吳華濤，沈家欣，劉　靜，

Notch3增強三陰性乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞對順鉑的敏感性

吳華濤1，沈家欣2，3，劉靜2，3，*

（1. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科，廣東汕頭515041；2. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院長江學(xué)者實驗室，廣東汕頭515041；3. 廣 東省乳腺癌診治研究重點實驗室，廣東汕頭515041）

目的： 探討干細(xì)胞相關(guān)因子Notch3在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對順鉑化療敏感性中的作用。方法：用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞并用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分為MDA-MB-231-PCLE組(對照組)和MDA-MB-231-N3ICD組(過表達(dá)Notch3組)，應(yīng)用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測不同組間Notch3表達(dá)的差異；用CCK8法檢測各組MDA-MB-231細(xì)胞對順鉑敏感性的差異；同時利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Notch3的小干擾序列，根據(jù)轉(zhuǎn)染序列不同分為T47D-NC(對照組)和T47D-siNotch3(Notch3敲減組)；采用免疫印跡檢測Notch3表達(dá)改變后凋亡相關(guān)因子caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果：與對照組比較，高表達(dá)Notch3后三陰性乳腺癌對順鉑的敏感性增加(P＜0.05)，同時caspase-3的表達(dá)隨著Notch3的增加而增加，而在高表達(dá)Notch3的乳腺癌T47D細(xì)胞中，敲減Notch3的表達(dá)使caspase-3表達(dá)減少。結(jié)論：高表達(dá)Notch3可以增加三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對順鉑的敏感性，從而增強患者化療療效。

Notch3；順鉑；乳腺癌；化療

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the effect of stem cell-related factor，Notch3 on human triple negativebreast cancer cell，MDA-MB-231 and its resistance to cisplatin，and explore if overexpressed Notch3 can enhance thesensitivity of resistance cells to cisplatin. METHODS：Lipofectamine 2000 was applied to transfect Notch3 plasmid intoMDA-MB-231. These cells were divided into MDA-MB-231-PCLE group and MDA-MB-231-N3ICD group，accordingto the use of different plasmids. RT-PCR and Western blot methods were used to analyze the expression of Notch3 indifferent groups. The effects of cisplatin on cell proliferation were assessed by CCK8 assay and evaluated by GraphPadPrism 5. Lipofectamine 2000 was also applied to transfect the siNotch3 or scramble to cells and they were divided intoT47D-NC and T47D-siNotch3 groups. The protein levels of apoptosis-related factor were detected using RT-PCRmethods and Western blot. RESULTS：Then efficacy of cisplatin to triple negative breast cancer cells was enhanced byoverexpression of Notch3. Apoptosis-related factor，caspase-3 was up-regulated by Notch3 overexpression. However，siNotch3 induced the downregulation of caspase-3 in T47D，in which the expression of Notch3 was high.CONCLUSION：Overexpression of Notch3 enhanced the sensitivity of MDA-MB-231 to cisplatin which suggests thatthis m ay improve the efficiency of chemotherapy in patients with breast cancer.

【KEY WORDS】Notch3；cisplatin；breast cancer；chemotherapy

乳腺癌現(xiàn)已成為女性最常見的惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤新發(fā)病例的29%[1]。根據(jù)腫瘤細(xì)胞雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor， PR)和人表皮生長因子受體(human epithelialgrowth factor receptor 2，HER2)表達(dá)的不同可將乳腺癌分為不同的分子亞型，其中ER/PR/HER2均為陰性的三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是一種特殊類型的乳腺癌，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差。由于缺乏內(nèi)分泌和抗HER2靶向治療的靶點，TNBC的內(nèi)科治療以化療為主，但與其他亞型乳腺癌相比，TNBC具有更強的耐藥性。闡明TNBC化療耐藥的分子機制，探索新的治療靶點，及提高耐藥乳腺癌的化療敏感性是現(xiàn)階段研究的熱點。

