王曉沖，董靜文，趙香玉，王　耀，胡　偉，張建軍（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，新藥作用機(jī)制研究和藥效評價北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100050）

化合物H057鎮(zhèn)靜催眠作用評價

王曉沖，董靜文，趙香玉，王耀，胡偉，張建軍
（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，新藥作用機(jī)制研究和藥效評價北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050）

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目的評價化合物H057鎮(zhèn)靜催眠的藥效學(xué)，并對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步研究。方法利用開場實(shí)驗(yàn)測定H057對小鼠自主活動的影響，評價其中樞鎮(zhèn)靜作用；通過協(xié)同閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠和H057直接誘導(dǎo)小鼠睡眠實(shí)驗(yàn)，評價其催眠作用；利用微透析技術(shù)測定H057對大鼠大腦皮層細(xì)胞外液抑制性氨基酸GABA和單胺神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE含量的影響。結(jié)果與溶劑對照組相比，H057（5、25 mg·kg-1，i.p.）組能明顯抑制小鼠自主活動，抑制率分別為25%和66%；H057能明顯增加閾下劑量戊巴比妥鈉（25 mg·kg-1，ip）誘導(dǎo)小鼠的入睡率，3、5 mg·kg-1組小鼠入睡率分別增加為62.5%和87.5%；H057（≥60 mg·kg-1，i.p.）可直接誘導(dǎo)小鼠100%入睡，60 mg·kg-1劑量下誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間分別為（24±11）min和（97± 15）min；微透析實(shí)驗(yàn)表明，H057（25 mg·kg-1，i.p.）能明顯升高大鼠大腦皮層細(xì)胞外液GABA含量，給藥10 min后升高了26%；能明顯降低5-HT和NE的含量，給藥1 h后分別降低了50%和38%。結(jié)論化合物H057具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)靜催眠作用，升高大腦皮層細(xì)胞外液GABA含量，同時降低單胺神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和NE的含量可能是其發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的機(jī)制之一。

鎮(zhèn)靜催眠；自主活動；翻正反射消失；微透析；γ氨基丁酸；單胺神經(jīng)遞質(zhì)

失眠被定義為入睡或維持睡眠困難［1］，是現(xiàn)代生活常見的睡眠障礙性疾病，它既可以是一種原發(fā)性疾病，也可能是其他疾病的一種臨床癥狀，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，同時也會產(chǎn)生各種軀體障礙和精神疾病。缺乏睡眠可能會導(dǎo)致白天嗜睡、記憶損傷、焦慮、抑郁等癥狀［2］。目前，臨床應(yīng)用的鎮(zhèn)靜催眠藥物有：①苯二氮卓類；②非苯二氮卓類；③褪黑素受體激動劑；④orexin受體拮抗劑［3］。

藥物治療失眠被推薦用于短期治療，因?yàn)殚L期服用鎮(zhèn)靜催眠藥物會引起諸多不良反應(yīng)，例如睡眠結(jié)構(gòu)的破壞、藥物成癮和耐受。理想的鎮(zhèn)靜催眠藥物應(yīng)具備快速誘導(dǎo)睡眠，對睡眠結(jié)構(gòu)無影響，無次日殘留作用，不影響記憶功能，無呼吸抑制作用，長期使用無依賴或戒斷癥狀等特點(diǎn)［4］。而現(xiàn)有的鎮(zhèn)靜催眠藥物顯然不能完全滿足臨床需求，因此尋找新型鎮(zhèn)靜催眠藥物具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)室與藥化室張純貞研究員課題組合作，從一系列哌嗪類化合物中篩選出化合物H057（Fig 1），其結(jié)構(gòu)新穎，且具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)靜催眠活性。本文旨在對化合物H057的鎮(zhèn)靜催眠活性進(jìn)行藥效學(xué)評價及機(jī)制的初步研究。

