王　晶，王　勇*，李海龍，楊雅麗

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州　730000)

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黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝脾形態(tài)結(jié)構(gòu)和Bax蛋白及VEGF表達(dá)的影響

王晶，王勇*，李海龍，楊雅麗

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730000)

為研究黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝臟和脾臟組織結(jié)構(gòu)及Bax蛋白及VEGF表達(dá)的影響，將100只昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、D-半乳糖致衰老模型組、低、中、高劑量黨參干預(yù)組.連續(xù)處理42d，隨時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的體重變化，處理結(jié)束后，稱取臟器質(zhì)量，觀察組織顯微結(jié)構(gòu)，并用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bax蛋白和VEGF在肝臟和脾臟組織的表達(dá).結(jié)果顯示衰老組小鼠肝臟和脾臟指數(shù)明顯下降(P<0.05).多數(shù)肝細(xì)胞水腫，胞漿空淡，呈氣球樣變.脾竇明顯擴(kuò)張，紅髓范圍擴(kuò)大，脾小梁明顯增生.Bax蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，VEGF蛋白表達(dá)顯著減少.與衰老組相比，黨參干預(yù)高劑量組的臟器指數(shù)明顯增加(P<0.05)，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞體積增大，肝細(xì)胞水腫明顯減輕.白髓紅髓清楚，紅髓范圍減小，脾小梁增生不明顯.Bax蛋白表達(dá)明顯減少，VEGF蛋白表達(dá)明顯增加.表明黨參水提物可以穩(wěn)定肝脾的組織結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，對(duì)衰老小鼠的肝臟和脾臟組織有一定的保護(hù)作用.

黨參；衰老；組織形態(tài)；Bax；VEGF

人體以五臟為中心，在衰老過(guò)程中，五臟功能的減退是主要的變化.在五臟中，肝臟負(fù)責(zé)造血功能，脾臟與免疫系統(tǒng)有關(guān)，所以，二者與衰老的關(guān)系日益受到重視[1].研究表明，在臟器的衰老過(guò)程中細(xì)胞凋亡起著非常重要的作用，而且會(huì)逐漸出現(xiàn)血管生成的障礙[2-3].甘肅地道藥材黨參(Codonopsis pilosula，CPPS)，味甘性平、補(bǔ)中益氣，具有提高人體免疫力，抗腫瘤、抗疲勞、延緩衰老的功效，臨床應(yīng)用日趨廣泛[4].Bax蛋白是一種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，VEGF可促進(jìn)血管新生，Bax蛋白和VEGF表達(dá)的變化在一定程度上可反映組織的衰老情況.本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)黨參水提物對(duì)D-乳糖致衰老模型小鼠肝脾組織BCL-2相關(guān)X蛋白(BCL2-associatedXprotein，Bax)和血管生成因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)表達(dá)的影響，從而探討黨參延緩衰老的作用機(jī)制.

1　材料與方法

1.1主要藥品與儀器

黨參，采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室鑒定為白條黨參.取黨參100g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1h，第2次加6倍水煎煮1h，合并兩次提取液，過(guò)濾后，濃縮成含生藥5×10-4g·L-1的水煎劑，置4 ℃冰箱備用，水煎液每5d制備1次.D-半乳糖(Sigma產(chǎn)品)，臨用前用生理鹽水配制成12g·L-1備用.兔VEGF多克隆抗體、兔Bax蛋白多克隆抗體(北京中杉金橋公司).兔、小鼠免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司).

1.2動(dòng)物分組及處理

SPF級(jí)昆明小鼠100只，2月齡，雌雄各半，體質(zhì)量(18±2)g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，分籠群養(yǎng)，自由飲水、攝食，自然光照，室溫20～25 ℃.將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)共5組，每組20只，雌雄各半.衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組，每日每只小鼠頸背部皮下注射50g·L-1的D-半乳糖溶液，對(duì)照組注射等體積量生理鹽水.黨參干預(yù)組采用灌胃給藥法，每日上午按相當(dāng)于生藥量5,10,15g·kg-1劑量給藥，對(duì)照組和衰老模型組灌服等體積生理鹽水，以上連續(xù)處理42d.

