王巍巍，唐發(fā)清，李躍進(jìn)

二亞硝基哌嗪上調(diào)AGR2促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

王巍巍，唐發(fā)清，李躍進(jìn)*

（珠海市人民醫(yī)院/暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院檢驗科，廣東珠海519000）

目的： 探討二亞硝基哌嗪(DNP)通過調(diào)控AGR2表達(dá)參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制。方法：以具有低轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞6-10B作為研究材科，應(yīng)用四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法檢測DNP對6-10B細(xì)胞的非毒性濃度；分別采用間接免疫熒光法、Western blot和實時熒光定量PCR法檢測DNP對6-10B細(xì)胞中AGR2蛋白及mRNA表達(dá)的影響；采用針對AGR2基因的特異性小干擾RNA(siRNA)沉默6-10B細(xì)胞AGR2的表達(dá)，并用Transwell小室法檢測其對細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果：MTT法檢測DNP對6-10B細(xì)胞的非毒性濃度為0～10.0 μmol/L；8.0 μmol/L DNP處理6-10B細(xì)胞后，間接免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)AGR2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且以在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)為主；不同濃度的DNP處理6-10B細(xì)胞24 h或用8.0 μmol/L的DNP處理6-10B細(xì)胞不同時間后，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGR2蛋白的表達(dá)水平增加且呈濃度和時間依賴性(P＜0.05)；siRNA-AGR2沉默6-10B細(xì)胞屮AGR2基因的表達(dá)后，DNP誘導(dǎo)6-10B細(xì)胞的侵襲及遷移能力較干擾前明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論：DNP可能通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)AGR2的表達(dá)，影響鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

鼻咽癌；二亞硝基哌嗪；AGR2；腫瘤轉(zhuǎn)移

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate theinduction of AGR2 expression by dinitrosopiperazine (DNP) in nasopharyngeal cancer cell (NPC) 6-10B and to explore involvement of DNP in NPC metastasis. METHODS：Noncytotoxic concentrations of DNP on 6-10B cells were determined using MTT. Expression of AGR2 protein and mRNA in 6-10B cells which were treated with DNP were detected by indirect immunofluorescence，Western blotting and real-time RT-PCR，respectively. In addition，silencing the expression of AGR2 by siRNA-AGR2 was investigated. The capabilities of invasion and migration of 6-10B cells were investigated using Transwell assay. RESULTS：The range of non-cytotoxic concentrations (NCC) of DNP was 0-10.0 μmol/L. The results of indirect immunofluorescence showed AGR2 mainly expressed in cytoplasm after DNP treatment. These and 5-8F cells had stronger fluorescence intensity than untreated 6-10B cells. The DNP-induced AGR2 expression showed dose- and time-dependent effects. Real-time RT PCR analyses showed that AGR2 mRNA expression rate was 1.01±0.08 in the untreated 6-10B cells and 3.96±0.15 in the cells treated with 8.0 μmol/L DNP. The difference was significant. In addition，the relative fold gene expression of AGR2 in 5-8F cells was higher than that in non-treated 6-10B cells (P＜0.05). The transwell migration and invasion data showed that siRNA-AGR2 transfection blocked AGR2 expression in 6-10B cells. In addition，both DNP-induced invasion and motility were dramatically decreased when AGR2 expression was blocked (P＜0.05). However，DNP could effectively induce cell invasion (P＜0.05) and motility (P＜0.05) when AGR2 was not blocked. CONCLUSION：DNP could up-regulate AGR2 expression in 6-10B cells through transcriptional regulation mechanism and then mediate the metastasis of nasopharyngeal cancer cells.

