黃曉松，羅銀利，于春艷，譚李紅，易艷輝

(1.湖南省腦科醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.江蘇省邳州市中醫(yī)院，江蘇 邳州 221300)

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論著

僵蠶天南星方對(duì)大鼠急性缺血性腦水腫MMP-2表達(dá)的影響

黃曉松1，羅銀利1，于春艷2，譚李紅1，易艷輝1

(1.湖南省腦科醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.江蘇省邳州市中醫(yī)院，江蘇 邳州 221300)

目的探討僵蠶天南星方對(duì)大鼠急性缺血性腦水腫基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。方法將SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、僵蠶天南星方組，除假手術(shù)組外，其他2組采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，采用免疫組織化學(xué)法、RT-PCR法觀察各組大鼠缺血2 h再灌注24 h、48 h、72 h、96 h大腦皮質(zhì)中MMP-2的表達(dá)情況。結(jié)果模型組及僵蠶天南星方組再灌注各時(shí)間點(diǎn)MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于假手術(shù)組(P均<0.05)，僵蠶天南星方組再灌注各時(shí)間點(diǎn)MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組(P均<0.05)；模型組再灌注各時(shí)間點(diǎn)MMP-2mRNA表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，僵蠶天南星方組再灌注各時(shí)間點(diǎn)MMP-2mRNA表達(dá)量明顯低于模型組(P均<0.05)。結(jié)論僵蠶天南星方可能通過(guò)抑制MMP-2的表達(dá)而減輕腦水腫，改善大鼠缺血性腦損傷。

僵蠶天南星方；腦缺血再灌注；腦水腫；基質(zhì)金屬蛋白酶

腦血管疾病嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康，其具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、高復(fù)發(fā)率、高額負(fù)擔(dān)等流行病學(xué)特點(diǎn)。腦水腫是缺血性腦血管病中基本病理變化之一，也是導(dǎo)致患者病情加重甚至引起死亡的主要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)是MMPs家族中重要成員，腦缺血過(guò)程中表達(dá)增高的MMP-2可降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致腦微血管結(jié)構(gòu)完整性和血腦屏障破壞，造成繼發(fā)性腦水腫和腦損傷。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)缺血性腦卒中的病機(jī)特點(diǎn)，研究僵蠶天南星方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)中MMP-2表達(dá)的影響，探討該方防治腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)材料SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠體質(zhì)量(286±3.79)g。MMP-2試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，批號(hào)：BA0569；PV-9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：K136907E)、濃縮型DAB試劑盒(批號(hào)：K132429A)購(gòu)自中杉金橋生物公司，EDTA組織抗原修復(fù)液購(gòu)自珠海市泉輝企業(yè)有限公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen，貨號(hào)：15596-026；DEPC處理水購(gòu)自上?；鶢栴D生，貨號(hào)：BYL40387；SYBRGreen PCR試劑盒購(gòu)自Thermo，貨號(hào)：F-415XL；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo，貨號(hào)：#K1622。僵蠶天南星方由僵蠶9 g、制天南星5 g組成，飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，熬制藥液濃度為0.35 g/mL。