Notch信號通路是細(xì)胞間重要的信號分子之一，與Wnt、Hedgehog等均為干細(xì)胞相關(guān)因子，不同通路間存在緊密的交聯(lián)(crosstalk)，且不同Notch受體的異常調(diào)控與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]。有研究表明，抑制Notch3的表達(dá)可以增強EBV相關(guān)鼻咽癌對順鉑的化療敏感性[3]。而在乳腺癌，尤其是TNBC中，順鉑的耐藥機制尚未闡明，因此，本研究主要探討Notch3信號通路對TNBC的調(diào)控作用，及對順鉑化療敏感性的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株和試劑

人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和luminal A型乳腺癌細(xì)胞株T47D均購于美國菌種保藏中心(ATCC)。MDA-MB-231及T47D細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后分別在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)。Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，順鉑及CCK8檢測試劑購自碧云天生物技術(shù)公司。Notch3過表達(dá)質(zhì)粒(PCLE-N3ICD)及對照質(zhì)粒(PCLE)均為Nicholas Gaiano教授贈送(質(zhì)粒在Addgene上的編號分別為#26894和#17703，http：//www.addgene.org)[4]。小干擾siNotch3序列(5′-UAUAGG UGUUGACGCCAUCCACGCA-3′)及scramble對照序列(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)均訂購于上海吉瑪公司。Anti-Notch3抗體和anti-caspase-3抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司，anti-GAPDH抗體購于上海奇康生物科技有限公司。

1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

選取常規(guī)培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞，待其匯合度達(dá)到80%～90%時使用Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑，PCLE-N3ICD或PCLE(陰性對照)和pcDNA3.1-luc(G418篩選抗性)以10∶1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照試劑說明書進(jìn)行操作，在轉(zhuǎn)染48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率，并加G418進(jìn)行篩選，待未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞全部死亡，即篩選出穩(wěn)定高表達(dá)Notch3的MDA-MB-231細(xì)胞株，實驗分組根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分為MDA-MB-231-PCLE組(對照組)和MDAMB-231-N3ICD組(過表達(dá)Notch3組)，通過實時熒光PCR及Western blot進(jìn)行驗證Notch3是否高表達(dá)。

同樣的方法轉(zhuǎn)染小干擾序列siNotch3或scramble，建立瞬時敲減細(xì)胞株，實驗分組為T47D-NC(對照組)和T47D-siNotch3(Notch3敲減組)。

1.3實時熒光定量PCR檢測MDA-MB-231細(xì)胞中Notch3 mRNA的表達(dá)水平

待穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞建立完成，分別收集實驗組(MDA-MB-231-N3ICD)和對照組(MDA-MB-231-PCLE)細(xì)胞，加入Trizol(TaKaRa)進(jìn)行裂解并提取RNA，NanoDrop 檢測RNA濃度，使用SYBR?Premix Ex TaqTMII逆轉(zhuǎn)錄成總cDNA。實時熒光定量PCR使用SYBR?Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，β-actin作為內(nèi)參，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。按2-??CT計算mRNA的相對表達(dá)水平。RT-PCR所用引物：Notch3-F，5′-GTGT GTGTCAATGGCTGGAC-3′；Notch3-R，5′-GTGACAC AGGAGGCCAGTCT-3′。β-actin-F，5′-AGCGAGCATC C C C C A A A G T T-3′；β-a c t i n-R，5′-GGGCACGAAGGCTC ATCATT-3′。

1.4Western blot實驗檢測MDA-MB-231細(xì)胞中Notch3和caspase-3蛋白的表達(dá)水平

同上所述，分別收集實驗組(MDA-MB-231-N3ICD)和對照組(MDA-MB-231-PCLE)細(xì)胞，加入RIPA緩沖液進(jìn)行裂解并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取30 n g蛋白溶液上樣，SDS-PAGE分離，電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF后，一抗(Anti-Notch3抗體稀釋比例為1∶3 000，anti-caspase-3抗體稀釋比例為1∶3 000， anti-GAPDH抗體稀釋比例1∶4 000)4 ℃孵育過夜，TBST清洗后，置于二抗(中杉金橋辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG，稀釋比例1∶3 000)中室溫孵育。最后對PVDF膜進(jìn)行常規(guī)曝光成像。

