鄧子龍，劉蔚東（中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

臨床論著

EGFR、PDGFRA和VEGFR2在結腸癌中的表達及變異分析

鄧子龍，劉蔚東
（中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

目的探討受體酪氨酸激酶表皮生長因子受體（EGFR），血小板源性生長因子受體α多肽（PDGFR A）和血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR 2）在30例結腸癌中的過表達及基因突變情況。方法收集該院確診為結腸癌的30例組織標本，免疫組織化學檢測組織標本中EGFR，PDGFR A和VEGFR 2表達情況，PCR-SSCP檢測標本中EGFR（外顯子18-21）和PDGFR A（外顯子12、14和18）的基因突變情況。 結果收集該院確診為結腸癌的30例組織標本，免疫組織化學顯示EGFR的陽性表達率為43.3%（13/30），但是EGFR熱點區(qū)域（外顯子18-21）未檢測到激活突變。而在17例患者（56.7%）中檢測到EGFR外顯子20的密碼子787（Q787Q）的一處無義堿基替換（CAG>CAA）。PDGFR A在所有惡性細胞中陽性表達，熱點區(qū)域也未發(fā)現(xiàn)激活突變，但是9例標本中的12號外顯子的密碼子567發(fā)生CCA>CCG無義突變；4例標本中的18號外顯子的密碼子824發(fā)生GTC>GTT無義突變。在2例標本中還發(fā)現(xiàn)，14號內含子有兩處堿基改變IVS14+3G>A 和IVS14+49G>A，4例標本中的18號內含子存在IVS18-50insA改變。有22例（73.3%）中VEGFR 2陽性表達，且VEGFR 2表達與腫瘤未轉移呈正相關（P=0.038）。結論結腸癌中雖然EGFR和PDGFR A過表達，但是未檢測到激活突變，而VEGR 2也在結腸癌中過表達，其表達與腫瘤未發(fā)生轉移有關。本研究結果為未來結腸癌治療提供可能的方向。

表皮生長因子受體；血小板源性生長因子受體α多肽；血管內皮細胞生長因子受體2；結腸癌

結腸癌是人類最常見的惡性消化道腫瘤，全球每年有超過100萬新增確診結腸癌病例，是世界上引起死亡的主要癌癥之一[1]。結腸癌是正常結腸上皮惡性轉化為腺瘤性息肉的結果[2]。盡管結腸癌被大多數(shù)發(fā)達國家列入早期腫瘤篩查項目，結腸癌治療方法取得長足進步，但是結腸癌仍然是女性因癌癥死亡的第2大原因，男性因癌癥死亡的第3大原因[3]。根據(jù)目前的治療條件，早期根治性手術切除仍是結腸癌最有效的治療方法。然而，晚期結腸癌患者可供選擇的治療方法并不多，且療效都不理想。因此，結腸癌早期診斷十分必要。目前，廣泛使用的結腸癌分類系統(tǒng)是國際抗癌聯(lián)盟（The International Union against Cancer，UICC）分期標準，該系統(tǒng)是基于臨床病理特征，如腫瘤大小、淋巴結轉移及器官轉移等情況進行分類。然而，由于結腸癌患者具有異質性，UICC分期標準并不能夠準確預測結腸癌患者臨床結局。結腸癌患者臨床表現(xiàn)各不相同，即使處于相同階段的結腸癌結局也可能大不相同。因此，通過更好地闡述結腸癌分子基礎識別結腸癌特異性生物標志物和治療靶點將有助于開發(fā)結腸癌新的治療手段。

有絲分裂信號機制的分布，尤其是受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs）信號是腫瘤進展的標志性事件，目前RTKs已成為靶向治療的主要靶點[4]。RTKs是跨膜蛋白，由細胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域、近膜區(qū)域和細胞內區(qū)域等組成，而兩個激酶區(qū)定位于細胞內區(qū)域。當RTKs與生長因子結合、受體二聚化和自我磷酸化時，位于細胞內區(qū)域的酪氨酸殘基激活MAPK、PI3K、JAK/STAT等信號通路途徑，從而影響細胞內基因表達。在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，RTKs通常表達下調，并且通過過度磷酸化維持信號傳導通路在激活狀態(tài)，導致腫瘤生長、進展、增殖、去分化、凋亡抑制、轉移和血管生成[5-6]。

