王　晶，王　勇*，李海龍，楊雅麗

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州　730000)

?

黨參水提物對D-半乳糖致衰老小鼠肝脾形態(tài)結(jié)構(gòu)和Bax蛋白及VEGF表達的影響

王晶，王勇*，李海龍，楊雅麗

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730000)

為研究黨參水提物對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟和脾臟組織結(jié)構(gòu)及Bax蛋白及VEGF表達的影響，將100只昆明小鼠隨機分為對照組、D-半乳糖致衰老模型組、低、中、高劑量黨參干預(yù)組.連續(xù)處理42d，隨時監(jiān)測小鼠的體重變化，處理結(jié)束后，稱取臟器質(zhì)量，觀察組織顯微結(jié)構(gòu)，并用免疫組織化學(xué)法檢測Bax蛋白和VEGF在肝臟和脾臟組織的表達.結(jié)果顯示衰老組小鼠肝臟和脾臟指數(shù)明顯下降(P<0.05).多數(shù)肝細(xì)胞水腫，胞漿空淡，呈氣球樣變.脾竇明顯擴張，紅髓范圍擴大，脾小梁明顯增生.Bax蛋白表達明顯增強，VEGF蛋白表達顯著減少.與衰老組相比，黨參干預(yù)高劑量組的臟器指數(shù)明顯增加(P<0.05)，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞體積增大，肝細(xì)胞水腫明顯減輕.白髓紅髓清楚，紅髓范圍減小，脾小梁增生不明顯.Bax蛋白表達明顯減少，VEGF蛋白表達明顯增加.表明黨參水提物可以穩(wěn)定肝脾的組織結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞凋亡，促進血管生成，對衰老小鼠的肝臟和脾臟組織有一定的保護作用.

黨參；衰老；組織形態(tài)；Bax；VEGF

人體以五臟為中心，在衰老過程中，五臟功能的減退是主要的變化.在五臟中，肝臟負(fù)責(zé)造血功能，脾臟與免疫系統(tǒng)有關(guān)，所以，二者與衰老的關(guān)系日益受到重視[1].研究表明，在臟器的衰老過程中細(xì)胞凋亡起著非常重要的作用，而且會逐漸出現(xiàn)血管生成的障礙[2-3].甘肅地道藥材黨參(Codonopsis pilosula，CPPS)，味甘性平、補中益氣，具有提高人體免疫力，抗腫瘤、抗疲勞、延緩衰老的功效，臨床應(yīng)用日趨廣泛[4].Bax蛋白是一種促進細(xì)胞凋亡的蛋白，VEGF可促進血管新生，Bax蛋白和VEGF表達的變化在一定程度上可反映組織的衰老情況.本實驗用免疫組織化學(xué)方法檢測黨參水提物對D-乳糖致衰老模型小鼠肝脾組織BCL-2相關(guān)X蛋白(BCL2-associatedXprotein，Bax)和血管生成因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)表達的影響，從而探討黨參延緩衰老的作用機制.

1　材料與方法

1.1主要藥品與儀器

黨參，采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室鑒定為白條黨參.取黨參100g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1h，第2次加6倍水煎煮1h，合并兩次提取液，過濾后，濃縮成含生藥5×10-4g·L-1的水煎劑，置4 ℃冰箱備用，水煎液每5d制備1次.D-半乳糖(Sigma產(chǎn)品)，臨用前用生理鹽水配制成12g·L-1備用.兔VEGF多克隆抗體、兔Bax蛋白多克隆抗體(北京中杉金橋公司).兔、小鼠免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司).

1.2動物分組及處理

SPF級昆明小鼠100只，2月齡，雌雄各半，體質(zhì)量(18±2)g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗動物中心.適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，分籠群養(yǎng)，自由飲水、攝食，自然光照，室溫20～25 ℃.將小鼠隨機分為對照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)共5組，每組20只，雌雄各半.衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組，每日每只小鼠頸背部皮下注射50g·L-1的D-半乳糖溶液，對照組注射等體積量生理鹽水.黨參干預(yù)組采用灌胃給藥法，每日上午按相當(dāng)于生藥量5,10,15g·kg-1劑量給藥，對照組和衰老模型組灌服等體積生理鹽水，以上連續(xù)處理42d.