1.2實(shí)驗(yàn)方法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和僵蠶天南星方組，每組48只。模型組和僵蠶天南星方組均采用Zea longa線栓改良法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。造模方法：大鼠于術(shù)前禁食12 h，自由飲水；用10%水合氯醛腹腔注射麻醉[1](用量=體質(zhì)量/100×0.35+0.1 mL)，大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，頸部常規(guī)備皮消毒，取頸正中稍偏右切口逐層切開(kāi)，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈近心端，用眼科剪于頸總動(dòng)脈結(jié)扎的遠(yuǎn)心端剪一小口導(dǎo)入栓線，將栓線(直徑0.26 mm或者0.28 mm，長(zhǎng)40 mm)從頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入(19±1.0)mm，用縫合線系住栓線，留置栓線于體外2 cm，確認(rèn)無(wú)活動(dòng)性出血后縫合皮膚，常規(guī)絡(luò)合碘消毒，術(shù)后2 h后抽出線栓。假手術(shù)組除不插入線栓外，其他步驟均同線栓法。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。術(shù)后大鼠清醒后，僵蠶天南星方組給予僵蠶天南星方1 mL/d灌胃，假手術(shù)組、模型組均給予生理鹽水1 mL/d灌胃。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1MMP-2陽(yáng)性表達(dá)情況采用免疫組化法檢測(cè)。每組分別于再灌注24 h、48 h、72 h、96 h各取6只大鼠麻醉后灌注取腦，在視交叉前后冠狀切取2 mm厚的腦組織進(jìn)行常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋、組織切片，片厚5 μm。切片做免疫組化，每只大鼠6張切片，每張切片取缺血灶周?chē)?個(gè)互不重疊的高倍鏡(×400)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡視野下的陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.3.2MMP-2 mRNA表達(dá)情況采用RT-PCR法檢測(cè)。每組中分別于再灌注24 h、48 h、72 h、96 h各取6只大鼠麻醉后斷頭取腦，冰上操作，去額極和枕極各2 mm，剝?nèi)∮覀?cè)大腦皮質(zhì)組織，-80 ℃冰箱保存，PCR測(cè)定操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)：①用Trizol抽提標(biāo)本腦組織和細(xì)胞中總RNA。②逆轉(zhuǎn)錄cDNA，將試劑盒從-80 ℃冰箱取出,復(fù)融，將5×逆轉(zhuǎn)錄buffer，dNTPs，MMLV，oligo(d T)10 000 r/min離心數(shù)秒，將經(jīng)過(guò)稀釋后的RNA樣本進(jìn)行RT，反應(yīng)條件：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，滅活MMLV。③Real-time PCR擴(kuò)增，將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，MMP-2引物：長(zhǎng)度為165 bps，上游：5’-ACCAAGAACTTCCGACTATCC-3’，下游：5’-CTGAGCAATGCCATCAAAGAC-3’；Gapdh引物：長(zhǎng)度為181 bps ，上游：5’-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游：5’-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3’；由基爾頓生物科技(上海)有限公司合成。MMP-2擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析。

2　結(jié)　　果

2.13組不同時(shí)點(diǎn)MMP-2陽(yáng)性表達(dá)情況模型組及僵蠶天南星方組梗死側(cè)MMP-2表達(dá)主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜中，均在24 h明顯增高，72 h達(dá)高峰，以后開(kāi)始下降，96 h仍高于假手術(shù)組。模型組及僵蠶天南星方組再灌注24 h、48 h、72 h、96 h MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯多于假手術(shù)組(P均<0.05)，僵蠶天南星方組各時(shí)點(diǎn)MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.23組不同時(shí)點(diǎn)MMP-2mRNA表達(dá)情況模型組再灌注24 h、48 h、72 h、96 h MMP-2mRNA表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，僵蠶天南星方組各間點(diǎn)MMP-2mRNA表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表1　3組不同時(shí)點(diǎn)MMP-2陽(yáng)性表達(dá)情況，個(gè))

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3　討　　論

腦水腫是指因腦組織中積聚過(guò)多的水所導(dǎo)致的病理性腦組織腫脹，是廣泛性腦損傷后的嚴(yán)重并發(fā)癥，腦水腫的形成與興奮性氨基酸的神經(jīng)毒作用、細(xì)胞膜鈉泵失調(diào)、自由基堆積、腦細(xì)胞膜磷脂代謝障礙及基質(zhì)金屬蛋白酶有關(guān)，主要有細(xì)胞毒性、血管源性、間質(zhì)性3種病理類(lèi)型，疾病早期以細(xì)胞毒性水腫為主，疾病后期亦包括血管源性水腫。有實(shí)驗(yàn)研究表明，腦缺血再灌注損傷引起腦水腫是導(dǎo)致神經(jīng)損傷的病理機(jī)制之一[2]。

表2　3組不同時(shí)點(diǎn)MMP-2mRNA表達(dá)情況

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

MMP-2是MMPs家族的成員，可使血腦屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)血管基膜和緊密連接破壞，導(dǎo)致BBB通透性增加，一方面有利于炎性細(xì)胞和炎性因子通過(guò)BBB，導(dǎo)致腦組織損傷；另一方面加重腦水腫[3]。有研究證實(shí)，MMP-2參與急性期腦水腫過(guò)程[4]。在腦缺血再灌注的早期，MMP-2被膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(Membrane-type Matrix Metalloproteinase,MT-MMP)激活，破壞緊密連接蛋白[5]，從而使循環(huán)中的重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)等物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)。向大鼠腦內(nèi)直接注射MMP-2，可以通過(guò)破壞腦毛細(xì)血管緊密連接和基底膜導(dǎo)致BBB的開(kāi)放，引起血管源性腦水腫[6]。梅利等[7]研究顯示，腦梗死的發(fā)生可能與MMP-2、IL-1β水平的增加有密切關(guān)系，二者協(xié)同作用加重了對(duì)血管壁的炎性損害，造成腦缺血再灌注損傷，并與患者神經(jīng)功能缺損程度相關(guān)。

