齊雪松，李　寧，王春燕，佟　鵬，茍　巧，鄭　輝

酒石酸長(zhǎng)春瑞濱脂質(zhì)微球注射液對(duì)荷人乳腺癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

齊雪松，李寧，王春燕，佟鵬，茍巧，鄭輝*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全應(yīng)急重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100088）

目的： 研究酒石酸長(zhǎng)春瑞濱脂質(zhì)微球注射液(NVB-lip)對(duì)荷人乳腺癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。方法：35只雌性BALB/c-nu裸鼠，隨機(jī)分為NVB-lip高(10 mg/kg)、中(5 mg/kg)、低(2.5 mg/kg)劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組(酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液，5 mg/kg)和陰性對(duì)照組(脂質(zhì)化空白溶液)，每組7只。給裸鼠接種人乳腺癌BCAP-37瘤株，待成瘤后，每只動(dòng)物每次按0.20 mL經(jīng)尾靜脈注射給藥，間隔3～4 d注射1次，每周注射2次，共注射6次。在第1次注射后第4、7、11、14、18和23天時(shí)分別稱(chēng)小鼠體質(zhì)量和測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算得出相對(duì)腫瘤體積、相對(duì)腫瘤增殖率和腫瘤抑制率。結(jié)果：與陰性對(duì)照組相比，各組荷瘤裸鼠體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。NVB-lip各劑量組的相對(duì)腫瘤體積和相對(duì)腫瘤增殖率顯著減小，腫瘤抑制率顯著增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論：NVB-lip在2.5～10 mg/kg范圍內(nèi)抑瘤作用明顯，具有可開(kāi)發(fā)潛力。

酒石酸長(zhǎng)春瑞濱脂質(zhì)微球注射液；裸鼠；人乳腺癌；腫瘤抑制

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To study the effect of vinorelbine tartrate lipid microsphere (NVB-lip) injection on growth of human breast cancer cells in nude mice. METHODS：35 female BALB/c-nu mice were inoculated with human breast cancer BCAP-37 cells. These mice were divided randomly into 5 groups for further treatments：NVB-lip high dose group (NVB-lip 10 mg/kg)，medium dose group (NVB-lip 5 mg/kg)，low dose group (NVB-lip 2.5 mg/kg)，positive drug control group (NVB-free 5 mg/kg) and negative control group (only lipid microsphere). There were 7 mice each group. Injection with NVB-lip was done after 6-8 days when the tumors shaped. NVB-lip was injected intravenously every 3 or 4 days each week for 6 times in total. Weights and tumor volumes(VT) of mice were observed and measured on No. 4，7，11，14，18 and 23 days from the first injection. Relative tumor volumn(VRT) ，relative tumor proliferation rate and tumor inhibition rate were calculated. RESULTS：The weights of nude mice for different groups increased slowly but the differences were not statistically significant. Compared with the negative group，the VRTand relative tumor proliferation rates of NVB-lip groups were reduced but tumor inhibition rate was increased. The differences were statistically significant (P＜0.01). CONCLUSION：The inhibition of NVB-lip high dose group(2.5-10 mg/kg) was more obviously than that of the other groups. NVB-lip may h ave c linical a pplications.

【KEY WORDS】vinorelbine tartrate lipid microsphere injection；nude mice；human breast cancer；tumor inhibition

酒石酸長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine tartrate，NVB)是一種新型長(zhǎng)春花生物堿類(lèi)抗腫瘤藥物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，是治療轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)性乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、惡性淋巴瘤等有效的化療藥物之一[1-3]。由于該藥在血液、神經(jīng)、消化和心血管等方面的毒性使其臨床應(yīng)用受到一定的限制[4-6]。為降低NVB的毒副作用，將其制成脂質(zhì)微球制劑成為近年來(lái)采用的方法。但NVB脂質(zhì)微球制劑尚在實(shí)驗(yàn)研究階段，其抑瘤效果有待明確。

乳腺癌是女性中發(fā)病率較高的腫瘤，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，因而對(duì)研發(fā)高效、低毒作用的抗癌藥物需求較為迫切。本研究通過(guò)荷人乳腺癌裸鼠模型觀察比較酒石酸長(zhǎng)春瑞濱脂質(zhì)微球注射液(vinorelbine tartrate lipid microsphere injection，NVB-lip)抑制腫瘤生長(zhǎng)或增殖藥效作用，為NVB新型制劑在乳腺癌治療的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c-nu裸鼠，35只，雌性，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2006-0008；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK (京)2006-0025。采用BALB/c-nu裸鼠無(wú)菌飼養(yǎng)罩在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2瘤源

