陳　盛，陳景春，何亞斌

(上海必諾檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上?！?00436)

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1,3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)檢測技術(shù)綜述

陳盛，陳景春，何亞斌

(上海必諾檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上海200436)

母乳是自然界賦予嬰兒最好的食物，當(dāng)母乳無法滿足嬰兒生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)與，嬰幼兒奶粉為替代母乳的最佳選擇。本文綜述了母乳脂肪代替品1,3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)的由來、合成技術(shù)及現(xiàn)有的檢測技術(shù)。2013年6月，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會發(fā)布了關(guān)于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑1,3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯》的征集意見稿以及相關(guān)的編制說明，要研發(fā)出更為快捷、精準(zhǔn)的檢測技術(shù)，成為了各大奶粉生產(chǎn)廠家及第三方檢測機(jī)構(gòu)的研究方向。

1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)；母乳；嬰幼兒配方奶粉；檢測技術(shù)

母乳中含有3.0%～4.5%的脂肪，是母乳中的主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，其不僅提供嬰兒活動所需的45%左右的能量，同時提供給嬰兒生長發(fā)育所必需的脂肪酸，其中包括98%的甘油三酯[1]。人體代謝甘油三酯通常是通胰脂肪酶水解，產(chǎn)物為Sn-1和Sn-3位游離脂肪酸及Sn-2位甘油單酯，且60%～70%分布在甘油三酯的Sn-2位上，而不飽和脂肪酸主要分布在Sn-1與Sn-3位上[2]；Sn-2位的棕櫚酸可與膽汁鹽形成乳糜微粒，促進(jìn)脂肪和鈣的吸收，增加骨骼礦物質(zhì)，降低脂肪酸皂化和大便硬度，對嬰幼兒的生長發(fā)育有促進(jìn)作用[3]。母乳是自然界賦予嬰兒最好的食物，母乳親喂無論從營養(yǎng)成分，免疫功能以及對嬰兒的大腦發(fā)育都有著積極、重大的作用。但由于社會壓力、母體的身體情況等原因無法進(jìn)行持續(xù)的、健康的母乳喂養(yǎng)時，嬰兒配方奶粉是大部分家庭的首選。牛乳是嬰幼兒配方乳粉中的重要原料，大部分的嬰兒配方奶粉是以添加棕櫚油為主要棕櫚酸來源，大約有80%的棕櫚酸在Sn-1位和Sn-3位上，甘油三酯中的棕櫚酸經(jīng)胰脂肪酶水解成游離棕櫚酸，易與金屬離子形成不溶性的鈣皂，從而導(dǎo)致鈣離子和能量的損失[4]。因此母乳與嬰兒配方奶粉中脂肪酸結(jié)構(gòu)上差異對嬰兒的營養(yǎng)吸收有很大的影響。

1　OPO合成的重大意義

2008年5月，中華人民共和國衛(wèi)生部公告(2008年第13號公告)批準(zhǔn)了1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(1,3-Dioleoyl-2-palmitoyl triglyceride；OPO)作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑可添加到嬰兒配方奶粉中；2013年1月1日頒布的GB 14880-2012《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定了OPO在嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品等方面的限量要求。已有研究表明，OPO添加到嬰兒配方奶粉中可以增加其 Sn-2 位棕櫚酸的含量，從脂肪酸組成和分布上模仿母乳脂肪，通過添加富含 OPO 的結(jié)構(gòu)油脂到嬰兒配方奶粉中可以有效的改善嬰兒配方乳粉喂養(yǎng)的嬰兒鈣質(zhì)和能量攝入不足的癥狀[5]。由此，進(jìn)一步對OPO的合成進(jìn)行研究有了更重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2　OPO的合成方法

