管插管，接呼吸機（DW-3000B，安徽淮華），呼吸頻率90次/分鐘，潮氣量8～10 mL，呼吸比為1∶1。剔除胸部毛發(fā)及消毒后，在左側胸部第3、4肋間鈍性分離組織，感到突破感后迅速放入開胸器，在左心耳及肺動脈圓錐中1/3進針，用6-0棉線行外科結扎，見心室前壁跳動減緩，1 min之后會見到左室前壁蒼白，部分出現(xiàn)室性心律失常，無需特別處理，關胸，成半臥位側臥放于37℃熱毯上。

1.2超聲心動圖測定LAD結扎術大鼠14d后行超聲心動圖。經乙醚吸入麻醉，臥位固定，取胸骨旁短軸為切面，M型超聲記錄左室收縮末內徑、左室舒張末內徑、左室短軸縮短分數(shù)、左室收縮期前壁及后壁厚度、左室舒張期前壁及后壁厚度。左室射血分數(shù)（EF）＜50%來確認心肌梗死模型是否成功。

1.3心肌組織的病理形態(tài)學常規(guī)HE及Masson染色后，可見心肌組織在顯微鏡下呈現(xiàn)區(qū)域性變性變化，病變區(qū)肌纖維排列紊亂，細胞核固縮破裂，肌絲斷裂溶解，有炎性細胞浸潤，存活的心肌細胞呈島樣分布，周圍可見纖維組織生成，壞死的心肌被纖維組織替代。

1.4H9C2細胞培養(yǎng)及缺血缺氧模型的構建

H9C2細胞（廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心），37℃溫浴，鋪6孔板上，10%FBS+DMEM，細胞生長至融合80%時，注入30%H2O230 μL·mL-1培養(yǎng)基。12 h后，觀察到培養(yǎng)基顏色為黃色清亮液體，并且，相比對照組，失去一半細胞，細胞壁邊緣不規(guī)整，并用CCK-8試劑盒加以確認，免疫熒光染色，取10個視野，數(shù)細胞核數(shù)目，取平均值，可見細胞核較正常組減少40%～50%。

1.5缺血缺氧的H9C2的Hedgehog信號在缺血缺氧的H9C2細胞中分別加入Shh激動劑（Purmorphamine，No.S3042 Selleck）和抑制劑（Cyclopamine，No.s1146 Selleck），作用24 h，免疫熒光及Western blot觀察 Hedgehog通路的（Shh、Gli-1、Smo、Ptch-1）的表達。

1.6Western blot檢測組織研磨至看不見顆粒，6孔板中細胞用細胞刮刀進行冰上刮取，并加入RIPA+蛋白酶抑制劑，置于EP管中，12 000 r·min-14℃離心，15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，加入loading buffer制備蛋白樣品，加熱10 min，立即上樣配好的膠上，80 V電泳90 min，300 mA電轉60 min轉膜。分別敷育一抗（Shh、Ptch、Smo、Gli-1）（Gli-1，ab151796 Abcam；Sonic Hedgehog，NBP1-

47966 NOVUS；Ptch，NB100-91923 NOVUS；Smoothened，ab113438 Abcam）4℃過夜，TBXT洗膜3次，每次10 min，孵育二抗（Anti-rabbit IgG，ab9721 Abcam；或者Anti-mouse IgG ab6728 Abcam），TBXT洗膜。ECL法曝光，將A液及B液1∶1比例混勻，自動曝光儀曝光。

1.7免疫熒光檢測組織和處理后細胞，陰干，組織用多聚賴氨酸包被，加入4%PFA 30 min，PBS+ 1%BSA洗后加入5%BSA封閉120 min，依次加入一抗孵育4℃過夜，二抗孵育60 min，DAPI 10 min，封片。在熒光顯微鏡下觀察心梗區(qū)組織及H9C2細胞的熒光表達，取10個視野，取平均值。試劑同上。

1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）考慮到每組6個樣本為小樣本，故采用 one-way ANOVA比較總體，兩兩比較采用未假定方差齊性的Dunnett's T3檢驗。