Fig 1　Chemical structure of H057

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物♂ ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，清潔級，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（京）2012-0001。分籠飼養(yǎng)（8 只/籠），室溫保持在25℃，濕度40%～70%，自由進(jìn)食和飲水，照明時間8∶00～20∶00。實(shí)驗(yàn)前動物適應(yīng)環(huán)境至少3 d。

1.1.2藥品與試劑化合物H057（分子質(zhì)量：448）由本所胡偉教授合成，其結(jié)構(gòu)（3，4-difluorophenyl）（4-（3-（（7-methoxybenzo［d］［1，3］dioxol-5-yl）-2-methylpropyl）piperazin-1-yl）methanone。H057為白色粉末，水溶性差，易溶于有機(jī)溶劑。地西泮購自北京益民藥業(yè)有限公司。戊巴比妥鈉為Fluka產(chǎn)品。H057及地西泮用1%的Tween 80浸潤并研磨后，溶于生理鹽水中配制成相應(yīng)濃度。戊巴比妥鈉用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度。用生理鹽水（含1% Tween 80）作為溶劑對照。實(shí)驗(yàn)給藥途徑均為腹腔注射，陽性對照地西泮的給藥劑量為5 mg·kg-1，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠翻正反射消失的閾下劑量為25 mg·kg-1，閾上劑量為40 mg·kg-1。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、鄰苯二甲醛（ophthalaldehyde，OPA）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和5-羥色胺（serotonin，5-HT）均為Sigma產(chǎn)品；β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，BME）購自Amresco公司；甲醇為色譜純，購自北京化工廠；玻璃離子水門汀購自上海榮祥齒科材料有限公司；30%過氧化氫（批號：20130917）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

1.1.3溶液配制

1.1.3.1衍生化試劑稱取27 mg OPA溶于1 mL甲醇中，配制成27 g·L-1鄰苯二甲醛溶液，4℃避光保存；四硼酸鈉用雙蒸水配制成0.1 mol·L-1，調(diào)pH為10.4，避光室溫保存；β-巰基乙醇用甲醇稀釋20倍，4℃避光保存。取1.5 mL的四硼酸鈉溶液加入50 μL OPA溶液和5 μL β-巰基乙醇，即配成衍生化試劑（每次現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.1.3.2人工腦脊液配方氯化鈉（NaCl 125 mmol·L-1），氯化鉀（KCl 2.5 mmol·L-1），碳酸氫鈉（NaHCO326 mmol·L-1），磷酸二氫鉀（KH2PO40.3 mmol·L-1），葡萄糖（Glucose 10 mmol·L-1），氯化鈣（CaCl22.4 mmol·L-1），硫酸鎂（MgSO41.3 mmol·L-1）和磷酸二氫鈉（NaH2PO40.8 mmol· L-1）（pH 7.2～7.4）［5］。

1.1.4儀器鼠博士自發(fā)活動實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（RD1413，上海移數(shù)信息科技有限公司），BehaviorSys2.2.0軟件。腦立體定位儀（68002，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；高速顱骨鉆頭（STRNG90，韓國Seashin）；微透析套管（839024，瑞典CMA公司）；微透析針（8010434，CMA 12 MD，4 mm；O.D.0.5 mm；Cut-off：2000Dlton，瑞典CMA公司）；微量注射泵（圣諾SN-50F6）；高效液相色譜泵（LC-10A，日本島津公司）；電化學(xué)檢測器（LC-4C，美國BAS公司），色譜柱（Diamonsil（R）C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪馬科技有限公司），工作站（JS-3070，大連江申）。

1.2方法

1.2.1開場實(shí)驗(yàn)（OFT）［6-7］開場實(shí)驗(yàn)在一個放有不透明的方形自主活動箱（50 cm×50 cm×40 cm）的暗室中進(jìn)行，自主活動箱正上方有攝像頭記錄小鼠在箱中的活動。♂ICR小鼠隨機(jī)分為5組，分別為溶劑對照組、地西泮（5 mg·kg-1）組和H057 （1、5、25 mg·kg-1）組。腹腔注射（i.p.）溶劑對照、地西泮或H057，15 min后將小鼠放入單個自主活動箱內(nèi)，攝像機(jī)記錄5 min內(nèi)小鼠的活動路程，并用BehaviorSys2.2.0軟件進(jìn)行自動分析。

