曹洪玉　高凌星　唐　乾　蘇晉紅　鄭學仿,,,*(大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連66；大連大學環(huán)境與化學工程學院，遼寧大連66；大連大學，遼寧省生物有機化學重點實驗室，遼寧大連66)

紫外光誘導氧合型肌紅蛋白氧化反應及機理

曹洪玉1,3高凌星2唐乾1,3蘇晉紅2鄭學仿1,2,3,*
(1大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2大連大學環(huán)境與化學工程學院，遼寧大連116622；3大連大學，遼寧省生物有機化學重點實驗室，遼寧大連116622)

肌紅蛋白通常在無光條件下可進行輸氧、儲氧等重要功能，實驗中我們發(fā)現(xiàn)紫外光照射可促進氧合肌紅蛋白(MbO2)的氧化反應，證實其在光照時部分生理功能會發(fā)生變化。紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜數(shù)據(jù)顯示，光照射時MbO2的Soret帶最大吸收波長藍移、Q吸收帶544和580 nm處還原峰強度下降，說明紫外光光照促進O2解離，MbFe(II)可被氧化至MbFe(III)。四種波長光對光照氧化的影響程度為254 nm>280 nm> 430 nm>409 nm；通入CO氣體時氧合肌紅蛋白較難發(fā)生光照氧化反應，即Fe的第六配位強度影響反應程度；溶液中的H+或OH－對光照氧化反應有促進作用；254、280 nm波長光照射時，苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)三種游離氨基酸均促進光照氧化反應的進行，而409、430 nm波長光照射時三種游離氨基酸對光照氧化反應的影響較小。以上數(shù)據(jù)表明體內光誘導MbO2氧化反應過程中蛋白質內的Fe(II)能否被光照激發(fā)形成未成對電子處于激發(fā)態(tài)是O2離去和二價鐵被氧化的關鍵。

氧合肌紅蛋白；紫外光；游離氨基酸；光照氧化；光譜法

[Article]

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1引言

生物進程中，血紅素蛋白具有輸氧、儲氧或電子傳遞等重要的功能1,2，其結構及配體結合動力學過程成為當前研究重點3－6。血紅素輔基具有特殊的共軛和金屬配位結構，可吸收特定波長的光，改變血紅素電子激發(fā)態(tài)，并進一步影響蛋白功能，目前光照射血紅素類蛋白的研究也逐漸受到關注7－12。Mb在肌肉組織中扮演著重要的生理角色，如細胞內氧氣的供應，促進O2從細胞外圍到線粒體末端的運輸?shù)?3,14。Mb軸向配體的光解離反應動力學同樣引起了相當多的關注，Nollmann和Etchegoin15及Etchegoin等16曾分別用共振拉曼光譜和表面增強拉曼譜對光誘導的血紅蛋白的去氧進行了研究，F(xiàn)ranzen等17曾報道Mb激發(fā)態(tài)弛豫過程涉及兩個中間體MbI*和MbII*，MbI*是MLCT血紅素的激發(fā)態(tài)，MbII*是LMCT血紅素的激發(fā)態(tài)。熒光技術研究了光誘導肌紅蛋白去氧的過程，結果表明光照量增強時，去氧量增大，光照時溫度越高，去氧速率越快18，整個光解過程受到溫度、溶劑粘性、激發(fā)光強度和激發(fā)波長的影響19；利用紫外-可見光可以誘導高鐵肌紅蛋白、細胞色素C的還原反應20－22，反應會受試劑、pH值、溫度、時間、氣體、氨基酸等因素的影響23。但根據(jù)我們目前所查閱的文獻情況，肌紅蛋白紫外-可見光照射下可引發(fā)的氧化反應尚缺乏實驗報道和機理闡釋，體液中的游離氨基酸是否影響光照肌紅蛋白氧化還原反應？因此本實驗利用UV-Vis吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜(CD)方法研究了溶液中不同紫外定波長、pH值、氨基酸以及不同氣體等對光誘導氧化的影響，通過檢測血紅素中心鐵原子價態(tài)、蛋白構象的變化，來闡明MbO2光照氧化的潛在機制。

2　實驗部分

2.1試劑與儀器

儀器：紫外可見分光光度計(V-560，日本Jasco公司)，熒光分光光度計(FP-5600，日本Jasco公司)，圓二色分光光度計(J-810，日本Jasco公司)，制冷和加熱循環(huán)器(F-12，德國Julabo公司，實驗室pH計(PHSJ-4A，上海雷磁分析儀器廠)，實驗用光源為熒光分光光度計氙燈。