人乳腺癌BCAP-37瘤株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理一室提供。瘤株已分別接種到BALB/c-nu裸鼠并且成瘤。

1.3主要試劑

酒石酸長(zhǎng)春瑞濱脂質(zhì)微球注射液(1 mg/mL)和空白脂質(zhì)微球注射液(每瓶5 mL)由沈陽(yáng)藥科大學(xué)提供，酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液(10 mg/mL，NVB-free)購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，無(wú)菌注射用水(每瓶10 mL)，購(gòu)自大通惠達(dá)藥業(yè)有限公司。所有試劑4 ℃ 密封保存。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1瘤塊移植接種方法常規(guī)消毒裸鼠胸腹部皮膚，在無(wú)菌下剝離瘤塊，去除瘤塊中心壞死組織和瘤塊周?chē)w維和脂肪組織，將腫瘤組織切割成1.5 mm× 1.5 mm×1.5 mm的腫瘤組織塊。用眼科鑷將2塊腫瘤組織移植到裸鼠右前肢腋窩皮下。

1.4.2荷瘤動(dòng)物分組和處理移植腫瘤6～8 d后進(jìn)行隨機(jī)分組，稱(chēng)量各組裸鼠體質(zhì)量并測(cè)量給藥前腫瘤體積(V0)后開(kāi)始經(jīng)尾靜脈注射給藥。根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)快慢和動(dòng)物體質(zhì)量差異，將35只裸鼠隨機(jī)分為5組，每組7只動(dòng)物。

參照酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液臨床應(yīng)用方法、推薦劑量和預(yù)實(shí)驗(yàn)中小鼠對(duì)該受試藥物的最大耐受劑量結(jié)果，將受試藥物(NVB-lip)設(shè)計(jì)為高(10 mg/kg)、中(5 mg/kg)、低(2.5 mg/kg)3個(gè)劑量組，分別相當(dāng)于人體質(zhì)量有效劑量的13、6.5和3.3倍。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(NVB-free，5 mg/kg)，相當(dāng)于人體質(zhì)量有效劑量的6.5倍；陰性對(duì)照組(脂質(zhì)化空白溶液)。各劑量組受試藥物均用空白脂質(zhì)化溶液按所需濃度配制，每只動(dòng)物每次注射體積按0.20 mL經(jīng)尾靜脈注射給藥，間隔3～4 d注射1次，每周注射2次，共注射6次。

1.4.3荷人乳腺癌瘤株裸鼠腫瘤生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定荷瘤裸鼠在第1次注射后第4、7、11、14、18和23天時(shí)分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑并稱(chēng)取裸鼠體質(zhì)量，于末次給藥后24 h處死動(dòng)物，稱(chēng)取體質(zhì)量，剝離腫瘤塊，稱(chēng)瘤質(zhì)量，觀測(cè)和比較不同實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠給藥后腫瘤生長(zhǎng)的差異，并按下列公式計(jì)算腫瘤體積(tumor volum， VT) 、相對(duì)腫瘤體積(relative tumor volum，VRT) 、相對(duì)腫瘤增殖率(relative tumor proliferation rate，T/C)和腫瘤抑制率(tumor inhibition rate，ri)：

其中a、b、c分別表示測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、寬、高；V為給藥前測(cè)量所得腫瘤體積；m-為對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)

0-C量，mT為 給藥組平均腫瘤質(zhì)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性，進(jìn)行t檢驗(yàn)；若方差不齊，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2　結(jié)果

2.1各組荷人乳腺癌瘤株裸鼠給藥期間體質(zhì)量的變化

見(jiàn)表1。各組荷瘤裸鼠隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)體質(zhì)量有所增長(zhǎng)，但各給藥組體質(zhì)量變化與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。

表1　荷人乳腺癌裸鼠體質(zhì)量變化(g)