1.3組織切片制備

于末次給藥2h后，用10%水合氯醛麻醉動物，取肝臟和脾臟稱量質(zhì)量，分別統(tǒng)計臟器指數(shù).將肝、脾組織置于10%福爾馬林液固定48h，常規(guī)石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，封片后光鏡觀察.

1.4免疫組化染色

3μm石蠟切片脫臘入水,3%過氧化氫孵育15min，抗原修復(fù),正常山羊血清封閉.加入稀釋的一抗(兔VEGF多克隆抗體1∶50稀釋，兔Bax蛋白多克隆抗體1∶100稀釋)，4 ℃過夜.加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育20min.加入辣根過氧化物酶室溫孵育20min.二氨基聯(lián)苯顯色5min，蘇木素襯染，脫水、透明封片.每組染色均設(shè)不加一抗的陰性對照.VEGF和Bax陽性判定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)準(zhǔn).

1.5數(shù)據(jù)采集與處理

從各組免疫組織化學(xué)切片中選擇典型的圖片10張，用ImageProPlusV6 圖像分析軟件檢測免疫組織化學(xué)陽性反應(yīng)產(chǎn)物的光密度.實驗數(shù)據(jù)用Excelt統(tǒng)計分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1肝、脾指數(shù)

與正常對照組相比，衰老模型組脾臟指數(shù)降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與衰老模型組相比，黨參干預(yù)3個劑量組脾臟指數(shù)均升高，高劑量黨參干預(yù)組與衰老模型組相比脾臟指數(shù)升高顯著(P>0.05).與正常對照組相比，衰老模型組肝臟指數(shù)下降，差異顯著(P<0.05)；與衰老模型組相比，黨參干預(yù)3個劑量組肝臟指數(shù)均有增高趨勢，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1).

2.2組織病理分析

在HE染色切片上，對照組小鼠肝細(xì)胞為典型多邊形腺上皮細(xì)胞，以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞形態(tài)完整、整齊；衰老模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，胞漿疏松化，核固縮；黨參低劑量干預(yù)組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)依然不齊，胞漿疏松；黨參中劑量干預(yù)組小鼠肝臟組織部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，但距離中央靜脈略遠(yuǎn)處細(xì)胞排列較亂，胞漿疏松化明顯；黨參高劑量干預(yù)組肝細(xì)胞變性明顯改善，細(xì)胞邊界較為清晰，形態(tài)較完整，細(xì)胞排列也較為整齊(圖1A～E).

表1　小鼠的肝和脾指數(shù)

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與衰老模型組相比，ΔP<0.05.

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup,*P<0.05;Comparedwithagingmodelgroup,ΔP<0.05.

圖1　小鼠肝脾顯微結(jié)構(gòu)

A～E.分別為對照組、衰老模型組、低劑量黨參干預(yù)組、中劑量黨參干預(yù)組、高劑量黨參干預(yù)組小鼠肝臟光鏡結(jié)構(gòu)；F～J.分別為對照組、衰老模型組、低劑量黨參干預(yù)組、中劑量黨參干預(yù)組、高劑量黨參干預(yù)組小鼠脾臟光鏡結(jié)構(gòu)；CHV.中央靜脈；RP.紅髓;TCL;脾小梁;WP.白髓;標(biāo)尺=20μm.

A～E.Lightmicroscopestructureofliverinnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,highdoseofCPPSinverventionalgroupmice;F～J.Lightmicroscopestructureofspleeninnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,highdoseofCPPSinverventionalgroupmice;CHV.centralhepaticvein;RP.redpulp,TCL.trabeculaelienis,WP.whitepulp.Bar=20μm.