采用同樣的方法收集T47D-NC(對照組)和T47D-siNotch3(Notch3敲減組)中的總蛋白，并檢測Notch3和caspase-3蛋白的表達(dá)水平。

1.5CCK8法檢測順鉑對細(xì)胞株活性的影響

取對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株MDA-MB-231-PCLE(陰性對照)和MDA-MB-231-N3ICD細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，以每孔5 000個細(xì)胞接種于96孔板，貼壁生長24 h 后，將MDA-MB-231-PCLE(陰性對照)和MDAMB-231-N3ICD細(xì)胞分別給予不同劑量的順鉑(0、2.5、5、10、20和40 μ mol/L)處理，置于常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μ L C CK8試劑，2 h 后用酶標(biāo)儀檢測不同孔的吸光值D(450)，計算細(xì)胞生長抑制率。

由于本組實驗中并未達(dá)到相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)，采用同樣的方法，再次用高劑量的順鉑(0、1、5、25、125和625 μmol/L)處理MDA-MB-231-PCLE(陰性對照)和MDAMB-231-N3ICD細(xì)胞，計算細(xì)胞生長抑制率。

1.6生存分析

Notch3信使RNA(mRNA)的表達(dá)量與患者預(yù)后之間的關(guān)系通過Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(www. kmplot.com)進(jìn)行分析，該數(shù)據(jù)庫涵蓋了3 557例乳腺癌患者的臨床信息，可以在線繪制生存圖，計算危險系數(shù)(hazard ratio，HR)和95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)。

1.7統(tǒng)計分析用SP IS CS501計9.算0軟使件用，G r計a p量h P資a d料 P r使i sm用 5-x. 0±軟s表件示。，數(shù)組據(jù)間分析差使異采用t檢驗，α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1Notch3在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中的表達(dá)

熒光定量PCR以及Western blot結(jié)果顯示，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-231-N3ICD細(xì)胞中Notch3的表達(dá)水平明顯高于對照組MDA-MB-231-PCLE細(xì)胞(P＜0.05)，見圖1。

2.2Notch3高表達(dá)增強MDA-MB-231細(xì)胞對順鉑的敏感性

在低濃度梯度順鉑藥物處理組(圖2A)，對照組MDA-MB231-PCLE細(xì)胞中最高濃度40 μg/mL仍未使細(xì)胞的抑制率達(dá)到50%，根據(jù)GraphPad Prism 5軟件預(yù)測，該組的IC50約為(42.70±1.24) μmol/L。而高表達(dá)Notch3 的MDA-MB-231細(xì)胞組中，順鉑對MDA-MB-231的抑制作用明顯增加，IC50約為(9.22±1.36) μmol/L，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

由于上述濃度梯度在陰性對照組中未達(dá)到50%的抑制率，本研究增加相應(yīng)的順鉑濃度。如圖2B所示，對照組MDA-MB-231-PCLE細(xì)胞中順鉑的IC50約為(68.58±1.15) μmol/L，而高表達(dá)Notch3的MDA-MB-231-N3ICD細(xì)胞組中，順鉑的抑制作用同樣明顯增加，IC50約為(20.46±1.103) μmol/L，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1　構(gòu)建高表達(dá)Notch3的MDA-MB-231細(xì)胞株