試劑：馬心肌紅蛋白樣品(購自美國Sigma公司)，UV-Vis吸收光譜特征表明全部為高鐵肌紅蛋白，將其溶解在pH=7.4的PB緩沖溶液(0.05 mol?L－1)中，用過量的連二亞硫酸(0.1 mol?L－1)將其還原，過量的連二亞硫酸鈉通過透析的方法除去，用紫外吸收法測定其濃度。酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸分別溶解在0.05 mol?L－1的PB緩沖溶液中配置成濃度均為0.01 mol?L－1的氨基酸溶液，實驗用水為去離子水。

2.2實驗方法

2.2.1UV-Vis吸收光譜

將已經(jīng)處理好的樣品置于1 cm石英比色池中進行測定，測定條件為：狹縫寬度為2 nm，掃描波長范圍為220－700 nm，掃描速率為200 nm?min－1，響應時間中等。

2.2.2CD光譜

將已經(jīng)處理好的樣品置于1 mm石英比色池中進行CD光譜測定，測定條件為：狹縫寬度1 nm，掃描波長范圍為190－50 nm，掃描速率為50 nm?min－1，響應時間為2 s，累計次數(shù)3次。

3　結果與討論

3.1MbO2的化學氧化與光照氧化

圖1A是MbO2的紫外-可見吸收光譜變化曲線，曲線a→f是氧化劑鐵氰化鉀對MbO2紫外-可見吸收光譜的影響，在MbO2溶液中加入鐵氰化鉀(MbO2與鐵氰化鉀的摩爾比為1.5:1)時，其Q帶544、580 nm處吸收峰消失，Soret帶416 nm處吸收峰藍移至409 nm處，505、630 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，即MbO2被完全氧化為氧化態(tài)。

通入恒定N2氣流、避光90 min后MbO2的特征吸收峰強度有輕微的變化(圖S1見Supporting Information)，但經(jīng)254 nm波長紫外光照射1.5 h后(圖1B)，隨著光照時間的增加，MbO2蛋白的Soret帶特征吸收416 nm處，吸收峰強度升高并藍移至409 nm處；Q帶544和580 nm處吸收峰強度有一定的降低，而在503和630 nm附近處出現(xiàn)兩個新峰，并且吸收峰強度逐漸增強，與未光照時相比發(fā)生了明顯的變化，說明氙燈254 nm光誘導的氧化反應與加入氧化劑鐵氰化鉀的效果相同。

圖1　氧化劑與氙燈光照對MbO2的紫外-可見吸收光譜的影響Fig.1　Effects of oxidizing agent and irradiation of xenon lamp on UV-Vis absorption spectra of MbO2(A)oxidizing agent potassium ferricyanide;(B)254 nm irradiation of xenon lamp. a→f:MbO2added potassium ferricyanide(0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.6)×10－8mol?L－1,respectively.

3.2光照氧化的波長選擇

為研究紫外波段光源照射MbO2的氧化情況，我們選用FP-6500型熒光光譜儀上氙燈的不同定波長來光照MbO2蛋白溶液。MbO2樣品在不同定波長(254，280，409和430 nm)氙燈光照后，其Soret帶416 nm處吸收峰強度增大并發(fā)生藍移，在Q帶544和580 nm處吸收峰強度降低，503和630 nm處吸收峰強度增強，隨著光照時間增加，503 nm處峰面積在不斷增大(見圖2)。在不同定波長的光照射下，Q帶的峰面積變化也不相同，其中在254 nm光照射下544和580 nm處吸收峰面積降低的趨勢最大，即氧化產(chǎn)物MbFe(III)最多。由于metMb三價鐵結合水的吸收峰在409 nm處，二價鐵離子還原態(tài)在430 nm處，且430 nm波長光為MbO2的最佳激發(fā)波長19，O2解離后五配位的二價鐵易于吸收430 nm波長光。由此可見，四種波長光對光照氧化的影響程度為254 nm>280 nm>430 nm> 409 nm。鐵卟啉可吸收上述四種波長的光，但吸收后，鐵卟啉被激發(fā)后所處的激發(fā)態(tài)不同，后期過程的能量轉移途徑不同，因此對氧化還原的影響程度不同，高能量的254和280 nm波長光使卟啉處于激發(fā)態(tài)，能量和電子在卟啉內轉移，會促使鐵氧化過程發(fā)生，雖然430和409 nm波長光處于卟啉的強吸收帶Soret帶，但由于吸收后電子轉移能力較差，鐵不易被氧化。