【KEY WORDS】nasopharyngeal cancer；dinitrosopiperazine；AGR2；neoplasm metastasis

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方地域比較常見的惡性腫瘤之一[1]，其發(fā)生以南方的廣東、廣西、湖南等地發(fā)病率最高，具有顯著的種族和地域分布的特點，是一種與遺傳及環(huán)境因素密切相關(guān)的疾病[1-2]，但發(fā)病機制目前尚未完全明確。早期的流行病學(xué)調(diào)查和實驗研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌發(fā)病的風(fēng)險與經(jīng)常食用熏肉、咸魚及腌制食品等飲食習(xí)慣有關(guān)[3-4]，原因是這些食物的制作方法會增加包括二亞硝基哌嗪(N，N'-Dinitrosopiperazine，DNP)在內(nèi)的N亞硝胺。 研究證實DNP可誘導(dǎo)鼻咽癌的發(fā)生，并對鼻咽細(xì)胞具有很高的組織親和性[5]。其不僅參與鼻咽癌的癌變過程[6]，還與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。AGR2基因在生物的發(fā)育和生長過程中發(fā)揮著重要作用[8-9]，具有多種生物學(xué)功能，在外界刺激因子的作用下高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長和細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等。在本課題組前期研究中，通過蛋白組學(xué)SILAC 方法比較了DNP處理組細(xì)胞和DMSO對照組細(xì)胞中的蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在DNP處理組細(xì)胞中AGR2顯著高表達(dá)。由此推斷DNP可能通過上調(diào)AGR2參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移。本研究擬以低轉(zhuǎn)移性6-10B細(xì)胞為細(xì)胞模型，用DNP處理后，通過分析DNP對6-10B中AGR2的表達(dá)及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，探討DNP參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制。

1　材料與方法

1.1主要材料

人鼻咽癌細(xì)胞株6-10B和5-8F購自中南大學(xué)湘雅中心實驗室細(xì)胞庫，為鼻咽癌細(xì)胞株SUNE-1的兩個亞株，具有相同的遺傳背景，5-8F具有高成瘤、高轉(zhuǎn)移的能力，而6-10B則只成瘤、不轉(zhuǎn)移。DNP由湖南省農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)生物教研室合成，為一環(huán)狀亞硝基化合物，分子式為C4H8N4O2。兔抗人AGR2抗體購自Abcam公司。PCR引物，特異性針對AGR2基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)及陰性對照siRNA-Mock均由上海生工生物工程有限公司合成并修飾。PCR試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。Transwell小室和化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購自Corning公司。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。定量PCR用的SYBR Green PCR Master Mix購自TOYOBO公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)鼻咽癌6-10B和5-8F分別用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長后，采用0.2%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)1～2 d。

1.2.2MTT法篩選DNP處理6-10B細(xì)胞的非毒性濃度將6-10B細(xì)胞按每孔2×103個的密度接種至96孔板，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h左右，制備細(xì)胞板，供MTT實驗使用。將DNP用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基分別稀釋至16.0、14.0、12.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0 μmol/L，分別加在96孔細(xì)胞板中，每種濃度設(shè)置3個復(fù)孔。37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔再加入150 μL DMSO，搖床上低速振蕩10 min左右，待結(jié)晶物充分溶解后，酶聯(lián)免疫檢測儀測量波長為492 nm處各孔的吸光度值D(492)，參考波長為630 nm。通過檢測活細(xì)胞數(shù)，計算DNP處理6-10B細(xì)胞的非毒性濃度(non-cytotoxic concentration，NCC)。