2　結果

2.1心肌梗死超聲圖及指標超聲心動結果提示，結扎左前降支4周后，LVID和LVAW出現(xiàn)明顯下降，而對照組無明顯變化。同時，EF結果提示結扎左前降支后出現(xiàn)明顯下調，與對照組比較差異明顯（Fig 1、2）。

Fig 1　Echocardiogram of myocardial infarction

2.2正常心臟及心肌梗死的HE、Masson染色圖采用HE和Masson染色提示，實驗組結扎左前降支后，病變區(qū)肌纖維排列紊亂，細胞核固縮破裂，肌絲斷裂溶解，有炎性細胞浸潤，存活的心肌細胞呈島樣分布，周圍可見纖維組織生成，壞死的心肌被纖維組織替代。而對照組心肌細胞分布均勻，肌纖維排列整齊，無明顯炎癥浸潤（Fig 3、4）。

2.3正常心臟及心肌梗死的免疫熒光檢測免疫熒光檢測提示，Ptch-1和Gli-1在正常心臟及心肌梗死中均有表達。H9C2在Shh激動劑和H2O2作用下，Hedgehog信號增強；而在Shh抑制劑和H2O2作用下，Hedgehog信號減弱（Fig 5～8）。

Fig 2　Changes in myocardial index in normal myocardium（CT）and myocardial infarction（MI）before and after modeling

Fig 3　HE staning of normal hearts（left）and hearts with myocardial infarction（right）

Fig 4　Masson staining of normal hearts（left）and hearts with myocardial infarction（right）

2.4Western blot檢測結果Gli-1、Shh在正常心臟及H9C2不表達，Ptch-1、Smo在正常及心肌梗死組均有表達，未處理H9C2的Ptch-1、Smo均表達，抑制劑處理的缺血缺氧H9C2的Gli-1、Shh表達低于同期PBS組H9C2，激動劑處理的缺血缺氧H9C2的Gli-1、Shh表達高于同期PBS組H9C2。顯示Shh通路能夠對缺血缺氧性損傷起著保護作用（Fig 8、9）。

3　討論

研究表明，成年心臟組織存在Hedgehog信號通路，心肌梗死后的Shh通路能夠保護心肌損傷及細胞損傷，這也說明了Shh通路在人胚胎發(fā)育和心肌生成中的重要作用。同時，我們研究也證明，在缺血缺氧的條件下，組織層面及細胞層面均顯示該通路的激活，給予激動劑的作用下，該通路表達更為明顯，減少了纖維化的發(fā)生和凋亡的作用，說明激活該通路在心肌梗死后的表達可以逆轉心肌纖維化并且促進心肌組織新生。最近有報道，骨骼肌組織梗死之后也會發(fā)現(xiàn)明顯的 Shh mRNA和蛋白的上調［12-14］。

Fig 5　Protein expression of Gli-1，Ptch-1 in normal myocardia（left）and myocardial infarction（right）tissues

Fig 6　Hedegehog pathway of cyclopamine+H2O2+H9C2

Fig 7　Hedgehog pathway of purmorphamine+H2O2+H9C2

Fig 8　Immunofluorescence of Shh pathway expressions of H2O2induced H9C2 cells

Fig 9　Westeren blot result of normal myocardium（left） and myocardial infarction（right）tissues