圖2　不同定波長氙燈光照射MbO2后吸收峰面積隨時間變化圖Fig.2　Peak area changes of MbO2irradiation with time by xenon lamp at different fixed wavelengths (A)area changes at 544 nm;(B)area changes at 580 nm;pH=7.4

3.3氨基酸對光照氧化的影響

芳香族游離氨基酸的紫外吸收在200－300 nm波長區(qū)域，為此我們選取300－650 nm光譜范圍來研究光照射時氧合肌紅蛋白的變化，從而排除游離氨基酸的光吸收對所測得MbO2光譜產(chǎn)生光譜疊加的干擾。避光條件下，游離氨基酸與MbO2作用1 h后的紫外-可見吸收光譜，相較于未加入氨基酸的MbO2，五條譜線完全重合(圖S3)，這表明未光照時游離的氨基酸與MbO2的化學反應基本不存在。在相同定波長光照射下，由于不同種類的游離氨基酸所含原子基團、表面電荷以及對光的選擇吸收的不同，會對MbO2的光誘導氧化產(chǎn)生不同影響。圖3(A,B)分別為254、280 nm波長光照射加入Trp、Tyr和Phe的MbO2的紫外-可見吸收光譜。254 nm波長光照射加入三種氨基酸的MbO2蛋白溶液1 h后，Soret帶416 nm處吸收峰藍移程度變大，Q帶544和580 nm處吸收峰強度下降十分明顯，且在Phe和Tyr存在下，MbFe(II)已被完全氧化為MbFe(III)；280 nm波長光照射時，加入Phe、Tyr和Trp的MbO2蛋白溶液，其MbFe(II)均已被完全氧化為MbFe(III)；而在409 nm(圖S4)、430 nm (圖S4)波長光照射時，氨基酸對光照氧化反應幾乎沒影響。在有色游離氨基酸存在時，254和280 nm波長光激發(fā)致使氧化程度增強可能有兩個途徑：途徑一是光激發(fā)有色氨基酸，氨基酸進行能量傳遞至鐵卟啉；途徑二是氨基酸被光激發(fā)后產(chǎn)生氨基酸自由基形式，進一步激發(fā)卟啉形成自由基。芳香族氨基酸在409、430 nm波長處無紫外吸收，在此波長光照射下氨基酸不被激發(fā)，因而對光照氧化反應進程無影響。氨基酸實驗也進一步證明，較低能量激發(fā)卟啉，卟啉自由基電子能量較低難以激發(fā)Fe的電子致激發(fā)態(tài)，F(xiàn)e(II)能否被光照激發(fā)形成未成對電子處于激發(fā)態(tài)是O2離去和二價鐵被氧化的關鍵。

圖3　加入不同氨基酸光照射MbO2后的紫外-可見吸收光譜Fig.3　UV-Vis absorption spectra of MbO2with different amino acids after irradiation (A)254 nm irradiation of xenon lamp; (B)280 nm irradiation of xenon lamp

3.4氣體、pH值對光照氧化過程的影響

處于還原態(tài)的MbO2蛋白溶液不穩(wěn)定，易被空氣中的氧化物緩慢氧化，CO可以與還原態(tài)肌紅蛋白結合，不與高鐵肌紅蛋白結合。圖4是不同氣體存在條件下光照引起MbO2氧化的結果，通入N2和O2均可促進光照氧化，且O2>N2>空氣。通入CO后，促使O2離去之后，不發(fā)生光照氧化反應，而是CO與空位Fe(II)發(fā)生配位反應20，使得Soret帶發(fā)生紅移，是因為Fe的第六配位強度影響反應程度，促使反應向配位反應進行，而不發(fā)生二價鐵的氧化反應。

圖4　不同氣體對光氧化MbO2的影響Fig.4　Effects of different gases on the photo oxidation of MbO2a→d:MbO2irradiated with 1 h were saturated with CO,none,N2,O2, respectively;254 nm irradiation of xenon lamp

