鄭　杰，龔　成，趙肅清

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院制藥工程系，廣東　廣州　510006)

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人心肌脂肪酸結(jié)合蛋白膠體金快速檢測試劑條的研制*

鄭杰，龔成，趙肅清

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院制藥工程系，廣東廣州510006)

建立一種以膠體金為基礎(chǔ)的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)(H-FAB)免疫層析快速檢測方法。方法 以雙抗體夾心的原理研制膠體金免疫層析試紙條，并對其特異性、靈敏度以及臨床應(yīng)用進(jìn)行評價。最低檢出限為10 ng·mL-1；10 min內(nèi)即可觀察結(jié)果；檢測急性心肌梗塞(AMI)患者46例、正常人群85例，試紙條的敏感度為86.96%，特異度為97.65%，約登指數(shù)為0.8461，kappa值為0.8633，表明試紙條與臨床確定的結(jié)果幾乎一致。該方法方便、快捷，能有效的檢測H-FAB，膠體金免疫層析試紙的研制為心肌梗塞的快速診斷與篩查奠定了基礎(chǔ)。

心肌脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)；膠體金免疫層析；試紙條

急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)是由于冠狀動脈急性阻塞引起嚴(yán)重和持久的心肌缺血壞死，如不及時救治，極易導(dǎo)致死亡[1]。心肌脂肪酸結(jié)合蛋白(heart fatty acid binding protein，H-FABP)是AMI早期新型高敏性標(biāo)志物[2-3]。本研究采用膠體金免疫層析[4]與雙抗體夾心的原理，通過原料篩選和工藝探索，研制H-FABP快速檢測試劑，并進(jìn)行臨床對照試驗(yàn)，為急性心肌梗塞提供早期診斷和篩查依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

H-FABP單克隆抗體,課題組制備；抗H-FABP單克隆抗體抗體,購于Fitzgerald；羊抗兔IgG,購于上海杰一生物技術(shù)有限公司；檸檬酸鈉、氯金酸、ProClin 300,購于Sigma；BSA,購于默克；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。玻璃纖維素墊、硝酸纖維素膜(NC膜)、PVC板、吸水墊、膠體金聚酯結(jié)合墊、抽提管等耗材,購于上海杰一生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

HM3030三維平面點(diǎn)膜噴金儀，上海金標(biāo)生物科技有限公司；C6M切割機(jī)，韓感中國；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；5417R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；U3010紫外可見光譜儀，日本HITACHI公司；HDM-2000調(diào)溫恒溫電熱套，常州國華電器有限公司；Tecnai12透射電子顯微鏡，荷蘭FEI。

1.3方法

1.3.1檢測原理

采用雙抗體夾心法和膠體金免疫層析的原理。將待測樣本加入到樣品孔，流經(jīng)結(jié)合墊時與膠體金標(biāo)記的抗H-FABP單克隆抗體反應(yīng)。此混合物流向包被有另一株抗H-FABP單克隆抗體的NC膜時與之反應(yīng)并形成“抗體-抗原-抗體-膠體金”復(fù)合物。陽性時，在膜上顯現(xiàn)出紅色檢測線(T)。當(dāng)樣本為陰性或者檢測抗原濃度低于本產(chǎn)品靈敏度時，T線不顯示。在檢測線上方的包被有羊抗兔IgG二抗，捕獲膠體金結(jié)合物并形成質(zhì)控線(C)，即此試劑有效。

圖1　雙抗體夾心膠體金原理

1.3.2膠體金免疫層析試紙條的研制

1.3.2.1膠體金顆粒的制備與鑒定

采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法：取純水100 mL加熱至約80～90 ℃；加入1%氯金酸溶液1 mL，繼續(xù)加熱攪拌至沸騰；迅速加入1%檸檬酸三鈉水溶液2 mL；加速攪拌繼續(xù)煮沸約5 min，待溶液變成透明紅色后停止加熱，適當(dāng)速度攪拌至室溫，去離子水定容至100 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｄz體金通過紫外掃描光譜儀和透射電鏡進(jìn)行表征[5]。