對照組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)完整，白髓和紅髓清晰，脾小梁沒有增生；衰老模型組小鼠白髓紅髓不清，脾小梁明顯增生；低劑量黨參干預(yù)組小鼠脾竇有擴張，脾小梁增生明顯；中劑量黨參干預(yù)組小鼠脾臟組織改善不大，脾小梁仍有增生；高劑量黨參干預(yù)組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)正常，白髓紅髓清楚，紅髓范圍擴大，脾小梁增生不明顯(圖1F～J).

2.3Bax蛋白表達的變化

免疫組織化學(xué)顯示Bax蛋白定位于肝細(xì)胞質(zhì)中，其中衰老模型組肝細(xì)胞Bax蛋白的表達陽性率明顯高于對照組(P<0.05)；與衰老模型組比較，高劑量黨參干預(yù)組小鼠Bax蛋白表達陽性率下降(P<0.05)，棕黃色細(xì)胞數(shù)量減少，染色較淺；中低劑量黨參干預(yù)組Bax蛋白表達減少,差異不顯著(P>0.05)(圖2A～E和表2).

在脾組織中，衰老模型組Bax蛋白的表達陽性率明顯高于正常對照組(P<0.05)；與衰老模型組比較，高劑量黨參干預(yù)組小鼠Bax蛋白表達陽性率下降(P<0.05)，而中低劑量黨參干預(yù)組Bax蛋白表達變化不顯著(圖2F～J和表2).

2.4VEGF表達的變化

VEGF表達在肝細(xì)胞質(zhì)中，與正常對照組比較，衰老模型組VEGF表達差異不顯著(P>0.05)；與衰老模型組比較，黨參高低劑量干預(yù)組VEGF表達增高(P<0.05)，中低劑量干預(yù)組VEGF表達變化不顯著(P>0.05)，高劑量干預(yù)組VEGF表達明顯優(yōu)于中低劑量組(圖3A～E和表3).

在小鼠脾臟中，與正常對照組比較，衰老模型組VEGF表達差異不顯著(P>0.05)；與衰老模型組比較，黨參高、中劑量干預(yù)組VEGF表達均有增高，黨參高劑量組VEGF的表達變化顯著(P<0.05)，低劑量干預(yù)組VEGF表達變化不顯著(P>0.05)(圖3F～J和表3).

圖2　小鼠肝臟和脾臟Bax蛋白表達的變化

A～E:正常對照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組小鼠肝組織Bax蛋白的表達；F～J:正常對照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組小鼠脾組織Bax蛋白的表達；標(biāo)尺=100μm.

A～E:TheexpressionofBaxproteininthelivertissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;F～J:TheexpressionofBaxinthespleentissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;Bar=100μm.

表2　Bax蛋白在小鼠肝臟和脾臟組織表達的平均光密度值

注：與正常對照比較，*P<0.05;與衰老模型組比較，ΔP<0.05.

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup,*P<0.05;Comparedwithagingmodelgroup,ΔP<0.05.

圖3　小鼠肝臟和脾臟VEGF的表達變化

A～E:正常對照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組小鼠肝組織VEGF的表達；F～J:正常對照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組小鼠脾組織VEGF的表達；標(biāo)尺=100μm.

A～E:TheexpressionofVEGFinthelivertissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;F～J:TheexpressionofVEGFinthespleentissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;Bar=100μm.

表3　VEGF蛋白在小鼠肝臟和脾臟組織表達的平均光密度值

注：與正常對照組比較，*P<0.05;與衰老模型組比較，ΔP<0.05.

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup, *P<0.05;Comparedwithagingmodelgroup,ΔP<0.05.

3　討論

人體衰老，以五臟變化為先.在本研究中，衰老模型組小鼠肝、脾臟器指數(shù)和組織學(xué)切片與正常小鼠相比均發(fā)生了明顯變化.其中肝細(xì)胞變得腫脹、胞漿疏松，脾小梁增生明顯.作為人體內(nèi)的重要器官，其組織大小結(jié)構(gòu)的異常改變必然導(dǎo)致其功能的下降.而研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予黨參水提物干預(yù)后，組織大小和結(jié)構(gòu)均有所改善，說明藥物對衰老模型的組織損傷有一定的修復(fù)作用.