2.2各組荷人乳腺癌裸鼠給藥期間VRT和 相對(duì)腫瘤增殖率的變化

由表2可見(jiàn)，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)腫瘤體積VRT均逐漸增大。與陰性對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中NVB-lip高劑量VRT減小趨勢(shì)更明顯。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，NVB-lip中劑量組VRT未見(jiàn)明顯差異，NVB-lip高劑量組VRT在 給藥后第18天和第23天顯著減小(P＜0.05)，低劑量組VRT在 給藥后第14天增大(P＜0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異。以第23天觀察的數(shù)據(jù)建立NVB-lip劑量效應(yīng)關(guān)系曲線為：y=-2.10x+43.38(校正的決定系數(shù)=0.99， P＜0.05)，提示NVB-lip具有明顯抑制人乳腺癌生長(zhǎng)或增殖藥效的作用，并在2.5～10 mg/kg范圍內(nèi)具有劑量效應(yīng)關(guān)系，即隨著NVB-lip劑量的增大VRT減 小。

各給藥組給藥期間移植腫瘤的相對(duì)增殖率均可見(jiàn)不同程度的增加，見(jiàn)表3。其中NVB-lip高劑量組增加最少，陽(yáng)性對(duì)照組和NVB-lip中劑量組次之，NVB-lip低劑量組均高于上述各給藥組。NVB-lip中、低劑量組的相對(duì)腫瘤增殖率從給藥后第11天達(dá)到峰值后呈緩慢下降趨勢(shì)(P＜0.05)。

RT

表2　荷人乳腺癌裸鼠相對(duì)腫瘤體積(V)的比較

表3　荷人乳腺癌裸鼠相對(duì)腫瘤增殖率的比較(%)

2.3 各組荷人乳腺癌裸鼠腫瘤質(zhì)量和腫瘤生長(zhǎng)抑制率的比較

末次給藥后腫瘤質(zhì)量和腫瘤抑制率變化顯示，各給藥組荷瘤動(dòng)物平均瘤質(zhì)量均明顯低于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。各給藥組組間比較，NVB-lip高劑量組瘤質(zhì)量最小，腫瘤抑制率最高；NVB-lip中劑量組次之；NVB-lip低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照接近，且兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表4。

表4　荷人乳腺癌裸鼠腫瘤質(zhì)量和腫瘤抑制率的變化

3　討論

NVB主要作用于腫瘤細(xì)胞G2期，屬于細(xì)胞周期特異性藥物，它與微管蛋白單體結(jié)合，抑制微管的形成，并且具有高度脂溶性，對(duì)微管具有解聚作用。正是NVB的這些作用，使腫瘤細(xì)胞的分裂增殖停止于有絲分裂中期，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用[7]。NVB的抗腫瘤活性十分明顯，但其毒副作用使患者不易堅(jiān)持使用，成為其在臨床應(yīng)用中的限制。脂質(zhì)體包封可以有效的降低NVB的毒副作用，減少藥物在正常組織中的分布，增加藥物在腫瘤組織中的蓄積[8]，且不會(huì)改變藥物的主要質(zhì)量指標(biāo)[9-10]，但脂質(zhì)體是否會(huì)降低藥物效用始終是臨床工作人員關(guān)注的焦點(diǎn)。

本文以荷瘤人乳腺癌裸鼠模型為研究對(duì)象，觀察NVB-lip抑制腫瘤生長(zhǎng)或增殖藥效的作用。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠相對(duì)腫瘤體積、相對(duì)腫瘤增殖率、腫瘤質(zhì)量和腫瘤抑制率指標(biāo)的變化發(fā)現(xiàn)，隨著NVB-lip給藥劑量增加，移植的腫瘤增殖減慢，瘤體發(fā)生不同程度的縮小，抑瘤效果明顯。通過(guò)給藥后第23天相對(duì)腫瘤體積的觀察發(fā)現(xiàn)NVB-lip在2.5～10 mg/kg范圍內(nèi)具有劑量效應(yīng)關(guān)系，抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用隨給藥劑量增加而增加。末次給藥后各給藥組腫瘤質(zhì)量和腫瘤抑制率結(jié)果顯示，NVB-lip具有明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。從NVB-lip 2.5和5 mg/kg劑量組的相對(duì)腫瘤增殖率變化還可發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)給藥11 d時(shí)達(dá)到峰值后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，這可能與脂質(zhì)體在體內(nèi)隨循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，有助于增加擴(kuò)散到腫瘤組織中的藥物分布量，進(jìn)而增加藥效有關(guān)[11]，關(guān)于NVB-lip在荷瘤小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究也證實(shí)了此觀點(diǎn)[12]。NVB-lip低劑量(2.5 mg/kg)組的抑瘤作用與陽(yáng)性對(duì)照(NVB-free)的抑瘤作用效果相當(dāng)，證實(shí)脂質(zhì)體包封并沒(méi)有影響NVB的抑瘤藥效作用，且高劑量(10 mg/kg)抑瘤作用更優(yōu)。另外，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量和外觀觀察，并未發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體對(duì)機(jī)體產(chǎn)生明顯損害或毒性，與Wakelee報(bào)道一致[13]。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可預(yù)測(cè)，NVB-lip的抑瘤作用可靠，藥效作用與同劑量陽(yáng)性對(duì)照比較未見(jiàn)明顯變化，故認(rèn)為NVB-lip具備可開(kāi)發(fā)潛力[14]。本研究未涉及NVB-lip對(duì)正常組織器官的影響，后續(xù)將進(jìn)一步深入研究。