1.2.3間接免疫熒光法檢測AGR2蛋白的表達(dá)及定位

6-10B細(xì)胞按每孔1×104個的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，加入DNP(8.0 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，以未加DNP處理的細(xì)胞為空白對照組，未加DNP處理的5-8F為陽性對照組。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的甲醇溶液固定細(xì)胞，PBS漂洗細(xì)胞3次，加入含5%小牛血清白蛋白的封閉液封閉處理30 min，加入一抗兔抗人AGR2單克隆抗體(1∶100稀釋)，4 ℃反應(yīng)過夜，用PBS漂洗3次，加入二抗(FITC-羊抗兔IgG，1∶100稀釋)，室溫反應(yīng)1 h，再加入DAPI染色細(xì)胞核，最后在激光共聚焦顯微鏡(×1 000)下觀察AGR2蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位的情況。實驗重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測AGR2蛋白的表達(dá)收集各組細(xì)胞，用試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取10 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)一抗(AGR2兔抗人單克隆抗體，GAPDH兔抗人單克隆抗體)和二抗(HRP標(biāo)記的抗兔二抗)反應(yīng)，最后采用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒發(fā)光顯影。實驗重復(fù)3次。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測AGR2 mRNA的表達(dá)實驗分成3組：DNP(0.0 μmol/L)處理6-10B細(xì)胞組；DNP(8.0 μmol/L)處理6-10B細(xì)胞組；5-8F細(xì)胞對照組。收集各組細(xì)胞，采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，檢測總RNA純度和完整性，按說明書進(jìn)行操作，取4 μL總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系如下：5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4.0 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μL，M-MLV(200 U/μL) 1.0 μL，DEPC水 10.0 μL，RNA模板4.0 μL，總體積 20.0 μL。反應(yīng)條件：37 ℃、1 h，然后95 ℃、3 min。取6 μL cDNA進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)條件：95 ℃、 5 min；95 ℃、15 s，65 ℃、15 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)體系：5×buffer 10.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，探針1.0 μL，dNTPs 1.0 μL，Taq酶1.0 μL，補水至總體積50.0 μL，以18 s rRNA作為內(nèi)參照，采用2-△△CT法計算基因的相對表達(dá)量。AGR2基因引物序列：上游5′-GTCAC GTGGCCCAGATTTAT-3′，下游5′-TCTCCTTCTTGGAA GCCTCA-3′。18 s rRNA引物序列：上游5′-CCTGGAT ACCGCAGCTAGGA-3′，下游5′-GCGGCGCAATACGA ATGCCCC-3′。

1.2.6siRNA-AGR2的設(shè)計及基因轉(zhuǎn)染siRNAAGR2和siRNA-Mock由銳博公司合成，每個siRNA序列5 nmol，干擾片段序列如下：Mock，5′-GCTACACA AATCAGCGATTT-3′；siAGR2-1，5′-CUGAUUAGGU UAUGGUUUATT-3′；按Lipofectamine 2000說明書的方法操作，將siRNA-AGR2和siRNA-Mock分別瞬時轉(zhuǎn)染至6-10B細(xì)胞，培養(yǎng)12 h。采用8.0 μmol/L的DNP處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，24 h后，Western blot檢測AGR2蛋白的表達(dá)情況，分析siRNA對AGR2基因沉默的效率。未用DNP處理組中則加入含0.01%的DMSO培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.7 細(xì)胞侵襲和遷移能力的檢測取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對數(shù)生長期的6-10B細(xì)胞1×104個，采用8.0 μmol/L的DNP處理細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞加入Boyden-champer(用含基質(zhì)成分的Matrigel膠包被)上室，下室中則加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h。用棉簽除去未遷移的細(xì)胞。甲醇溶液固定細(xì)胞后，結(jié)晶紫染色。光學(xué)顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞遷移能力的檢測，同樣將1×104個6-10B細(xì)胞接種于Boyden-champer(未用含基質(zhì)成分的Matrigel膠包被)上室，培養(yǎng)12 h，固定并染色細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞。實驗重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用單因素方差分析比較-多組間均數(shù)；獨立樣本t檢驗比較兩組間均數(shù)。采用x±s表示計量資料，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1DNP對6-10B細(xì)胞的非毒性濃度

MTT實驗結(jié)果見圖1，顯示6-10B細(xì)胞在DNP 0～10.0 μmol/L濃度范圍，細(xì)胞生長無明顯影響(P＞0.05)，即DNP處理6-10細(xì)胞的非毒性濃度為0～10.0 μmol/L。后續(xù)實驗從該范圍內(nèi)選擇DNP的實驗濃度。