凋亡蛋白Bax的表達量增多，一方面直接促進細(xì)胞凋亡，另一方面可抑制原癌基因BCL-2的表達，間接促進細(xì)胞凋亡，在多種衰老組織中均發(fā)現(xiàn)其異常表達[5].本研究發(fā)現(xiàn)在D-半乳糖致衰老過程中，肝和脾組織Bax蛋白的表達都有明顯增加.Lee等人發(fā)現(xiàn)隨著大鼠年齡的增加，其腎組織Bax蛋白陽性細(xì)胞也不斷增多[6].此外，在睪丸、腦和卵巢等組織中隨著動物模型的衰老，Bax蛋白的表達都明顯增加[7-9].本研究證實高濃度黨參可以干預(yù)衰老模型肝脾組織Bax蛋白的表達及通過抑制細(xì)胞凋亡起到抗衰老作用，這一結(jié)果進一步證實了我們前期在分子水平研究黨參抗衰老作用機制的發(fā)現(xiàn)[10].

血管形成是一個復(fù)雜的過程,受多種因子的正負(fù)調(diào)控，VEGF是其中作用最強的正調(diào)控因子之一，它通過其特異性受體-血管內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合刺激新生血管的形成[11].很多研究證實在機體衰老過程中，大部分組織中的血管生成會受到抑制[12-13].本研究證實在D-半乳糖致衰老模型肝組織中VEGF的表達明顯低于正常肝組織.而高劑量黨參可以干預(yù)此過程，VEGF的表達比衰老組織有明顯增加.因此，促進血管生成是黨參抗衰老作用的機制之一.

肝脾相關(guān)是中醫(yī)學(xué)五臟相關(guān)理論的重要組成，《素問》中提到“肝生筋,筋生心，心生血,血生脾”，肝脾在生理、病理上息息相關(guān)[14].本研究發(fā)現(xiàn)肝脾兩臟器的組織病理和分子表達在各實驗組中都有明顯的一致性.衰老組小鼠肝脾組織中VEGF表達下降，而Bax蛋白表達卻增加，高劑量黨參干預(yù)組這一表達關(guān)系又被逆轉(zhuǎn).有研究報道衰老所致VEGF的減少會使腎小管上皮細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力減弱，促凋亡蛋白表達的增加，從而促進腎臟的凋亡[15].這說明在衰老肝脾組織中血管生成的抑制與促凋亡蛋白的表達也有密切聯(lián)系，是抗衰老作用的潛在靶點之一.

綜上所述，黨參水提物對D-半乳糖致衰老模型組小鼠的肝脾組織具有一定的保護作用，其作用機制與調(diào)節(jié)血管生成，抑制促凋亡蛋白生成有關(guān).因此，VEGF通路和Bax蛋白促凋亡因子將是黨參抗衰老治療的研究靶點.

[1]關(guān)徐濤,高萍,王冰,等.五臟與衰老關(guān)系初探[J].中醫(yī)學(xué)報,2015,30(10):1433.

[2]吳斌,夏世金,李延萍.衰老的網(wǎng)絡(luò)機制與干預(yù)方法[J].實用老年醫(yī)學(xué),2014,28(2):108.

[3]張春蕾,黃晨,李源.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在心臟的表達特點及衰老對血管生成的影響[J].國際老年醫(yī)學(xué)雜志,2006,27(4):159.

[4]郭美,劉麗莎,何敏,等.黨參抗衰老作用的研究進展[J].中國老年學(xué)雜志,2013,33(5):1205.

[5]YANGWP,GUOWW,LUIHZ,etal.Age-relatedchangesintheratioofMcl-1/Baxexpressionintheratcochlea[J].Acta Otolaryngol,2012,132(2):123.

[6]LEEJH,JUNGKJ,KIMJW，etal.Supressionofapoptosisbycalorierestrictioninagedkidney[J].Exp Gerontol,2004,39(9):1361.