1.2.2協(xié)同閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠實(shí)驗(yàn)［8］♂ICR小鼠隨機(jī)分為5組，分別為溶劑對照組、地西泮組（5 mg·kg-1）和H057（1、3、5 mg·kg-1）組。腹腔注射溶劑對照、地西泮或H057，20 min后各組腹腔注射閾下劑量戊巴比妥鈉（25 mg· kg-1），觀察15 min內(nèi)各組入睡的動物數(shù)。

1.2.3翻正反射消失實(shí)驗(yàn)（LORR）［9］♂ ICR小鼠隨機(jī)分為5組，分別為溶劑對照組、戊巴比妥鈉組（40 mg·kg-1，i.p.）和H057組（40、50、60 mg· kg-1，i.p.）。以翻正反射消失超過1 min為入睡指標(biāo)，從注射藥物到翻正反射消失記為睡眠潛伏期，從翻正反射消失至翻正反射消失恢復(fù)記為睡眠維持時間。記錄小鼠翻正反射消失時間和翻正反射恢復(fù)時間，并計(jì)算其入睡潛伏期和睡眠時間。

1.2.4利用微透析測定大鼠大腦皮層細(xì)胞外液GABA和單胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量［10］

1.2.4.1微透析手術(shù)SD大鼠用4%的水合氯醛麻醉，將其固定于腦立體定位儀，電動剃毛器刮掉顱骨上方毛發(fā)，剪開頭皮，3%H2O2腐蝕頭皮，暴露出前囟，定位前囟，記下前囟坐標(biāo)。參照大鼠腦立體定位圖譜［11］，確定SD大鼠前額葉皮層坐標(biāo)為（bregma AP+2.8 mm，ML+0.7 mm，DV 1 mm），根據(jù)此坐標(biāo)確定打孔位置，用電動鉆頭進(jìn)行打孔，至腦膜暴露，用細(xì)針將腦膜小心挑破（切勿扎破血管），將套管埋入相應(yīng)深度，用玻璃離子水門汀對套管進(jìn)行固定。手術(shù)完畢，待恢復(fù)1 d后測定。

1.2.4.2微透析取樣和處理大鼠清醒狀態(tài)下，將套管小心拔出，插入CMA 4 mm探針，微灌注泵灌注透析用人工腦脊液，用0.2 μm微孔濾膜過濾。透析時保持灌流液溫度37.0～38.0℃，灌流速度為1 μL·min-1。微透析探針置入2 h后收集透析液，待透析液中基礎(chǔ)值穩(wěn)定后，腹腔注射生理鹽水或H057 （25 mg·kg-1）。對于GABA含量測定，給藥后每10 min收集1管透析液，將收集的透析液與衍生化試劑以1∶2的比例冰上反應(yīng)2 min后，用高效液相色譜電化學(xué)法（HPLC-EC）進(jìn)行檢測；對于單胺神經(jīng)遞質(zhì)的測定，給藥后每1 h收集1管透析液（透析管中預(yù)先加入10 μL 0.1 mol·L-1HClO4以防止收集液中遞質(zhì)的氧化），收集的透析液用高效液相進(jìn)行檢測。

1.2.5HPLC分析檢測條件檢測電壓0.6 V；增益為2 nA；靈敏度1 ng；泵流速1.2 mL·min-1。

2　結(jié)果

2.1化合物H057對小鼠自主活動的影響開場實(shí)驗(yàn)用于篩選具有鎮(zhèn)靜作用的藥物，一般具有明顯中樞抑制作用的藥物可明顯降低小鼠的自主活動［12］。如Fig 2所示，小鼠分別腹腔注射生理鹽水、地西泮（5 mg·kg-1）和H057（1、5、25 mg·kg-1），15 min后測定小鼠自主活動。結(jié)果顯示，H057（5、25 mg·kg-1）能明顯抑制小鼠自主活動，兩劑量組的抑制率分別為25%和66%，與溶劑對照組相比差異有顯著性（Dunnett's test，P＜0.05和P＜0.01）。結(jié)果表明，H057具有明顯的鎮(zhèn)靜作用。