2.1酶促酸解法

酶促酸解法是甘油三酯(TAG)在脂肪酶的催化下與脂肪酸之間發(fā)生?；D(zhuǎn)移從而改變TAG結(jié)構(gòu)組成的方法[6]。該方法制備人乳脂替代品一般采用Sn-2上富含棕櫚酸的TAG以及游離的多不飽和脂肪酸，在Sn-1、3位專一性脂肪酶的作用下進(jìn)行酶法酸解，將多不飽和脂肪酸結(jié)合到TAG的Sn-1、3位上。酶的種類及添加量、反應(yīng)體系、溫度、時間、底物比、以及水分含量均可以影響酯交換反應(yīng)。通過篩選確定最佳的反應(yīng)條件，制備出純度高同時副產(chǎn)物少的產(chǎn)品。韓國的Jeung H等[7]、蔣與燕等[8]、Esteban L等[9]都對此做了相關(guān)研究。

2.2酶促轉(zhuǎn)酯法

酶促轉(zhuǎn)酯法是指在脂肪酶催化下，兩種不同組成的TAG或TAG與簡單?；ブg發(fā)生反應(yīng)，酯類分子間的酰基發(fā)生交換而得到目的脂質(zhì)的方法[10]。此法相對于酶促合成法，利用率低，而研究相對較少。

3　OPO現(xiàn)有檢測方法

國外對甘油三酯脂肪酸位置分布的研究已經(jīng)很多，但基本步驟都是采用胰脂酶能專一水解甘油三酯Sn-1和Sn-3上的脂肪酸的性質(zhì)。然后用薄層色譜(TLC)或蒸發(fā)光散射高效液相色譜法(HPLC-ELSD)分離純化，直接或衍生后用氣相色譜(GC)或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測定。盡管國內(nèi)尚無出臺任何關(guān)于OPO的檢測標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法，但是也有很多人開始對OPO的檢測方法進(jìn)行研究。

3.1薄層色譜分離與氣相色譜法

Mattson等[11]提出的利用Sn-1,3位置專一性豬胰脂肪酶對TAGs進(jìn)行部分水解，然后經(jīng)薄層色譜(TLC)對水解產(chǎn)物中的Sn-2-單甘油酯進(jìn)行分離提純，通過氣相色譜(GC)法對Sn-2-單甘油酯中的脂肪酸組成進(jìn)行測定。

3.2反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離與氣相色譜法

賈云虹等[12]采用國際標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ISO)14156 的方法提取乳脂肪，利用豬胰脂酶專一水解甘油三酯分子的Sn-1和Sn-3位脂肪酸，得到Sn-2位單甘油酯，過反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離制備Sn-2單甘油酯，使用氫氧化鉀-甲醇溶液進(jìn)行衍生，經(jīng)氣相色譜進(jìn)行分析，結(jié)果為2-位棕櫚酸 RSD 為 1.99%，油酸 RSD 為3.22%，亞油酸 RSD 為 4.37%。

3.3蒸發(fā)光散射分離與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

韓瑞麗等[13]利用胰脂酶專一水解甘油三酯Sn-1和Sn-3位置上的脂肪酸得到Sn-2單甘油酯和游離脂肪酸，經(jīng)過正己烷提取后，再通過蒸發(fā)光散射高效液相色譜分析甘油三酯經(jīng)胰酯酶水解后的組成，并分離得到Sn-2單甘油酯，對其使用10%乙酰氯-甲醇溶液進(jìn)行衍生，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對Sn-2脂肪酸組成進(jìn)行分析。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該法對分離Sn-2位單甘油酯的回收率達(dá)到83.3%～85.1%，相對于傳統(tǒng)的薄層色譜(TLC)，更節(jié)約時間和成本。用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對產(chǎn)物進(jìn)行分析，精密度高，結(jié)果可靠。

3.4銀離子交換柱分離與液相色譜法

銀離子色譜(Ag+-HPLC)是目前應(yīng)用最廣泛的分離TAGs異構(gòu)體的方法。主要基于TAGs分子中脂肪酸雙鍵數(shù)目、雙鍵位置及雙鍵順反異構(gòu)的不同來實(shí)現(xiàn)TAGs 的分離[14]。

韋唯等[15]建立了一種以高效液相色譜結(jié)合銀離子交換柱(Silver-ion HPLC) 的測定方法。以銀離子交換柱通過HPLC 正相系統(tǒng)分離甘油三酯，配合蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)，以毒性較小，且甘油三酯溶解性較好的二氯甲烷和丙酮為流動相。在此條件下，1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯和1,2-二油酸-3-棕櫚酸甘油三酯兩種同分異構(gòu)體基本達(dá)到分離，樣品出峰完整，峰形良好。用HPLC測定，OPO的加標(biāo)回收率為96.7%，RSD為3.82%(n=5)。