圖2　Notch3高表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞對順鉑敏感性增加

2.3Notch3對MDA-MB-231細(xì)胞中caspase-3表達(dá)的影響

Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的下游蛋白[5]，其可能參與了Notch3對TNBC細(xì)胞耐藥機制的調(diào)控。為了驗證該假設(shè)，本研究檢測了Notch3對MDA-MB-231細(xì)胞中caspase-3 的影響。如圖3A所示，轉(zhuǎn)染Notch3質(zhì)粒并穩(wěn)定篩選的乳腺癌細(xì)胞中，caspase-3的表達(dá)較陰性對照組明顯增加。而在Notch3高表達(dá)的T47D細(xì)胞中，敲減Notch3的表達(dá)，caspase-3的表達(dá)也相應(yīng)減少(圖3B)。

圖3　Notch3對caspase-3表達(dá)量的影響

2.4高表達(dá)Notch3的乳腺癌患者預(yù)后較好

如圖4中所示，高表達(dá)Notch3的患者總生存期明顯高于低表達(dá)Notch3的患者，危險系數(shù)為0.82(0.73～0.92)，提示Notch3在乳腺癌患者中可能起到抑癌基因的作用。

圖4　乳腺癌患者Notch3 mRNA表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)

3　討論

Notch家族是一類高度保守的跨膜信號蛋白，4個家族成員(Notch1～4)的結(jié)構(gòu)相似，但功能及其在惡性腫瘤中的調(diào)控作用則存在廣泛的爭議[6]。其中，Notch3受體在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用存在爭議。Xu等[7]研究了不同Notch受體的mRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的作用，發(fā)現(xiàn)除Notch1高表達(dá)導(dǎo)致PR陰性的乳腺癌患者預(yù)后較差外，Notch2～4的mRNA表達(dá)水平與全部的乳腺癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)關(guān)系。而在另一項研究中，利用特異性的抗體OMP-59R5(即Tarextumab)，同時阻滯Notch2和Notch3信號通路，可以降低Notch信號通路下游靶基因的表達(dá)并減少腫瘤起始細(xì)胞(tumorinitiating cells，TICs)的數(shù)量，對各種上皮源性腫瘤具有明顯的治療作用[8]。

另一方面，不同Notch受體的表達(dá)對腫瘤化療敏感性的影響也有不同的報道。在前列腺癌中，Notch信號通路與吉西他濱(gemcitabine，GEM)的耐藥密切相關(guān)，阻斷Notch信號通路的表達(dá)，可以改變前列腺癌細(xì)胞的凋亡特性并增加其對GEM的敏感性[9]。Notch信號通路同時也是卵巢癌干細(xì)胞的重要分子路徑，以Notch信號通路為靶點的治療方式可以提高卵巢癌細(xì)胞的鉑類藥物治療的敏感性，提高療效[10]。而在乳腺癌不同的分子分型中，三陰性乳腺癌因其惡性程度高，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移快，缺少內(nèi)分泌治療和靶向治療的分子靶點，成為難治性乳腺癌。為了證實Notch3是否在乳腺癌耐藥中有逆轉(zhuǎn)效果而開展了本項研究。在本項研究中，我們采用了三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231進(jìn)行研究，在高表達(dá)Notch3的細(xì)胞株中，Notch3的蛋白水平明顯增加，CCK8結(jié)果顯示，順鉑能夠顯著抑制高表達(dá)Notch3的MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，IC50顯著降低。

凋亡抑制是惡性腫瘤的生物學(xué)特征之一，也是腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥的重要原因[11]。本研究中進(jìn)一步探討了Notch3增加三陰性乳腺癌細(xì)胞對順鉑敏感性的可能機制。Caspase-3是線粒體依賴信號通路和死亡受體信號通路級聯(lián)反應(yīng)所共同的效應(yīng)酶，其位于級聯(lián)反應(yīng)的下游，是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[12]。通過Western blot的方法發(fā)現(xiàn)，caspase-3的表達(dá)隨著Notch3表達(dá)量的增加而增加。而在Notch3高表達(dá)的非三陰性乳腺癌細(xì)胞株T47D中，敲減Notch3的表達(dá)，caspase-3表達(dá)也相應(yīng)減少。在乳腺癌細(xì)胞中，Notch3可能通過上調(diào)caspase-3的活性，增加三陰性乳腺癌細(xì)胞的凋亡，提高其對順鉑藥物的敏感性，是Notch3影響三陰性乳腺癌耐藥的重要機制之一。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)染Notch3質(zhì)粒并穩(wěn)定篩選，構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)Notch3的三陰性乳腺癌細(xì)胞株，能有效逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231對順鉑的耐藥，提高療效，其機制可能是直接或間接增加caspase-3的表達(dá)，提高乳腺癌細(xì)胞的凋亡水平。