Fig 2　Effect of H057 on spontaneous locomotor activity in mice（±s，n=8）

2.2化合物H057對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠的入睡率的影響如Tab 1所示，與溶劑對照組相比，H057能明顯增強(qiáng)閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠的作用，3、5 mg·kg-1組小鼠的入睡率分別增加為62.5%和87.5%，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異均具有顯著性（P＜0.01）。

2.3化合物H057誘導(dǎo)小鼠催眠作用以翻正反射消失時間超過1 min為入睡指標(biāo)，如Tab 2所示，與溶劑對照組相比，腹腔注射H057（60 mg·kg-1）能引起小鼠100%入睡（P＜0.01）。Tab 3所示為各組小鼠的睡眠潛伏期和睡眠時間。

Tab 1　Effect of H057（i.p.）on sleep onset induced by subthreshold dosage of sodium pentobarbital（25 mg·kg-1，i.p.）in mice（n=8）

Tab 2　Effect of H057 on sleep onset in mice（n=8）

Tab 3　Effects of H057 on sleep latency and sleeping time in mice（±s，n=8）

Tab 3　Effects of H057 on sleep latency and sleeping time in mice（±s，n=8）

Group　DoseLatency/min　Sleeping /mg·kg-1　time/min Vehicle　-　-　-Sodium pentobarbital　40　6±1.2　59±7 H057　60　24±4　96±8

2.4化合物H057對大鼠大腦皮層細(xì)胞外液GABA含量的影響微透析實(shí)驗(yàn)中，探針插入核團(tuán)平衡2 h后，腹腔注射H057（25 mg·kg-1）。10 min內(nèi)細(xì)胞外液GABA含量開始明顯升高，且達(dá)到峰值，給藥30 min后，GABA含量逐漸降至基礎(chǔ)水平（Fig 3）。

2.5化合物H057對大鼠大腦皮層細(xì)胞外液5-HT 和NE含量的影響微透析實(shí)驗(yàn)表明，腹腔注射H057（25 mg·kg-1）后1 h，大鼠大腦皮層細(xì)胞外液5-HT和NE含量均明顯降低，分別降低38%和50% （Fig 4）。給藥2 h后NE的含量基本恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，而5-HT含量仍未恢復(fù)。

3　討論

Fig 3　Effect of H057 on cerebral cortex extracellular GABA level in rats（±s，n=8）

Fig 4　Effects of H057 on contents of NE（A）and 5-HT（B）in extracellular fluid in cerebral cortex in rats（±s，n=8）

小鼠開場實(shí)驗(yàn)是藥理學(xué)研究中常用的方法之一，在評價藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響方面有重要的意義。動物的自主活動情況反映其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)，興奮時自主活動數(shù)增加，抑制時活動次數(shù)減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射H057（5、25 mg· kg-1）能明顯抑制小鼠自主活動。協(xié)同閾下劑量戊巴比妥鈉實(shí)驗(yàn)常用于鎮(zhèn)靜催眠化合物的初步篩選［13］。在該實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，H057能明顯增加閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠的入睡率。小鼠翻正反射消失超過1 min可作為小鼠睡眠的行為學(xué)標(biāo)志［14］。ICR小鼠腹腔注射H057（≥60 mg·kg-1）可直接誘導(dǎo)小鼠100%翻正反射消失。