魏婷婷等[16]采用正己烷提取樣品，利用串聯(lián)銀離子液相色譜柱對結(jié)構(gòu)甘油三酯的同分異構(gòu)體進(jìn)行分離測定，可有效的分離得到Sn-2單甘酯，同時采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，重復(fù)性良好，平均回收率在94.80%～115.35%之間，能夠滿足結(jié)構(gòu)甘油三酯同分異構(gòu)體的分析。

3.5胰脂肪酶與液相色譜法

為克服傳統(tǒng)測定中費(fèi)時的TLC分離步驟。趙海珍[17]等利用2-溴苯乙酮僅同游離脂肪酸作用的特點(diǎn)，建立了一套將脂肪酸酯化為苯乙酰甲酯, 然后進(jìn)行HPLC分析的方法。

該法利用Sn-1,3位置專一性豬胰脂肪酶對TAGs進(jìn)行部分水解，形成游離脂肪酸和甘油酯的混合物, 接著利用2-溴苯乙酮對混合物中的游離脂肪酸直接進(jìn)行衍生化, 形成苯乙酰甲酯，同時對另一份混合物進(jìn)行皂化，提取出游離脂肪酸后再進(jìn)行衍生化反應(yīng)。通過兩個樣品的處理比對，計(jì)算出Sn-2的位置及含量。

除了以上幾種方法之外，還有人使用其他不同的方法對Sn-2位脂肪酸進(jìn)行分離分析。馬小寧[18]等人采用乙醚和石油醚提取出配方乳粉中的油脂，以C51:0為內(nèi)標(biāo)，通過帶有多模式進(jìn)樣口進(jìn)樣器及氫火焰檢測器的氣相色譜儀對其中的1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯進(jìn)行定量分析。在其設(shè)定的條件下方法重現(xiàn)性良好，RSD為2.93%，回收率高達(dá)92.4%±4.5%。

4　展　望

近幾年來，我國嬰兒的出生率不斷攀升，伴隨著人民生活質(zhì)量的不斷提高，對于嬰幼兒配方奶粉的品質(zhì)要求更為嚴(yán)苛，如何將嬰幼兒配方奶粉中的營養(yǎng)成分更趨近去母乳，成為各大奶粉生產(chǎn)廠商重要課題；而1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯，作為嬰兒配方奶粉的重要配料，在中國具有重要的市場潛力。近年國內(nèi)乳企不斷推出主打添加OPO的配方奶粉，開始向國外同行看齊。

現(xiàn)如今我國對OPO的檢測方法仍處于起步階段，2013年6月，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會發(fā)布了關(guān)于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑13-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯》的征集意見稿以及相關(guān)的編制說明，相信隨著我國科研水平的提高，將會有更多的檢驗(yàn)技術(shù)人員參與進(jìn)來，也會研發(fā)出現(xiàn)更為準(zhǔn)確、快捷的檢測技術(shù)；這也會對OPO的合成提供技術(shù)參考，進(jìn)一步提高嬰幼兒配方產(chǎn)品品質(zhì)，使其具有類似于喂養(yǎng)嬰幼兒母乳的營養(yǎng)價值和生理功能價值。

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Overview of 1,3-Oleic Acid 2-Palmitic Acid Triglyceride (OPO) Detection Technology

CHENSheng,CHENJing-chun,HEYa-bin

(SHANGHAI BINO Testing Service Co.,Ltd., Shanghai 200436,China)

Breast milk is the best food for infants in nature, infant formula is the best choice for breast milk substituted. the research value and related detection technology of the breast milk fat substitutes for 1,3-oleic acid 2-palmitic acid triglyceride (OPO)were reviewed, meanwhile, the future development of this technology in the future was prosected.

1,3-oleic acid 2-palmitic acid triglyceride (OPO);breast milk;infant formula;detection technology

TQ914.1

A

1001-9677(2016)03-0026-03