metMb在低pH時是水合的，即aqua-形式，在pH 5.5→4.0時，蛋白質隨著pH值繼續(xù)降低，氨基酸基團質子化造成了血紅素結合位點的改變，并使蛋白質構象發(fā)生了巨大的改變24；但在pH達到9.0時溶液中氫氧根濃度足夠大，從而取代了原來血紅素中第六配位的水進行配位，即hydroxide-形式，pH值大于9.0時，肌紅蛋白還易形成二聚體，為此我們考查了pH值為5.5、6、7.4、8.0的緩沖溶液中MbO2光照氧化情況。MbO2蛋白溶液在恒定N2氣流下避光靜置1.5 h后(圖S2)，pH值為7.4、8.0時其特征吸收峰強度無變化，pH為6.0時其特征吸收峰強度相對于另外兩種pH值有微小變化，但總體來講避光條件下pH對MbO2蛋白溶液無影響。圖5為不同pH值下MbO2蛋白在254 nm波長氙燈照射下，544和580 nm處吸收峰面積隨照射時間變化圖。光照1.5 h后544和580 nm處吸收峰強度降低，pH為7.4時兩處吸收峰面積均比pH為5.5、6.0或8.0時下降程度小，說明偏酸、偏堿性條件均有利于光照氧化的發(fā)生。

3.5MbO2光照氧化二級結構的變化

蛋白質是由氨基酸通過肽鍵連接而成的具有特定結構的生物大分子，在蛋白質或多肽中，主要的光活性基團是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香族氨基酸殘基及二硫橋鍵。遠紫外區(qū)CD光譜反應肽鍵的圓二色性，因此，根據(jù)所測得蛋白質或多肽的遠紫外CD光譜，能反映出蛋白質或多肽鏈二級結構的信息25。如圖6A所示，在靠近192 nm有一正的譜帶，在222和208 nm處表現(xiàn)出兩個負的特征肩峰譜帶，這是典型的α-螺旋結構蛋白質的CD光譜特征。隨著光照時間增加，192 nm正吸收峰與208和222 nm處表現(xiàn)出的兩個負吸收峰的強度減小，但形狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯改變，這說明光照氧化MbO2引起其二級結構的變化。圖6B為加入氨基酸并光照1 h后的遠紫外CD光譜，MbO2的結構變化不是很大，和未加氨基酸光照1 h后的CD曲線基本重合，這說明在整個光照氧化過程中MbO2結構的改變是由光照引起的，而不是和氨基酸直接作用發(fā)生的，這也說明氨基酸在MbO2的光照氧化過程中是間接影響光照氧化的。

圖6　氙燈光照射MbO2的圓二色(CD)光譜圖Fig.6　Circular dichroism(CD)spectra of MbO2after irradiation of xenon lamp (A)irradiation by 254 nm xenon lamp;(B)added different amino acids with 254 nm irradiation. a→d:the irradiation time was 0,0.5,1,and 1.5 h,respectively.

3.6光誘導MbO2氧化反應機制

通過以上實驗數(shù)據(jù)分析我們可推出MbO2的光照氧化的可能機理，F(xiàn)e(II)的d電子組成為d6，未光照時，F(xiàn)e(II)電子組態(tài)處于強場，可以提供d軌道與O2的孤電子對形成配位鍵，以攜帶儲存氧氣；光照使鐵卟啉至激發(fā)態(tài)，F(xiàn)e(II)電子組態(tài)處于弱場，成對電子被激發(fā)后Fe上d軌道電子處于自旋多重態(tài)，F(xiàn)e電子占據(jù)鐵的空軌道，空軌道減少，配位鍵減弱，氧氣離去。處于多重態(tài)的五配位的Fe(II)電子轉移至卟啉，形成卟啉自由基，F(xiàn)e(II)被氧化為Fe(III)。通入CO后，F(xiàn)e(II)與CO配位能力較強，且CO因含有π鍵，F(xiàn)e被激發(fā)后的電子可能轉移到CO的LUMO軌道，因此CO較難離去，F(xiàn)e無法將電子轉移至卟啉，從而光照氧化還原反應難以進行，證實了步驟(I)的推測(如圖7所示)。

圖7　MbO2光誘導氧化機理Fig.7　Photo oxidation mechanism for MbO2

409和430 nm波長光照射氧化能力不如254和280 nm，說明409和430 nm波長光雖然是卟啉環(huán)Soret帶最大吸收峰波長，但卟啉吸收致激發(fā)態(tài)后總能量較低，難以使Fe(II)達到高自旋狀態(tài)，因而Fe(II)難以被氧化，而254和280 nm波長光被卟啉吸收后可以發(fā)生配體-金屬電荷轉移(LMCT)，使Fe至激發(fā)態(tài)。卟啉自由基不穩(wěn)定，進一步激發(fā)溶液中的H2O產(chǎn)生?H和OH－，在偏酸或偏堿性條件下，?H和OH－分別被溶液中的OH－和H+破壞，光照反應右移氧化程度增大，我們的pH實驗證實了此步驟機理(II)的推測(見圖7)。光照后蛋白質的二級結構也發(fā)生了變化，隨著光照氧化時間增加，MbFe(III)含量升高。這是因為MbFe(II)是六配位結構較為穩(wěn)定，蛋白α-螺旋含量較高，而MbFe(III)是五配位結構，F(xiàn)e與四個N原子不在同一平面上，光照致使卟啉環(huán)平面變化，進而影響了蛋白的二級結構，同時CD數(shù)據(jù)表明，MbO2蛋白溶液在光照氧化過程中并未變性，說明整個過程中蛋白三維結構將發(fā)生變化，協(xié)助O2離去、Fe被氧化過程，并適應以上過程中鐵卟啉的結構變化。