[1] Siegel RL，Miller KD，Jemal A. Cancer statistics，2015[J]. CA Cancer J Clin，2015，65(1)：5-29.

[2] Takebe N，Miele L，Harris PJ，et al. Targeting Notch，Hedgehog，and Wnt pathways in cancer stem cells：clinical update[J]. Nat Rev Clin Oncol，2015，12(8)：445-464.

[3] Man CH，Wei-Man Lun S，Wai-Ying Hui J，et al. Inhibition of Notch3 signalling significantly enhances sensitivity to cisplatin in EBV-associated nasopharyngeal carcinoma[J]. J Pathol，2012，226(3)：471-481.

[4] Dang L，Yoon K，Wang M，et al. Notch3 signaling promotes radial glial/progenitor character in the mammalian telencephalon [J]. Dev Neurosci，2006，28(1/2)：58-69.

[5] Porter AG，Janicke RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death Differ，1999，6(2)：99-104.

[6] Lobry C，Oh P，Mansour MR，et al. Notch signaling：switching an oncogene to a tumor suppressor[J]. Blood，2014，123(16)：2451-2459.

[7] Xu J，Song F，Jin T，et al. Prognostic values of Notch receptors in breast cancer[J]. Tumor Biol，2015：1-7.

[8] Yen WC，F(xiàn)ischer MM，Axelrod F，et al. Targeting Notch signaling with a Notch2/Notch3 antagonist (tarextumab) inhibits tumor growth and decreases tumor-initiating cell frequency[J].

Clin Cancer Res，2015，21(9)：2084-2095.

[9] Du X，Zhao YP，Zhang TP，et al. Alteration of the intrinsic apoptosis pathway is involved in Notch-induced chemoresistance to gemcitabine in pancreatic cancer[J]. Arch Med Res，2014，45(1)：15-20.

[10] McAuliffe SM，Morgan SL，Wyant GA，et al. Targeting Notch，a key pathway for ovarian cancer stem cells，sensitizes tumors to platinum therapy[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2012，109(43)：2939-2948.

[11] Savage P，Stebbing J，Bower M，et al. Why does cytotoxic chemotherapy cure only some cancers?[J]. Nat Clin Pract Oncol，2009，6(1)：43-52.

[12] Choudhary GS，Al-Harbi S，Almasan A. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[J]. Methods Mol Biol，2015，1219：1-9.

Overexpression of Notch3 enhance the efficacy of cisplatin to MDA-MB-231

WU Huatao1，SHEN Jiaxin2，3，LIU Jing2，3，*
(1. Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041; 2. Changjiang Scholar’s Laboratory, Shantou University Medical College, Shantou 515041; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Breast Cancer, Shantou 515041, Guangdong, China)

R730.1；R737.9

A

1004-616X(2016)02-0111-05

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.006

2015-10-10；

2015-12-21

國家自然科學(xué)基金(81501539)；廣東省自然科學(xué)基金(2015A0303 10211)；廣東省創(chuàng)新人才項目(2014KQNCX078)和人才培育項目；汕頭市科技計劃項目(汕府科[2014]62號)

作者信息： 吳華濤，E-mail：wuhuatao@126.com。*

，劉 靜，E-mail：jliu12@stu.edu.cn