在不同種類的RTK中，Ⅰ類[如酪氨酸激酶表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）]和Ⅲ類[如血小板源性生長因子受體α多肽（platelet-derivedgrowthfactorreceptoralpha，PDGFRA）、KIT、血管內皮細胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）等]被證實參與器質性腫瘤形成過程[7]。EGFR是首個被證實與人類腫瘤有關的RTK，EGFR拮抗劑已成為癌癥治療的新希望，EGFR拮抗劑主要分為兩類，一類是針對胞外區(qū)域的單克隆抗體，如西妥昔單抗；另一類是小分子酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）等[8]。近年來，小分子改變已被證實與患者對新研發(fā)的抗EGFR藥物的響應率有關，尤其是EGFR胞內激酶區(qū)域（外顯子18-21）熱點區(qū)的EGFR突變是吉非替尼和厄洛替尼治療肺癌有效性的重要預測因子。有臨床研究報道，伊馬替尼等KIT和PDGFRA抑制劑在胃腸道基質腫瘤治療中取得了良好效果[9]。與抗EGFR藥物類似的是，KIT和PDGFRA基因的特異性激活基因突變與患者對伊馬替尼響應率有關。除了這些選擇性抑制劑，多靶點抑制劑在腫瘤治療中也取得了重要突破，如靶向抑制KIT、PDGFR和VEGFR2的舒尼替尼（Sunitinib）；靶向KIT、VEGFR2、PDGFR和BRAF等細胞內酪氨酸激酶的索拉菲尼；靶向KIT、PDGFR 和VEGFR的帕唑帕尼等。VEGFR2不但是促有絲分裂因子，也是重要的血管生成因子，因此阻斷VEGFR2活性在腫瘤治療中具有重大價值。近來有研究報道，結腸癌中未見KIT分子變異，并發(fā)現(xiàn)小部分病例中KIT通過KIT/SCF共表達激活[10]。本文的實驗主要研究結腸癌中EGFR、PDGFRA和VEGFR2等RTKs的過表達和激活基因突變等表達變異情況，并評估RTKs在結腸癌治療中的作用價值。

1　材料與方法

1.1研究對象

選取2001年1月-2012年12月于中南大學湘雅醫(yī)院就診并經(jīng)病理確診為結腸癌的30例病理和隨訪資料完整的患者納入本次研究。其中，男性17例，女性13例；年齡24～77歲，平均（49±44.7）歲，12例患者伴淋巴結轉移，2例患者疾病復發(fā)。評價隨訪時間為24個月。

1.2EGFR、PDGFRA和VEGFR2免疫組織化學檢測

免疫組織化學染色采用二步法染色（SP法），具體操作按說明書一、二抗雜交，最后經(jīng)DAB顯色，逐級脫水、透明、封片。

1.3腫瘤組織DNA準備

按照試劑盒說明提取結腸癌組織中的基因組DNA，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4EGFR與PDGFRA基因突變檢測

采用下述引物聚合酶鏈反應擴增EGFR基因外顯子18-21和PDGFRA基因外顯子12、14和18，EGFR正向引物：5'-GGTACTGGTGGAGTATGATAG -3'，反向引物：5'-TGGTCCTGCACCAGTAATATG-3'；PDGFRA正向引物：5'-CTCTFCATAATGCTTGCTCT GATAGC-3'，反向引物：5'-GTGGAAAAATAGCCTCA ATTC-3'，擴增產(chǎn)物長度分別為248bp和211bp。反應條件為：初始變性94℃、5 min；94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、20 s，45個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃結束反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳確定后，用ABI公司的3730XL測序儀進行序列分析。應用Chromas軟件在信噪比>98%的條件下判斷基因突變情況。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，計數(shù)資料以率表示，兩兩組間用χ2檢驗和均數(shù)t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1EGFR表達特征

免疫組織化學分析表明，EGFR的陽性（2+/3+）表達率約為43.3%（13/30）（見圖1）。本實驗還通過突變分析探討EGFR過表達的可能分子基礎，結果顯示EGFR基因的“熱點區(qū)”（內含子18-21）中無突變，但是在17例（56.7%）患者第20號內含子的787號密碼子中檢測到沉默堿基替換（CAG>CAA）。EGFR基因變化和臨床病理參數(shù)無相關性。

2.2PDGFRA表達特征

免疫組織化學結果表明，30例結腸癌中21例PDGFRA強陽性表達（3+），6例中等陽性表達（2+），3例陽性表達（+），所有病例都呈陽性表達（見圖2）。PDGFRA陽性表達于腫瘤細胞漿和內皮細胞及成纖維細胞等基質成分。

本研究同樣對30例結腸癌中PDGFRA的熱點外顯子12、14和18進行突變分析，結果同樣未發(fā)現(xiàn)PDGFRA的激活突變。然而本研究發(fā)現(xiàn)，PDGFRA中存在沉默突變，在9例患者中發(fā)現(xiàn)PDGFRA12號外顯子第567號密碼子中的堿基替換（CCA>CCG）；還在4例患者中發(fā)現(xiàn)PDGFRA18外顯子第824號密碼子中的堿基替換（GTC>GTT）。此外，在2個不同病例中發(fā)現(xiàn)14號內含子堿基替換（IVS14+3G>A和IVS14+49G>A）（見圖3），在4個病例中發(fā)現(xiàn)了18號內含子（IVS18-50insA）堿基替換（見附表）。由于所有病例中PDGFRA表達均為陽性，因此PDGFRA表達與病理參數(shù)之間的相關性無法進行分析。

