于德財(cái)，苗　龍，楊文文，張　娟，尹立紅，浦躍樸

GJB2基因多態(tài)性與漢族人群職業(yè)噪聲性聽(tīng)力損失相關(guān)性的研究

于德財(cái)，苗龍，楊文文，張娟，尹立紅，浦躍樸*

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009）

目的： 探討縫隙連接蛋白beta2(GJB2)基因rs2274083、rs2274084和rs72474224位點(diǎn)多態(tài)性與漢族人群職業(yè)噪聲性聽(tīng)力損失易感性之間的關(guān)系。方法：應(yīng)用1∶1病例-對(duì)照研究，病例組177例為電測(cè)聽(tīng)結(jié)果雙耳高頻平均聽(tīng)閾≥40 dB的在崗工人，對(duì)照組177例為年齡、性別、作業(yè)工齡與病例組相匹配，并且電測(cè)聽(tīng)結(jié)果雙耳高頻平均聽(tīng)閾＜25 dB的同崗位輪班工人。采用PCR擴(kuò)增177對(duì)樣本目的基因片段，對(duì)目的基因片段進(jìn)行測(cè)序，確定待研究位點(diǎn)的基因型。結(jié)果：GJB2基因的rs2274084位點(diǎn)C、T等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中分布分別為73.73%、26.27% 和63.84%、36.16%，其中CC、TC、TT基因型在病例組和對(duì)照組中的分布分別為55.37%、36.72%、7.91%和40.11%、47.46%、12.43%。該位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率在病例與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。rs2274083和rs72474224位點(diǎn)基因型分布在病例與對(duì)照組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論：GJB2 rs2274084可能是漢族人群職業(yè)噪聲性聽(tīng)力損失的易感基因位點(diǎn)，攜帶C等位基因的工人，暴露職業(yè)噪聲時(shí)更易發(fā)生聽(tīng)力損失。

噪聲性耳聾；多態(tài)性；易感基因；縫隙連接蛋白beta2

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate whether any of the three polymorphisms (rs2274083，rs2274084，rs72474224) of GJB2 are associated with susceptibility to occupational noise-induced hearing loss in Chinese Han population. METHODS：A 1∶1 case-control study was conducted using 177 cases with average hearing threshold of no less than 40 dB in high frequency and 177 controls with average hearing threshold of less than 25 dB in high frequency. Controls were matched with cases according to gender，age，duration of noise exposure and working positions. The genotypes were sequenced after polymerase chain reaction. RESULTS：There was statistically significant differences in the distribution of genotypes and alleles frequencies of rs2274084 between cases and controls. The rs2274084 C and T allele frequencies in cases and controls were 73.73%，26.27% and 63.84%，36.16%. The CC genotypes，TC genotypes，TT genotypes in cases and controls were 55.37%，36.72%，7.91% and 40.11%，47.46%，12.43% respectively. There was no statistically significant difference in the distribution of genotypes of rs2274083 and rs7274224 between cases and controls. CONCLUSION：The data suggest that GJB2 rs2274084 might be the susceptibility gene locus of noise-induced hearing loss in Chinese workers. In addition，workers with the C genotype in rs2274084 might be susceptible to noise-induced hearing loss.

【KEY WORDS】noise-induced deafness；polymorphism；susceptibility gene；gap junction protein beta 2

職業(yè)性噪聲聽(tīng)力損失(noise-induced hearing loss，NIHL)是全球范圍內(nèi)最嚴(yán)重的職業(yè)危害之一，職業(yè)性噪聲聽(tīng)力損失占到全球范圍內(nèi)成人聽(tīng)力損失的16%，僅次于老年性耳聾，其中發(fā)展中國(guó)家明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家[1]。在相同的噪聲環(huán)境暴露相同時(shí)間的人群，僅有部分人發(fā)生聽(tīng)力損失，并且發(fā)生聽(tīng)力損失嚴(yán)重程度不同，提示噪聲性聽(tīng)力損失存在個(gè)體易感性[2]。