急性缺血性腦血管病中醫(yī)稱(chēng)之為“中風(fēng)病”，以突發(fā)昏撲、不省人事、半身不遂、語(yǔ)言謇澀或失語(yǔ)、口舌歪斜、偏身麻木等為主要臨床表現(xiàn)，因其發(fā)病特點(diǎn)與風(fēng)邪善行數(shù)變的特性有相似之處，故古代稱(chēng)其為“中風(fēng)”。痰瘀是中風(fēng)病的主要發(fā)病機(jī)制，始終存在于整個(gè)病程，在中風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸中起重要作用。因此，在中風(fēng)的治療過(guò)程中，化痰祛瘀至關(guān)重要。僵蠶天南星方中僵蠶味辛行散，能祛風(fēng)、化痰、通絡(luò)，天南星味苦辛性溫，走經(jīng)絡(luò)，善祛風(fēng)痰，兩藥合用，共奏化痰通絡(luò)之效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，僵蠶具有抑菌、抗驚厥、抗凝等作用[8]，天南星具有抗驚厥、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、祛痰、抗氧化、殺滅釘螺、抗菌和抗炎等多種藥理活性[9-12]。

本研究結(jié)果顯示，模型組及僵蠶天南星方組梗死側(cè)MMP-2表達(dá)主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜中，均在24 h明顯增高，72 h達(dá)高峰，以后開(kāi)始下降，96 h仍高于假手術(shù)組，和腦水腫的進(jìn)程一致。采用免疫組化法及RT-PCR法檢測(cè)MMP-2表達(dá)，結(jié)果顯示僵蠶天南星方組再灌注各時(shí)間點(diǎn)MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組，MMP-2 mRNA表達(dá)量明顯低于模型組。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，僵蠶天南星方可減輕腦缺血再灌注損傷后腦水腫的神經(jīng)功能損傷[13]，綜合本研究結(jié)果，僵蠶天南星方減輕缺血性腦水腫的作用機(jī)制可能與降低MMP-2的表達(dá)有關(guān)。

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Effects of Silkworm Arisaema decoction on the expression of Matrix Metalloproteinase 2 in rats with acute ischemic brain edema

HUANG Xiaosong1,LUO Yinli1,YU Chunyan2,TAN Lihong1,YI Yanhui1

(1.The Brain Hospital of Hunan Province,Changsha 410007,Hunan,China;2.Xuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xuzhou 221300,Jiangsu,China)

Objective It is to observe Silkworm Arisaema Decoction on the expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) in rats with acute ischemic brain edema and to explore its effect mechanism.Methods The male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: the sham-operation group,the model group,the Silkworm Arisaema Decoction treatment group.The model of right middle cerebral artery occlusion was established by thread ligation method.The Sprague-Dawley rats received occlusion of the right middle cerebral artery for 2 h,and then reperfusion was made for 24 h,48 h,72 h,96 h respectively.The expressions of MMP-2 were evaluated by immunohistochemistry and real-time PCR at different time points.Results The expression of MMP-2 at four different time points in the model group and the Silkworm Arisaema Decoction group were significantly higher than that of the sham group(P<0.01).Compared with the model group,the expression of MMP-2 in the Silkworm Arisaema Decoction group at each time point were significantly reduced (P<0.01).The expression of MMP-2 mRNA at four different time points in the model group was significantly higher than that of the sham group(P<0.01).The expression of MMP-2 mRNA at four different time points in the Silkworm Arisaema Decoction group was less than that of the model group(P<0.01).Conclusion Silkworm Arisaema Decoction can improve brain tissue damage and reduce brain edema in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury,the mechanism might be associated with reducing the expression of MMP-2.

Silkworm Arisaema Decoction; cerebral ischemia reperfusion; brain edema; MMP-2

黃曉松，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病的研究。

譚李紅，E-mail：tanlihong118@163.com

湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)資助項(xiàng)目(201329)；湖南省中醫(yī)藥管理局一般資助項(xiàng)目(2013126)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.16.001

R-335

A

1008-8849(2016)16-1711-03

2015-12-31