1.3.2.2膠體金標(biāo)記抗體的制備

取1 mL膠體金溶液，用0.2 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至8.5。加入0.01 mg抗H-FABP單克隆抗體抗體，輕微震蕩混勻，室溫下靜置1 h。再逐滴加入10 iL 10%的 BSA，充分混勻后靜置10 min，4 ℃，12000 r/min離心15 min，棄上清，加入0.01 mL含0.1% BSA，0.01% ProClin 300 pH8.5的0.05 mol/L Tris-HCl溶液使金-抗體復(fù)合物重懸，4 ℃保存?zhèn)溆?。?biāo)記抗體通過紫外掃描光譜儀檢測。

1.3.2.3樣品墊的預(yù)處理

用含1% BSA、2.5%蔗糖、0.5% Triton-100、0.5% PVP、0.2%酪蛋白鈉鹽、0.01%ProClin300的pH 7.4，0.01 mol/L PBS溶液浸泡玻璃纖維樣品墊，室溫干燥12 h后備用。

1.3.2.4檢測線、質(zhì)控線的包被

將包被抗體和羊抗鼠IgG分別稀釋至2.5、1.5 mg/mL，用點(diǎn)膜儀以1 μL/cm噴于NC膜上，分別作為檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，37 ℃干燥24 h備用。

1.3.2.5試紙條的組裝

以PVC板作背襯，將玻璃纖維素樣品墊、膠體金聚酯結(jié)合墊、NC膜和吸水墊如圖1所示組合，用切割機(jī)切成4 mm寬的紙條，裝入卡殼內(nèi)。

1.3.3試紙條性能檢測

1.3.3.1試紙條的最低檢出限測試

將重組H-FABP抗原用PBS稀釋至濃度為200、100、50、10、5、0 ng/mL，將膠體金試紙條插入到系列濃度溶液中，觀察檢測結(jié)果。

1.3.3.2試紙條交叉反應(yīng)測試

將試紙條插入到H-FABP抗原、牛血清、豬血清、鼠血清中進(jìn)行檢測，觀察檢測結(jié)果。

1.3.3.3試紙條的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

試劑在37 ℃條件下放置20 d后進(jìn)測試，觀察測試結(jié)果。

1.3.4臨床樣本檢測

在三家醫(yī)院采集85例體檢健康人群(肝、腎功能正常、心肌酶譜、心電圖正常)的血液；46名AMI患者入院后立即采血，血液樣本4 ℃，3000 rpm離心10 min收集血清。采用研制的膠體金試紙條進(jìn)行檢測，計算靈敏度，特異度，約登指數(shù)以及Kappa值。

2　結(jié)　果

2.1膠體金免疫層析試紙條的研制

本研究所制備的膠體金顆粒的最大特征吸收峰在520 nm處，峰形光滑，峰寬較窄，偶聯(lián)抗體后的膠體金紫外光譜最大吸收峰紅移，說明抗體已偶聯(lián)到膠體金顆粒上(圖2)。從掃描電鏡圖顯示，膠體金顆粒大小較均勻，平均粒徑約20 nm(圖3)。

圖2　膠體金溶液的紫外掃描光譜

圖3　膠體金顆粒透射電鏡圖

2.2試紙性能測試

2.2.1試紙條最低檢出限測試

通過所制試紙條對不同濃度的H-FABP抗原進(jìn)行檢測，10 ng/mL以上可以檢測出，因此將該試紙條的靈敏度定為10 ng/mL(圖4)。

圖4　膠體金試紙條靈敏度的檢測

2.2.2試紙條交叉反應(yīng)測試

試紙條檢測H-FABP抗原呈陽性，檢測牛血清、豬血清、鼠血清均呈陰性，證實(shí)試紙條特異性良好(圖5)。

圖5　膠體金試紙條特異性的檢測

2.2.3試紙條的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將所制備的試紙條用鋁箔袋封好后放入37 ℃烘箱20天后，對試紙條的靈敏度以及特異性進(jìn)行測定，測定結(jié)果顯示靈敏度有輕微的下降，特異性保持良好，證明試紙條有良好的穩(wěn)定性。