2.2DNP對鼻咽癌細(xì)胞中AGR2蛋白表達(dá)的影響

AGR2使用的二抗為紅色標(biāo)記的山羊抗兔IgGFITC，細(xì)胞核DAPI染色呈藍(lán)色。間接免疫熒光法檢測結(jié)果見圖2，可見6-10B細(xì)胞組、8.0 μmol/L DNP處理6-10B細(xì)胞組及5-8F細(xì)胞組各組細(xì)胞中均有AGR2蛋白的表達(dá)，并以在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)為主，其中以DNP處理組6-10B細(xì)胞中蛋白表達(dá)最為顯著。

圖2　DNP對6-10B細(xì)胞中AGR2表達(dá)的影響

2.3DNP對6-10B細(xì)胞AGR2蛋白表達(dá)的影響

采用了非毒性濃度的DNP處理6-10B細(xì)胞，Western blot檢測6.0、8.0、10.0 μmol/L DNP分別處理6-10B細(xì)胞24 h后AGR2的表達(dá)水平，以及8.0 μmol/LDNP分別處理6-10B細(xì)胞12、18、24 h后AGR2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，未經(jīng)DNP處理的6-10B細(xì)胞AGR2的表達(dá)水平很低，6.0、8.0、10.0 μmol/L不同濃度DNP處理后6-10B細(xì)胞AGR2表達(dá)水平均高于未處理組，且隨DNP濃度的增大表達(dá)逐漸增多(P＜0.05)，表現(xiàn)出一定的濃度依賴性(圖3A、3C)；隨著DNP誘導(dǎo)時間的延長，AGR2的表達(dá)逐漸增強，藥物處理24 h組AGR2的表達(dá)明顯增強(P＜0.01)，呈現(xiàn)出一定的時間依賴性(圖3B、3D)。AGR2在5-8F細(xì)胞組中的表達(dá)量明顯高于未經(jīng)DNP處理的6-10B細(xì)胞組。

圖3　非毒性濃度的DNP處理6-10B細(xì)胞后AGR2表達(dá)的濃度和時間效應(yīng)

2.4DNP對6-10B細(xì)胞中AGR2 mRNA表達(dá)的影響

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果見圖4，可見8.0 μ mol/L的DNP處理6-10B細(xì)胞24 h后，AGR2 mRNA的相對表達(dá)量明顯高于DNP未處理組(P＜0.05)。

圖4　實時熒光PCR定量法檢測DNP處理后對6-10B細(xì)胞中AGR2-mRNA表達(dá)的影響

2.5沉默AGR2基因?qū)NP誘導(dǎo)6-10B細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

為進(jìn)一步明確DNP在誘導(dǎo)6-10B細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，沉默AGR2的表達(dá)后，實驗分成4組：Mock對照組；DNP(8.0 μmol/L)+Mock組；siRNA-AGR2組；DNP(8.0 μmol/L)+siRNA-AGR2組。培養(yǎng)24 h后，檢測各組AGR2的表達(dá)，結(jié)果顯示，DNP(8.0 μmol/L)+ siRNA-AGR2組AGR2的表達(dá)明顯低于DNP(8.0 μmol/L)+ Mock組(P＜0.05，圖5A、5B)。細(xì)胞侵襲和遷移檢測結(jié)果顯示，DNP(8.0 μmol/L)+siRNA-AGR2組的侵襲及遷移能力較Mock組均未發(fā)生明顯變化，但較DNP (8.0 μmol/L)+Mock組則均明顯降低(P＜0.05，圖5C～F)。說明AGR2蛋內(nèi)表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞的遷移和侵襲通力都被抑制。提示AGR2可能是DNP作用的靶蛋白之一。