目前關(guān)于噪聲性聽(tīng)力損失易感基因的研究主要包括氧化應(yīng)激類(lèi)基因、鉀離子循環(huán)通道基因、單基因性耳聾基因[3]。已經(jīng)確認(rèn)的耳聾相關(guān)基因有鈣黏蛋白23基因(CDH23)、質(zhì)膜Ca2+-ATP酶2基因(PMCA2)、氧化性應(yīng)激基因家族(GSTT1、GSTM1、GSTP1、SOD1、SOD2、CAT等)、鉀離子循環(huán)有關(guān)基因(KCNQ4、KCNE1等)、熱休克蛋白70基因(HSP70)等[3]。

縫隙連接蛋白beta2(gap junction protein beta 2，GJB2)基因是近年來(lái)聽(tīng)力損失相關(guān)研究的熱點(diǎn)基因[4-6]。GJB2基因參與內(nèi)耳鉀離子循環(huán)，對(duì)于維持內(nèi)耳離子穩(wěn)態(tài)平衡起著重要作用，如果鉀離子通道及相關(guān)協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生改變，可以導(dǎo)致內(nèi)耳鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制紊亂進(jìn)而出現(xiàn)聽(tīng)力損傷[7-9]。本課題組已跟蹤研究GJB2 rs3751385多態(tài)性與噪聲性聽(tīng)力損失的相關(guān)關(guān)系，研究結(jié)果顯示，GJB2 rs3751385位點(diǎn)多態(tài)性與漢族人群噪聲性聽(tīng)力損失存在相關(guān)性[10]。rs3751385位點(diǎn)位于啟動(dòng)子區(qū)域，可能通過(guò)調(diào)控GJB2基因的表達(dá)來(lái)影響聽(tīng)力。本次研究擴(kuò)大樣本后選擇了位于GJB2基因編碼區(qū)域的多態(tài)位點(diǎn)rs2274083、rs2274084和rs72474224進(jìn)行研究，其中rs72474224與噪聲性聽(tīng)力損失的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，故本研究旨在探討此3個(gè)亞洲人特有的多態(tài)性及其與漢族人群噪聲性聽(tīng)力損失之間的相關(guān)關(guān)系。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

以統(tǒng)一的納入標(biāo)準(zhǔn)選擇某汽車(chē)制造企業(yè)和某軌道交通車(chē)輛廠的噪聲暴露工人作為研究對(duì)象。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)為：漢族在崗接噪工人，無(wú)中耳炎、顱腦損傷等既往病史，無(wú)耳毒性藥物服用史，無(wú)家族性耳聾史及爆震性耳聾史。依據(jù)《GBZ 49-2007 職業(yè)性聽(tīng)力損失診斷標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)職業(yè)性聽(tīng)力損失進(jìn)行診斷，雙耳高頻(3 000、4 000、6 000 Hz)平均聽(tīng)閾≥40 dB的工人作為病例組，對(duì)照組選擇與病例組相同作業(yè)崗位，雙耳高頻平均聽(tīng)閾值＜25 dB的工人，按相同性別、相似年齡(±5歲)、相似接噪工齡(±3 a)進(jìn)行1∶1配對(duì)。符合標(biāo)準(zhǔn)的研究病例是177例，對(duì)照177例。

1.2基因分型

提取研究對(duì)象的外周血2 mL，用紅細(xì)胞裂解法提取白細(xì)胞，-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用天根DNA提取試劑盒提取白細(xì)胞中DNA。提取的DNA利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度。選擇D(260)/D(280)在1.8～2.0之間的樣本進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