2.3VEGFR2表達特征

免疫組織化學結果檢查VEGFR2的陽性表達率為73.3%（22/30），6例為中等陽性表達（2+），16例為強陽性表達（3+），VEGFR2陽性表達主要定位于惡性細胞細胞漿?；|中未發(fā)現(xiàn)VEGFR2陽性表達，但是在少數(shù)腫瘤細胞周圍的內皮細胞弱陽性表達（見圖4）。VEGFR2表達與臨床病理參數(shù)表明VEGFR2過表達與腫瘤不發(fā)生轉移呈正相關（P=0.038）。

圖1　免疫組織化學檢測EGFR在結腸癌中的表達 （×40）

圖2　免疫組織化學檢測PDGFRA在結腸癌中的表達 （×40）

圖3　PDGFRA序列部分電泳圖譜

附表　結腸癌中EGFR和PDGFRA基因突變類型分析

圖4　免疫組織化學檢測VEGFR2在結腸癌中的表達 （×40）

3　討論

隨著人們對腫瘤細胞中分子改變事件認識的不斷加深，使得有效靶向治療腫瘤的新藥物層出不窮。EGFR、PDGFR和VEGFR2等分子在腫瘤增殖和血管生成中發(fā)揮重要，是腫瘤治療的潛在靶點。本研究結果可用于識別這些治療靶點的分子改變，而這些治療靶點能夠預測結腸癌對選擇性抑制劑治療的陽性反應率。

EGFR過表達在結腸癌中發(fā)生頻率較高，頻率范圍一般在25%～70%間[11]。本研究和以往其他研究結果顯示，EGFR在33%～43%的結腸癌中過表達[12]。盡管存在EGFR過表達，本文的實驗并未發(fā)現(xiàn)結腸癌中有EGFR激活基因突變，但是在17例標本中（56%）發(fā)現(xiàn)EGFR第20號內含子中的787號密碼子中有沉默堿基替換（CAG>CAA）。這一多態(tài)性被稱為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），EGFR的SNP具有人種差異，在亞洲和非裔美國人群中G等位基因發(fā)生頻率更高，而歐洲人種中A等位基因發(fā)生頻率更高（rs1050171，NCBI SNP數(shù)據(jù)庫），NP在EGFR功能中的作用目前仍不清楚。Taguchi等[13]在不同基因表達型頭頸部鱗狀細胞癌細胞株中未發(fā)現(xiàn)EGFR mRNA和蛋白表達水平有變化，但是其研究發(fā)現(xiàn)G/A雜合基因型細胞株對吉非替尼的敏感性明顯高于G/G純合基因型頭頸部鱗狀細胞癌細胞株。Arias-Pulido等[14]近來在89例宮頸癌（75例鱗狀細胞癌、9例腺癌及5例腺鱗癌）中研究也未發(fā)現(xiàn)EGFR激活突變，EGFR在腺鱗癌中過表達機制仍有待進一步研究。以往研究還發(fā)現(xiàn)EGFR能夠被EGFR基因擴增或HPV E5和E6 等HPV癌基因蛋白調控，HPV E5和E6通過抑制EGFR內吞和降解使EGFR表達水平升高[15]。有臨床實驗評價了抗EGFR治療對進展期結腸癌的效果，該研究目前正在進行西妥昔單抗單獨或聯(lián)合放療治療復發(fā)性或早期結腸癌。一項30例局部復發(fā)進展期或轉移性結腸癌患者參與的多中心Ⅱ期臨床實驗發(fā)現(xiàn)基于吉非替尼治療后，患者無客觀反應率，且1/ 5的患者疾病穩(wěn)定進展，該研究結果提示藥物腫瘤響應率與EGFR免疫組織化學檢測的表達結果無關[16]。該結論并不出乎研究者們的意料，因為某些腫瘤患者，特別是肺癌患者，與顯著臨床響應有關的參數(shù)并不是EGFR免疫活性，而是EGFR酪氨酸激酶激活突變。本研究顯示結腸癌中沒有EGFR激活突變情況，因此筆者推測厄洛替尼和吉非替尼單獨使用的藥效性較低。