[7]謝艷華,楊倩,周暄宣,等.倒卵葉五加及復(fù)方佳蓉片對衰老大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞BCL-2、Bax的作用[J].陜西中醫(yī),2013,34(9):1257.

[8]萬靜枝,袁丁,狄國杰,等.竹節(jié)參總提物對D-半乳糖致衰老小鼠的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(7):32.

[9]李亞麗,冉戰(zhàn)玲,楚偉,等.中藥六味地黃湯對衰老大鼠卵巢組織Bax/Bcl-2及Caspese-3蛋白表達的影響[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2012,201(10):36.

[10]王晶，李海龍，耿廣琴，等.黨參水提物對D-半乳糖致衰老小鼠肝組織microRNA表達譜的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2016,27(1):11.

[11]YANGWJ,YANGYN,CAOJ,etal.PaxillinregulatesvascularendothelialgrowthfactorA-inducedinvitroangiogenesisofhumanumbilicalveinendothelialcells[J].Mol Med Rep,2015,11(3):1784.

[12]KENTD.Age-relatedmaculardegeneration:Beyondanti-angiogenesis[J].Mol Vis,2014,20(307):46.

[13]KRZYSTOLIK M G,WOODCOME H A,REDDY U.Antiangiogenic therapy with anti-vascular endothelial growth factor modalities for neovascular age-related macular degeneration[J].CochraneDatabaseSystRev,2008,2(2):CD005139.

[14]蔡光先，劉柏炎.肝脾相關(guān)的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)探討[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(7):1361.

[15]KANG D H，ANDERSON S，KIM Y G，et al.Impaired angiogenesis in the aging kidney:vascular endothelial growth factor and thrombospondinl in renal disease[J].AmJkidneyDis,2001,37(3):6011.

(責(zé)任編輯俞詩源)

Effects of the aqueous extract of Codonopsis pilosulaonthehistolomorphstructureandtheexpressionofBaxandVEGFinliverandspleenofagingmouseinducedbyD-galactose

WANG Jing,WANG Yong,LI Hai-long,YANG Ya-li

(School of Midical Laboratory,Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China)

To investigate the effects of Codonopsis pilosula(CPPS) on the liver and spleen histolomorph structure and the expression of Bax and VEGF in liver and spleen of mouse induced by D-galactose,100 mouse(Kunming) are divided into normal control group,aging model group and low/middle/high dose of CPPS inerventional groups randomly.After treatment for 42 days,the changes of the liver coefficient and spleen coefficient are recorded,the morphologic changes of these tissues are observed,and the changes in the expression of Bax and VEGF in liver and spleen are also determined by immunohistochemical method.Results show that the liver coefficient and spleen coefficient of aging model group are significantly decreased(P<0.05),and markedly swelled,surface is rough and presenting bright red.The positive expression of Bax protein is increased significantly in liver and spleen of aging model group,while positive expression of VEGF protein is decreased significantly(P<0.05).Compared with aging model group,the organ coefficients in the high dose of CPPS interventional group are significantly increased(P<0.05),the liver swollen is significantly mitigated,and surface is smooth.The positive expression of Bax protein is decreased significantly in liver and spleen of high dose of CPPS interventional group,while the positive expression of VEGF protein is increased significantly(P<0.05).All results indicate that CPPS can stabilize the histolomorph structure,inhibit the excessive apoptosis of cells,and promote angiogenesis,which can protect the liver and spleen of aging mouse induced effectively.

Codonopsis pilosula;aging;tissuehistolomorph;Bax;VEGF

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.04.016

2016-03-03;修改稿收到日期:2016-04-12

甘肅省高等學(xué)?？蒲许椖?2013A-087)；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)青年教師科研基金資助項目(ZQ2015-20)

王晶(1982—)，女，甘肅天水人，副教授，博士.主要研究方向為利用生物芯片進行藥物的篩選、疾病機理研究.E-mail:252993594@qq.com

*通訊聯(lián)系人，男，副教授.主要研究方向為病理法醫(yī)解剖學(xué).E-mail:99773960@qq.com

R339.38

A

1001-988Ⅹ(2016)04-0072-06