由于3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在基因上的位置比較接近，所以對(duì)樣本目的多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：上游引物，5′-AAGCCGTCGTACATGACAT AGA-3′；下游引物，5′-CCCAGAGTAGAAGATGGATT G-3′。擴(kuò)增體系為25 μL：DNA模板30 ng，PCR buffer緩沖液(含Mg2+)4 μL，脫氧核糖核苷酸(dNTPs)1.6 μL，正反引物各0.4 μL(10 μmol/L)，DNA聚合酶0.2 μL (1U)，無(wú)酶水補(bǔ)齊。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。最后72 ℃繼續(xù)延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，對(duì)擴(kuò)增成功的樣品，送金開(kāi)瑞公司測(cè)序，確定目的位點(diǎn)的基因型。

1.3數(shù)據(jù)分析

SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析的前提是基因型數(shù)據(jù)符合Hardy-Weinberg平衡，如果不平衡，說(shuō)明樣本選擇不具有代表性，不能用于后續(xù)分析。本研究在統(tǒng)計(jì)分析之前對(duì)基因型頻率分布進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，對(duì)3個(gè)位點(diǎn)的各基因型和等位基因在病例組和對(duì)照組中的分布頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。使用Logistic回歸分析，計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)基因型的OR值，分析不同基因型患噪聲性聽(tīng)力損失的危險(xiǎn)度，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1樣本一般人口學(xué)特征

按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)篩選，一共納入研究對(duì)象177對(duì)，其中男性173對(duì)，女性4對(duì)，方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組樣本來(lái)自同一總體。病例組的年齡分布為(41.68±8.94)歲，對(duì)照組的年齡分布為(41.89± 8.54)歲，年齡分布在兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。病例組的接噪工齡分布為(17.51±11.05) a，對(duì)照組的接噪工齡分布為(18.32±10.32) a，接噪工齡分布在兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2GJB2基因型測(cè)序

GJB2基因采用正向測(cè)序，rs2274083位點(diǎn)基因型包括突變純合型CC(A1)，突變雜合型TC(A2)和野生型TT(A3)。rs2274084位點(diǎn)基因型包括突變純合型TT(B1)，突變雜合型TC(B2)和野生型CC(B3)。rs72474224位點(diǎn)基因型包括突變純合型TT(C1)，突變雜合型TC(C2)和野生型CC(C3)。如圖1所示。

2.3GJB2基因多態(tài)性與噪聲性聽(tīng)力損失分析

對(duì)照組基因型進(jìn)行遺傳平衡性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示該基因3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。GJB2基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率在病例組與對(duì)照組中的分布如表1中所示。

圖1　GJB2基因rs2274083、rs2274084、rs72474224多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

rs2274083位點(diǎn)T、C等位基因在病例組中的分布分別為79.94%、20.06%，在對(duì)照組中分別為72.88%、27.12%，該位點(diǎn)等位基因頻率在病例組和對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TT、TC、CC基因型在病例組中的分布分別為64.98%、29.94%、5.08%，在對(duì)照組中分別為54.8%、36.16%、9.04%，基因型頻率在病例與對(duì)照組間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

rs2274084位點(diǎn)T、C等位基因在病例組中的分布分別為26.27%、73.73%，在對(duì)照組中分別為36.16%、63.84%。TT、TC、CC基因型在病例組中的分布分別為7.91%、36.72%、55.37%，在對(duì)照組中分別為12.43%、47.46%、40.11%。該位點(diǎn)等位基因頻率與基因型頻率在病例組和對(duì)照組間的分布差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。攜帶CC基因型個(gè)體比攜帶TT基因型個(gè)體更容易發(fā)生噪聲性聽(tīng)力損失(OR=2.17，95%CI=1.04～4.53)。

rs72474224位點(diǎn)T、C等位基因頻率在病例組中的分布分別是7.91%、92.09%，在對(duì)照組中分別為3.67%、96.33%，該位點(diǎn)等位基因頻率在病例組和對(duì)照組間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.83，P＜0.05)。TT、TC、CC基因型在病例組中的分布分別為2.26%、11.3%、86.44%，在對(duì)照組中分別為0、7.34%、9 2.66%?；蛐皖l率在兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3　討論