GABA是大腦中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，腦中不同部位的GABA神經(jīng)元共同起到了促進(jìn)睡眠的作用。GABA可使覺醒轉(zhuǎn)化為睡眠［15］。目前臨床上主要的鎮(zhèn)靜催眠藥物，如苯二氮卓類的地西泮和非苯二氮卓類的唑吡坦均以GABA受體作為靶點(diǎn)。因此，首先我們探索了化合物H057對GABA系統(tǒng)的影響。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果已經(jīng)證明化合物H057與GABAA受體無相互作用。因此，我們探究H057對GABA含量的影響。我們利用微透析技術(shù)，測定大鼠大腦皮層細(xì)胞外液GABA含量。腦微透析技術(shù)是一種在體腦化學(xué)采樣技術(shù)，其原理是腦細(xì)胞外液中可溶性小分子可通過一種半透膜管的微小孔徑順濃度梯度擴(kuò)散，是監(jiān)測腦細(xì)胞外液中小分子物質(zhì)的一種重要手段［16］。微透析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H057能明顯升高大鼠大腦皮層細(xì)胞外液GABA水平，這一結(jié)果與H057使動物鎮(zhèn)靜催眠的藥效學(xué)一致。

單胺能神經(jīng)系統(tǒng)是促覺醒系統(tǒng)中非常重要的一個分支，它主要包括腹側(cè)導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（vPAG）多巴胺神經(jīng)元，背側(cè)和正中脊核（DR）5-HT能神經(jīng)元和藍(lán)斑核（LC）去甲腎上腺素能神經(jīng)元。這些神經(jīng)元共同組成了促覺醒系統(tǒng)的一條激活途徑，激活大腦皮層，發(fā)揮促覺醒的作用。本研究利用微透析技術(shù)測定了化合物H057對大鼠大腦皮層細(xì)胞外液單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物H057能夠明顯降低5-HT和NE的水平。

GABA能神經(jīng)系統(tǒng)和單胺能神經(jīng)系統(tǒng)之間有密切的投射，兩者相互抑制，共同維持睡眠和覺醒的平衡狀態(tài)。對于H057具體是如何升高GABA含量，降低5-HT和NE含量來發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用需要進(jìn)一步的探索。

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The sedative activity of H057 was investigated by recording the spontaneous locomotor activity in mice. The hypnotic property was evaluated by the latency and duration of loss of righting reflex（LORR）in mice and effect of H057 on the sleep onset in subthreshold dosage of sodium pentobarbital treated mice.The extracellular levels of GABA and monoamine neurotransmitters in in cerebral cortex were measured by microdialysis in vivo.ResultsThe spontaneous locomotor activity was decreased by 25%and 66%in H057（5，25 mg· kg-1，i.p.）treated mice，respectively.H057（3，5 mg·kg-1，i.p.）increased the sleep onset to 62.5% and 87.5%in subthreshold dosage of sodium pentobar-bital（25 mg·kg-1，i.p.）treated mice.H057（≥60 mg·kg-1，i.p.）could completely induce LORR in mice.The latency of LORR at dose of 60 mg·kg-1was（24±11）min and the duration of LORR was（96 ±15）min.In vivo mircodialysis revealed that H057 （25 mg·kg-1，i.p.）could significantly increase the GABA level by 26%and decrease the 5-HT and NE levels by 50%and 38%in cerebral cortex in mice. ConclusionH057 has potent sedative and hypnotic effects，which may be closely related to the increased content of GABA and the decreased contents of 5-HT and NE in the extracellular fluid in cerebral cortex.

Evaluation of the sedative and hypnotic effects of H057

WANG Xiao-chong，DONG Jing-wen，ZHAO Xiang-yu，WANG Yao，HU Wei，ZHANG Jian-jun
（Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanism and Pharmacological Evaluation Study，Institute of Materia Medica，
Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing100050，China）

AimTo investigate the sedative and hypnotic effects of a novel compound H057.Methods

sedative and hypnotic；locomotor activity；LORR；microdialysis；GABA；monoamine neurotransmitter

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.010

A

1001-1978（2016）05-0638-05

R-332；R322.81；R338.63；R916.4；R971.3

2016-02-16，

2016-03-19

國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No 2012ZX09301002001002）

王曉沖（1988-），男，碩士生，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail：wangxiaochong@imm.ac.cn；張建軍（1964-），女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：jjzhang@imm.ac.cn