4　結論

通過光譜法研究光誘導氧合型肌紅蛋白的氧化反應，結果表明不同定波長、pH值以及氣體、游離有色氨基酸等外界因素對光氧化MbO2均有影響。254、280 nm波長光能量較高，照射較易激發(fā)鐵卟啉進而進行光照氧化過程，卟啉Soret帶最大吸收波長光被吸收后較難激發(fā)鐵卟啉；pH在偏酸性或偏堿性條件下均對MbO2的光照氧化較有利；加入游離有色氨基酸對光照氧化反應的影響程度取決于紫外光的波長；通入N2、O2均可促進光照氧化，通入CO后，不發(fā)生光照氧化反應，而是CO與Fe(II)發(fā)生配位反應，CO不易離去，致使光照氧化反應難以進行。通過CD光譜分析發(fā)現(xiàn)，光誘導促進MbO2氧化反應進行后，蛋白肽鏈伸展結構增加，色氨酸所處的微環(huán)境極性增加，α-螺旋含量降低，蛋白在結構上也適應光照氧化反應的過程。數(shù)據(jù)表明體內光誘導MbO2氧化反應過程中蛋白質內的Fe(II)能否被光照激發(fā)形成未成對電子處于激發(fā)態(tài)是O2離去和二價鐵被氧化的關鍵。以上實驗結果與方法將有助于深入的了解光照射對生物體內血紅素蛋白結構及功能的影響，在生理學和醫(yī)學上具有重要的價值。

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Mechanism of Oxymyoglobin Oxidation Reaction Induced by Ultraviolet Light

CAO Hong-Yu1,3GAO Ling-Xing2TANG Qian1,3SU Jin-Hong2ZHENG Xue-Fang1,2,3,*
(1College of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,Liaoning Province,P.R.China;2College of Environmental and Chemical Engineering,Dalian University,Dalian 116622,Liaoning Province,P.R.China;3Liaoning Key Laboratory of Bio-Organic Chemistry,Dalian University,Dalian 116622,Liaoning Province,P.R.China)

Myoglobin(Mb)achieves its biological functions such as oxygen transfer and storage in the dark. In this research,we found that UV light irradiation could promote oxidation of ferroporphyrin,which significantly affected the physiological function of oxymyoglobin(MbO2).The blue shift of the Soret band and decreased intensities of Q-band reduction peaks at 544 and 580 nm observed in UV-Vis absorption spectra revealed that UV light could promote O2dissociation,and consequently MbFe(II)was oxidized to MbFe(III).The effect sequence of wavelength on the strength of this photo-oxidation was 254 nm>280 nm>430 nm>409 nm.CO could inhibit the photo-oxidation process,indicating that the strength of the sixth coordination bond of Fe with a gas molecule influences the degree of photo-oxidation.The H+and OH－in the solution could also promote the photo-oxidation process.Irradiated by 254 and 280 nm light,free amino acids phenylalanine(Phe),tyrosine (Tyr),and tryptophan(Trp)promoted the light oxidation reaction.Meanwhile,irradiation with 409 and 430 nm light had less influence on the UV-light-induced oxidation reaction under the same conditions.The results illustrated that in photo-induced oxidation of MbO2,the formation of an excited state of Fe(II)with unpairedelectrons upon irradiation is crucial process for O2dissociation and Fe(II)oxidation.

November 9,2015;Revised:December 28,2015;Published on Web:January 4,2016.*Corresponding author.Email:dlxfzheng@126.com;Tel:+86-411-87402343. The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21571025,21271036)and Science&Technology Project Department of Education,Liaoning Province,China(L2013470,L2013471).

Oxymyoglobin;UV light;Free amino acid;Photo oxidation;Spectrometry

O641

10.3866/PKU.WHXB201601046

國家自然科學基金(21571025,21271036)和遼寧省教育廳科學技術研究項目(L2013470,L2013471)資助