目前，有關PDGFRA在結腸癌發(fā)生過程中作用的研究較少。Estevez-Garcia等[17]分析36例結腸癌組織中PDGFRA的表達情況，結果表明PDGFRA在腫瘤細胞中的過表達率為42%，而在基質細胞中的過表達率僅為8%。Bernal-Sprekelsen等[18]最近的一項研究中發(fā)現(xiàn)PDGFRA幾乎全部表達于結腸癌的基質，而在腫瘤新生細胞中較少表達。本研究顯示結腸癌中，PDGFRA主要過表達于腫瘤基質或者新生腫瘤細胞中。造成該結果的原因可能是研究小組間使用的抗體不一致或者分析的標本組織學亞型不一致。本研究顯示不管是否存在基因變異，結腸癌中未檢測到PDGFRA的激活突變，這些基因變異絕大部分屬于基因變異。本研究結果與Estevez-Garcia 等[17]在36例結腸癌中的研究結果一致。然而，最近在大鼠模型和結腸癌腫瘤標本中的前臨床研究顯示基于伊馬替尼的治療對宮頸癌有一定療效。

VEGFR2廣泛分布于人類疾病和腫瘤中。以往研究認為VEGFR2主要分布于激活的內皮細胞，但是近來免疫組織化學研究發(fā)現(xiàn)VEGFR2也分布于腫瘤細胞中，磷酸化VEGFR2易位至腫瘤細胞核是腫瘤發(fā)展過程中常見事件，這可能與腫瘤中存在自分泌VEGF/VEGFR2環(huán)有關。Shen等[19]研究顯示VEGFR2是前癌干細胞（precancerous stem cell，pC-SCs）標志物。本文實驗顯示VEGFR2在大約2/3的結腸癌中陽性表達，但是VEGFR2過表達與腫瘤未發(fā)生轉移相關，該結果提示結腸癌中還存在其他促進轉移的分子，如本研究發(fā)現(xiàn)的那樣VEGFR2在腫瘤細胞漿中過表達。目前，對結腸癌患者采用抗VEGFR2藥物治療已在進行臨床實驗，其中索拉菲尼和放療及順鉑聯(lián)合治療正在進行Ⅰ、Ⅱ臨床評估。研究認為，同時抑制多種受體酪氨酸激酶能夠優(yōu)化分子靶向抑癌藥物相關的總療效。目前，帕唑帕尼和拉帕替尼聯(lián)合或單獨治療轉移結腸癌的療效和安全性正在進行臨床研究，拉帕替尼是EGFR和HER2的雙重酪氨酸激酶及抑制[20]。

總之，本研究全面分析結腸癌中 EGFR、PDGFRA和VEGFR2等癌基因蛋白的表達和變異情況，結果表明結腸癌中雖然EGFR和PDGFRA過表達，但是未檢測到激活突變，而VEGR2也在結腸癌中過表達，其表達與腫瘤未發(fā)生轉移有關。本研究結果為未來結腸癌治療提供了可能的方向。

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（張蕾編輯）

Molecular characterization of EGFR，PDGFRA and VEGFR2 in colon cancer

Zi-long Deng，Wei-dong Liu
（Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，China）

Objective To investigate EGFR，PDGFRA and VEGFR2 RTKs overexpression and activating gene mutations in a cohort of 30 colon cancer patients sample.Methods EGFR，PDGFRA and VEGFR2 immunohistochemistry was performed in all samples，followed by DNA isolation from the gross macroscopically dissection of the neoplastic area.Screening for EGFR（exons18-21）and PDGFRA（exons12，14 and 18）mutations was done by PCR-single-strand conformational polymorphism（PCR-SSCP）.Results Despite the presence of EGFR immunohistochemical positive reactions in 43%（13/30）of the samples，no EGFR activating mutations in the hotspot region（exons18-21）were identified.A silent base substitution（CAG＞CAA）in EGFR exon 20 at codon 787（Q787Q）was found in 17 cases（56%）.All PDGFRA immunohistochemical reactions were positive and consistently observed in the stromal component，staining fibroblasts and endothelial cells，as well as in the cytoplasm of malignant cells.No activating PDGFRA mutations were found，yet，several silent mutations were observed，such as a base substitution in exon 12 （CCA＞CCG）at codon 567（P567P）in 9 cases and in exon18（GTC＞GTT）at codon 824（V824V）in 4 cases.We also observed the presence of base substitutions in intron 14（IVS14+3G＞A and IVS14+49G＞A）in two different cases，and in intron 18（IVS18-50 insA）in 4 cases.VEGFR2 positivity was observed in 22 of 30 cases（73.3%），and was significantly associated with lack of metastasis（P=0.038）.Conclusions Despite the absence of EGFR and PDGFRA activating mutations，the presence of overexpression of these three important therapeutic targets in a subset of cases may be important in predicting the sensitivity of colon cancer to specific anti-RTKs drugs.

EGFR；PDGFRA；VEGFR2；colon cancer

R 735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.005

1005-8982（2016）04-0024-05

2015-08-26