1.3組織切片制備

于末次給藥2h后，用10%水合氯醛麻醉動(dòng)物，取肝臟和脾臟稱量質(zhì)量，分別統(tǒng)計(jì)臟器指數(shù).將肝、脾組織置于10%福爾馬林液固定48h，常規(guī)石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，封片后光鏡觀察.

1.4免疫組化染色

3μm石蠟切片脫臘入水,3%過(guò)氧化氫孵育15min，抗原修復(fù),正常山羊血清封閉.加入稀釋的一抗(兔VEGF多克隆抗體1∶50稀釋，兔Bax蛋白多克隆抗體1∶100稀釋)，4 ℃過(guò)夜.加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育20min.加入辣根過(guò)氧化物酶室溫孵育20min.二氨基聯(lián)苯顯色5min，蘇木素襯染，脫水、透明封片.每組染色均設(shè)不加一抗的陰性對(duì)照.VEGF和Bax陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn).

1.5數(shù)據(jù)采集與處理

從各組免疫組織化學(xué)切片中選擇典型的圖片10張，用ImageProPlusV6 圖像分析軟件檢測(cè)免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的光密度.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excelt統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1肝、脾指數(shù)

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組脾臟指數(shù)降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與衰老模型組相比，黨參干預(yù)3個(gè)劑量組脾臟指數(shù)均升高，高劑量黨參干預(yù)組與衰老模型組相比脾臟指數(shù)升高顯著(P>0.05).與正常對(duì)照組相比，衰老模型組肝臟指數(shù)下降，差異顯著(P<0.05)；與衰老模型組相比，黨參干預(yù)3個(gè)劑量組肝臟指數(shù)均有增高趨勢(shì)，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1).

2.2組織病理分析

在HE染色切片上，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞為典型多邊形腺上皮細(xì)胞，以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞形態(tài)完整、整齊；衰老模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，胞漿疏松化，核固縮；黨參低劑量干預(yù)組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)依然不齊，胞漿疏松；黨參中劑量干預(yù)組小鼠肝臟組織部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，但距離中央靜脈略遠(yuǎn)處細(xì)胞排列較亂，胞漿疏松化明顯；黨參高劑量干預(yù)組肝細(xì)胞變性明顯改善，細(xì)胞邊界較為清晰，形態(tài)較完整，細(xì)胞排列也較為整齊(圖1A～E).

表1　小鼠的肝和脾指數(shù)

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與衰老模型組相比，ΔP<0.05.

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup,*P<0.05;Comparedwithagingmodelgroup,ΔP<0.05.

圖1　小鼠肝脾顯微結(jié)構(gòu)

A～E.分別為對(duì)照組、衰老模型組、低劑量黨參干預(yù)組、中劑量黨參干預(yù)組、高劑量黨參干預(yù)組小鼠肝臟光鏡結(jié)構(gòu)；F～J.分別為對(duì)照組、衰老模型組、低劑量黨參干預(yù)組、中劑量黨參干預(yù)組、高劑量黨參干預(yù)組小鼠脾臟光鏡結(jié)構(gòu)；CHV.中央靜脈；RP.紅髓;TCL;脾小梁;WP.白髓;標(biāo)尺=20μm.

A～E.Lightmicroscopestructureofliverinnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,highdoseofCPPSinverventionalgroupmice;F～J.Lightmicroscopestructureofspleeninnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,highdoseofCPPSinverventionalgroupmice;CHV.centralhepaticvein;RP.redpulp,TCL.trabeculaelienis,WP.whitepulp.Bar=20μm.