3　討論

NPC是我國南部和東南亞最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的侵襲轉(zhuǎn)移能力。雖然NPC對放療敏感，但5年生存率仍在50%～60%，即使經(jīng)過正規(guī)的治療，還有30%左右III期、IV期的鼻咽癌患者發(fā)生遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移[10]。一旦頸部淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，5年生存率小于50%；而若遠(yuǎn)端器官發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率則只有20%左右，最常見的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移部位包括骨(20%)、肺臟(13%)、肝臟(9%)[11]等。因此，挖掘鼻咽癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機制，并加以行之有效的干預(yù)措施控制其轉(zhuǎn)移，成為鼻咽癌研究的熱點和重點。

亞硝胺類化合物是鼻咽癌致癌過程中的重要化學(xué)致癌物之一，在前期研究工作中，我們將DNP少量多次或短期大量皮下注射，成功地誘導(dǎo)大鼠鼻咽癌[12]。在實驗中發(fā)現(xiàn)DNP注射量與大鼠鼻咽癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，DNP高劑量組大鼠鼻咽癌轉(zhuǎn)移率明顯增高。臨床檢測還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血清含有較健康人群高的DNP，且?guī)ьi淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者DNP量顯著高于無轉(zhuǎn)移患者。提示DNP不僅與鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，還與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移有相關(guān)性[13]。

本課題在對DNP處理6-10B細(xì)胞前后蛋白質(zhì)組差異的研究發(fā)現(xiàn)，AGR2蛋白的表達(dá)上調(diào)[14]。AGR2被發(fā)現(xiàn)以來，大量證據(jù)表明AGR2在多種人類腫瘤中過量表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-19]。因此，AGR2可能是DNP誘導(dǎo)鼻咽癌發(fā)生且參與轉(zhuǎn)移的重要靶分子。然而，國內(nèi)外提及AGR2與鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究未見報道。

圖5　沉默AGR2基因?qū)NP誘導(dǎo)6-10B細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

為探討化學(xué)致癌物DNP促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機制，本研究中采用非毒性濃度的DNP處理低表達(dá)AGR2的6-10B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DNP能明顯誘導(dǎo)AGR2蛋白表達(dá)的上調(diào)，并主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，濃度為8.0 μmol/L時，其表達(dá)量甚至高于其在髙轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌5-8F細(xì)胞中的表達(dá)水平，因此提示DNP可有效誘導(dǎo)AGR2蛋白的表達(dá)，AGR2蛋白的表達(dá)可能與鼻咽癌細(xì)胞的惡性程度有關(guān)。為進(jìn)一步探討DNP上調(diào)AGR2表達(dá)的分子作用機制，我們分析AGR2 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明DNP能誘導(dǎo)AGR2 mRNA表達(dá)的上調(diào)，提示DNP可能是通過轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)蛋白的表達(dá)。因此，為進(jìn)一步明確AGR2在DNP誘導(dǎo)6-10B細(xì)胞中的作用，本研究沉默AGR2的達(dá)后，發(fā)現(xiàn)DNP誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲和遷移的能力顯著降低，提示DNP誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移在一定程度上是通過AGR2介導(dǎo)的。

綜上所述，本研究通過分析非毒性濃度的DNP對6-10B細(xì)胞中AGR2蛋白水平的影響以及其在誘導(dǎo)6-10B細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用，推測AGR2蛋白在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中起重要作用，為闡明鼻咽癌高轉(zhuǎn)移的發(fā)病機制提供了一個新的實驗證據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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Dinitrosopiperazine-mediated up-regulation of AGR2 expression promotes metastasis of nasopharyngeal cancer cells

WANG Weiwei，TANG Faqing，LI Yuejin*
(Department of Clinical Laboratory, Zhuhai People’s Hospital & Zhuhai Hospital of Jinan University, Zhuhai 519000, Guangdong, China)

R73-37

A

1004-616X(2016)02-0115-06

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.007

2015-11-20；

2016-01-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(81402265)

作者信息： 王巍巍，E-mail：wangweiweicat@163.com。*

，李躍進(jìn)，E-mail：liyuejincat@163.com