2.3臨床樣品檢測

用所制備膠體金試紙條共檢測臨床樣本131例，(正常人群85例，AMI患者46例)，結(jié)果見表1。計算公式：計算公式：靈敏度=a/(a+c)×100%，特異度=d/(b+d)×100%，約登

指數(shù)=[a/(a+c)+d/(b+d)]-1，Kappa=2(ad-bc)/[(a+b)(b+d)+(a+c)(c+d)]。通過計算得出試紙條檢測的敏感度為86.96%，特異度為97.65%，約登指數(shù)為0.8461，kappa值為0.8633，表明試紙條檢測與臨床確定的結(jié)果幾乎一致。

表1　膠體金試紙條測定臨床樣本

3　結(jié)　論

AMI是最主要的一種心血管疾病，日益嚴(yán)重危害著人們的生命健康，臨床結(jié)果表明患者在AMI發(fā)生6 h內(nèi)進(jìn)行再灌注治療會大大減少死亡率，H-FABP作為AMI早期標(biāo)志物，其快速檢測有著重要意義。常用的ELISA法、連續(xù)置換免疫測定等檢測方法，能定量檢測H-FABP，但檢測時間長(>1 h)、需要特殊的儀器、操作復(fù)雜、不能單份測定，不適宜床邊和急診室的快速檢測。

本研究采用膠體金免疫層析技術(shù)研制出H-FABP定性檢測試紙條，每份標(biāo)本只需10 min即可肉眼判讀結(jié)果，試劑條快速、簡便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，具備了在廣大基層醫(yī)院和急診室應(yīng)用的條件，為急性心肌梗塞患者的臨床快速診斷和現(xiàn)場應(yīng)用提供了一種簡便、快捷的診斷方法。

[1]White H D, Chew D P. Acute myocardial infarction [J]. The Lancet, 2008, 372: 570-584.

[2]Watanabe K, Wakabayashi H, Veerkamp J H, Ono T, Suzuki T. Immunohistochemical distribution of heart-type fatty acid-binding protein immunoreactivity in normal human tissues and in acute myocardial infarct [J]. The Journal of pathology, 1993, 170(1): 59-65.

[3]Azzazy H M E, Pelsers M M A L, Christenson R H. Unbound free fatty acids and heart-type fatty acid-binding protein: diagnostic assays and clinical applications[J]. Clinical chemistry, 2006, 52(1): 19-29.

[4]汪琳,周琦,賴平安,等. 免疫膠體金技術(shù)及其在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用[J]. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004(04):56-58.

[5]李衛(wèi)玲,葉陽,周有祥,等. 檸檬酸三鈉法制備膠體金的工藝條件優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(10):2529-2532.

Development of Colloidal Gold Rapid Test Strip for Human Heart Type Fatty Acid-binding Protein*

ZHENGJie,GONGCheng,ZHAOSu-qing

(Department of Pharmacy Engineering, School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology，Guangdong Guangzhou 510006，China)

To establish a rapid method of detecting human heart type fatty acid-binding protein (H-FABP) of acute myocardial infarction (AMI) patients, a rapid test strip of H-FABP was developed by using the gold-based immune chromatographic assay (GICA) technology. Based on the principle of double-antibody sandwich method, the colloidal gold strip was developed. The specificity, sensitivity and clinical application were evaluated. Results showed that the lowest detection limit of assay was 10 ng·mL-1and the detection time was about 10 min. The results of clinical detection of 46 patients with myocardial infarction (AMI) and 85 normal people showed that the sensitivity and the specificity of the strip were 86.96% and 97.65%, respectively, Youden’s index and Kappa value were 0.8461 and 0.8633, respectively. There was no difference between the strip tests and clinical diagnosis results. This method was convenient, rapid and effective for the detection of H-FAB. The development of GICA was applicable and laid a solid foundation for the rapid determination and screening of AMI in clinics.

human heart fatty acid-binding protein; colloidal gold; rapid test; reagent strips

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No: S2013010016021)。

鄭杰(1975-)，男，博士，講師，研究方向?yàn)槊庖邫z測方法研究及制藥工程。

TQ914.1

B

1001-9677(2016)03-0046-03