本研究的Western blot和免疫熒光檢測結果，說明了Ptch-1、Gli-1、Smo及Shh之間的相互作用關系符合經典的Hedgehog通路。在成年大鼠心臟組織，Shh、Ptch、Smo、Gli-1均不表達，在心梗組才發(fā)現(xiàn)表達，說明心臟的自我修復功能在正常情況下處于關閉狀態(tài)，只有一定程度的刺激才被激活。在細胞層面上，哈佛的干細胞研究人員報道了腎臟的Sonic hedgehog信號通路的激活，并且說明與干細胞再生的相關能力起著十分關鍵的作用［15］。本研究表明，細胞水平的正常組Gli-1、Shh、Ptch-1、Smo不表達，經過H2O2的誘導刺激作用，Gli-1、Shh、Ptch-1、Smo開始表達，與整體動物實驗結果一致，說明在氧化應激的條件下該信號通路被激活，且具有促進心肌細胞的損傷修復作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，Ptch-1既是Hedgehog的膜受體，又是Hedgehog的轉錄目的蛋白，所以它的表達既說明了Hedgehog信號的反應性，又說明了Hedgehog通路的激活［15］。當Smo功能發(fā)生獲得性的改變，或者Ptch對其解除鏈接作用的時候，會引發(fā)整個Hedgehog信號通路的活化，這在本研究結果也表現(xiàn)明顯。我們推測，如果在病損的心臟組織中抑制Smo信號通路的活化，可能是心臟組織治療的一種新的思路。Gli-1的上調能夠調節(jié)目的基因的轉錄，并且最終導致Hedgehog通路對該細胞或是組織的修復作用。通過我們的實驗，Gli-1在正常的心臟組織、正常的H9C2是不表達的，而心肌梗死組織及H2O2誘導的H9C2細胞中表達，提示氧化應激是Gli-1表達激活的一個重要誘發(fā)因素。

綜上所述，Sonic Hedgehog信號通路不僅在胚胎的生長發(fā)育中起著至關重要的作用，而且在氧化應激條件下起著重要的維持穩(wěn)態(tài)作用。有關該信號通路在心肌損傷與修復的作用地位以及潛在的治療靶點，有待進一步深入研究。

（致謝：感謝廣東省人民醫(yī)院的林秋雄主任、單志新主任的點滴提醒，感謝李曉紅、潘宇、孟錦秀、麥麗萍老師的指導，感謝肖靜、楊翔宇的幫助。）

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Effect of Hedgehog pathway on myocardial infarction and hypoxic-ischemic cardiomyocytes

CHEN Yao1，YU Xi-yong1，2
（1.Guangdong Cardiovascular Institute，Guangdong General Hospital，Guangzhou510080，China；2.School of Pharmaceutical Sciences，Guangzhou Medical University，Guangzhou511436，China）

AimTo investigate the effect of Sonic Hedgehog on normal hearts and hypoxic-ischemic myocardial cells.MethodsA method for left anterior descending artery（LAD）ligation was employed to construct the myocardial infarction model，and ultrasonic cardiogram was used for identification.Western blot and immunofluorescence staining were used to detect expressions of Shh，Ptch-1，Smo and Gli-1 in H9C2 cells and H2O2-induced H9C2 cells，and that in 12 cases of myocardial infarction tissues and 9 cases of normal myocardium，respectively.Agonist and antagonist of Shh pathway were adminstered in the hypoxic-ischemic myocardial H2O2-induced H9C2 cell model，and once again expressions and strength of Shh，Ptch-1，Smo，Gli-1 were detected.ResultsShh and Gli-1 were not expressed in normal hearts，but expressed in hearts with myocardial infarction；Ptch-1 and Smo were expressed in both normal hearts and hearts with myocardial infarction.Under the action of agonist，expressions of Shh and Gli-1 increased in the hypoxic-ische-mic H9C2 cell model.Similarly，Shh and Gli-1 were not expressed in normal H9C2 cells，but in H2O2-induced H9C2 cells，and Ptch-1 and Smo were expressed in both normal H9C2 and in H2O2-induced H9C2 cells.ConclusionShh signaling pathway can be acti-vated in the condition of ischemia and oxidative stress，and then it promotes the repairing of myocardial cell damage.

Hedgehog pathway；myocardial infarction；ischemia；hypoxia；H2O2；myocardial cells

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.016

A

1001-1978（2016）05-0676-06

R-332；R322.11；R329.24；R542.22；R845.22

2016-01-15，

2016-02-18

國家自然科學基金資助項目（No 81120108003，8133 0007）；廣東省科技計劃重點項目（No 2014 A050503047，2015B020225006）

陳瑤（1987-），女，碩士生，主治醫(yī)師，研究方向：心血管藥理學，E-mail：1597384174@qq.com；余細勇（1962-），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，E-mail：yuxycn@aliyun.com