GJB2基因編碼的蛋白屬于縫隙連接蛋白家族，與相鄰細(xì)胞的縫隙連接蛋白組成一個(gè)完整的縫隙連接通道，是電解質(zhì)、第二信使和代謝產(chǎn)物在細(xì)胞間轉(zhuǎn)換的重要通道[11-14]。本研究中GJB2基因3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性為亞洲人群多見(jiàn)，其他種族鮮有，通過(guò)HapMap中查得rs2274083 T、C等位基因在亞洲漢族人群中的分布頻率為71.1%、28.9%。rs2274084 C、T等位基因在亞洲漢族人群中的分布頻率為63.95%、36.05%。rs72474224 C、T等位基因頻率在漢族人群中的分布頻率為95%、5%。3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的多態(tài)性在歐洲人群和非洲人群中均不存在。提示該3個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性存在種族性差異，本研究對(duì)GJB2基因多態(tài)位點(diǎn)rs2274083、rs2274084和rs72474224進(jìn)行基因型分型，探討基因多態(tài)性與噪聲性聽(tīng)力損失的相關(guān)性，對(duì)于篩查漢族人群噪聲作業(yè)易感基因有重要意義。

有研究表明，GJB2 rs2274084位點(diǎn)多態(tài)性與非綜合征型耳聾存在相關(guān)性[15]。本研究結(jié)果顯示，rs2274084位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率在病例組和對(duì)照組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在相同的噪聲暴露前提下，rs2274084位點(diǎn)的CC基因型個(gè)體比TT基因型個(gè)體更容易發(fā)生噪聲性聽(tīng)力損失(OR值為2.82，1.27～6.28)。rs2274084 CC基因型可能是噪聲性聽(tīng)力損失的易感基因型，研究結(jié)果與先前研究一致[15]。GJB2 c.235delC突變是非綜合征型耳聾的已確認(rèn)的熱點(diǎn)突變[16，19]，rs2274084位于該突變位點(diǎn)下游155 bp，位于GJB2外顯子區(qū)域，為非同義突變。有研究表明，外顯子區(qū)域多態(tài)位點(diǎn)的改變可能導(dǎo)致原編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能降低或消失[17]，該位點(diǎn)多態(tài)性可能改變了原編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能，從而影響了聽(tīng)力。

多項(xiàng)研究也證明GJB2基因多態(tài)性與非綜合征型聽(tīng)力損失存在相關(guān)性[18-20]。Jiang等[19]以176例非綜合征型耳聾患者為研究對(duì)象，探討了GJB2基因突變?cè)谡憬貐^(qū)耳聾病人間的分布，共發(fā)現(xiàn)了14個(gè)不同的突變，其中包括2個(gè)新突變位點(diǎn)，最常見(jiàn)的突變是GJB2 c.235delC。Grillo等[20]以122例耳聾患者和132例對(duì)照作為研究對(duì)象進(jìn)行病例對(duì)照研究，探討GJB2基因編碼區(qū)多態(tài)位點(diǎn)與耳聾之間的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(rs3751385、rs7994748、 rs7329857、rs7987302、rs945369、rs7333214)的等位基因頻率在病例組與對(duì)照組之間存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上研究均表明，GJB2基因多態(tài)位點(diǎn)在非綜合征型耳聾的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

綜上所述，縫隙連接蛋白GJB2基因rs2274084位點(diǎn)多態(tài)性很可能與漢族人群噪聲性聽(tīng)力損失易感性存在著相關(guān)，機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

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Association between GJB2 genetic polymorphisms and occupational hearing loss in Chinese Han population

YU Decai，MIAO Long，YANG Wenwen，ZHANG Juan，YIN Lihong，PU Yuepu*
(Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu, China)

R994.6

A

1004-616X(2016)02-0121-05

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.008

2016-02-01；

2016-03-03

環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(2015EME001)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金和江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(SJZZ_0034)

作者信息： 于德財(cái)，E-mail：yudecai422221@163.com。*

，浦躍樸，E-mail：Yppu@seu.edu.cn