[1] 王莉芳，王彩霞，魏娜，等. 酒石酸長(zhǎng)春瑞濱脂質(zhì)體注射液的安全性及抗腫瘤作用研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(11)：1627-1628.

[2] 王鳳岐，陳海霞. 重酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液治療乳腺癌患者的臨床研究[J]. 當(dāng) 代醫(yī)學(xué)，2011，17(29)：133-134.

[3] 謝榮盛，陳勇，梁業(yè)，等. 重酒石酸長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合5-氟尿嘧啶二線治療晚期胃癌的臨床觀察[J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，11(27)：60-61.

[4] 喬寶紅，宋淑英. 重酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射后出現(xiàn)滲漏患者的處理[J]. 陜 西醫(yī)藥雜志，2012，41(5)：517.

[5] 王秀云，吳情，凌芳芳. 冰敷預(yù)防重酒石酸長(zhǎng)春瑞濱引發(fā)靜脈炎46例效果觀察[J]. 齊魯護(hù)理雜志，2009，15(21)：21.

[6] 陳尚瑜，楊建峰. 重酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液致過(guò)敏性休克1例[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(9)：1231.

[7] 裴天仙，王晶晶，滕晉瑩，等. 酒石酸長(zhǎng)春瑞濱對(duì)大鼠免疫和造血系統(tǒng)的長(zhǎng)期毒性作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2014，28(4)：562-568.

[8] Galano G，Caputo M，Tecce MF，et al. Efficacy and tolerability of vinorelbine in the cancer therapy[J]. Curr Drug Saf，2011，6(3)：185-193.

[9] 王幸平，王志媛，龔偉，等. 酒石酸長(zhǎng)春瑞濱成循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的荷瘤小鼠藥效學(xué)研究[J]. 軍事醫(yī)學(xué)，2012，36(5)：362-364.

[10] Bahadori F，Topcu G，Eroqiu MS，et al. A new lipid-based nano formulation of vinorelbine[J]. AAPS Pharm Sci Tech，2014，15(5)：1138-1148.

[11] 王棟海，解李麗，張勇，等. PEG2000-DSPE含量不同的酒石酸長(zhǎng)春瑞濱脂質(zhì)體的制備和評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2014，45(11)：1046-1049.

[12] 莊翌，陳建偉，徐鑫鑫，等. 長(zhǎng)春瑞濱脂質(zhì)體與長(zhǎng)春瑞濱注射液在荷瘤小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44(3)：253-256.

[13] Wakelee HA，Middleton G，Dunlop D，et al. A phase I pharmacokinetic study of bexarotene with vinorelbine and cisplatin in patients with advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC)[J]. Cancer Chemother Pharmacol，2012，69(3)：815-824.

[14] Shi JF，Sun MG，Li XY，et al. A combination of targeted sunitinib liposomes and targeted vinorelbine liposomes for treating invasive breast cancer[J]. J Biomed Nanatechnol，2015，11(9)：1568-1582.

Effect of vinorelbine tartrate lipid microsphere injection on growth of human breast cancer cells in nude mice

QI Xuesong，LI Ning，WANG Chunyan，TONG Peng，GOU Qiao，ZHENG Hui*
(Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency, National Institute for Radiological Protection, China CDC, Beijing 100088, China)

R730.1

A

1004-616X(2016)02-0103-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.004

2015-11-02；

2015-11-26

作者信息： 齊雪松，E-mail：cedar121@sina.com。*

，鄭輝，E-mail：Z henghui@nirp.net