對(duì)照組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)完整，白髓和紅髓清晰，脾小梁沒(méi)有增生；衰老模型組小鼠白髓紅髓不清，脾小梁明顯增生；低劑量黨參干預(yù)組小鼠脾竇有擴(kuò)張，脾小梁增生明顯；中劑量黨參干預(yù)組小鼠脾臟組織改善不大，脾小梁仍有增生；高劑量黨參干預(yù)組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)正常，白髓紅髓清楚，紅髓范圍擴(kuò)大，脾小梁增生不明顯(圖1F～J).

2.3Bax蛋白表達(dá)的變化

免疫組織化學(xué)顯示Bax蛋白定位于肝細(xì)胞質(zhì)中，其中衰老模型組肝細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；與衰老模型組比較，高劑量黨參干預(yù)組小鼠Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性率下降(P<0.05)，棕黃色細(xì)胞數(shù)量減少，染色較淺；中低劑量黨參干預(yù)組Bax蛋白表達(dá)減少,差異不顯著(P>0.05)(圖2A～E和表2).

在脾組織中，衰老模型組Bax蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；與衰老模型組比較，高劑量黨參干預(yù)組小鼠Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性率下降(P<0.05)，而中低劑量黨參干預(yù)組Bax蛋白表達(dá)變化不顯著(圖2F～J和表2).

2.4VEGF表達(dá)的變化

VEGF表達(dá)在肝細(xì)胞質(zhì)中，與正常對(duì)照組比較，衰老模型組VEGF表達(dá)差異不顯著(P>0.05)；與衰老模型組比較，黨參高低劑量干預(yù)組VEGF表達(dá)增高(P<0.05)，中低劑量干預(yù)組VEGF表達(dá)變化不顯著(P>0.05)，高劑量干預(yù)組VEGF表達(dá)明顯優(yōu)于中低劑量組(圖3A～E和表3).

在小鼠脾臟中，與正常對(duì)照組比較，衰老模型組VEGF表達(dá)差異不顯著(P>0.05)；與衰老模型組比較，黨參高、中劑量干預(yù)組VEGF表達(dá)均有增高，黨參高劑量組VEGF的表達(dá)變化顯著(P<0.05)，低劑量干預(yù)組VEGF表達(dá)變化不顯著(P>0.05)(圖3F～J和表3).

圖2　小鼠肝臟和脾臟Bax蛋白表達(dá)的變化

A～E:正常對(duì)照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組小鼠肝組織Bax蛋白的表達(dá)；F～J:正常對(duì)照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組小鼠脾組織Bax蛋白的表達(dá)；標(biāo)尺=100μm.

A～E:TheexpressionofBaxproteininthelivertissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;F～J:TheexpressionofBaxinthespleentissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;Bar=100μm.

表2　Bax蛋白在小鼠肝臟和脾臟組織表達(dá)的平均光密度值

注：與正常對(duì)照比較，*P<0.05;與衰老模型組比較，ΔP<0.05.

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup,*P<0.05;Comparedwithagingmodelgroup,ΔP<0.05.

圖3　小鼠肝臟和脾臟VEGF的表達(dá)變化

A～E:正常對(duì)照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組小鼠肝組織VEGF的表達(dá)；F～J:正常對(duì)照組、衰老模型組和低、中、高劑量黨參干預(yù)組小鼠脾組織VEGF的表達(dá)；標(biāo)尺=100μm.

A～E:TheexpressionofVEGFinthelivertissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;F～J:TheexpressionofVEGFinthespleentissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;Bar=100μm.

表3　VEGF蛋白在小鼠肝臟和脾臟組織表達(dá)的平均光密度值

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05;與衰老模型組比較，ΔP<0.05.

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup, *P<0.05;Comparedwithagingmodelgroup,ΔP<0.05.

3　討論

人體衰老，以五臟變化為先.在本研究中，衰老模型組小鼠肝、脾臟器指數(shù)和組織學(xué)切片與正常小鼠相比均發(fā)生了明顯變化.其中肝細(xì)胞變得腫脹、胞漿疏松，脾小梁增生明顯.作為人體內(nèi)的重要器官，其組織大小結(jié)構(gòu)的異常改變必然導(dǎo)致其功能的下降.而研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予黨參水提物干預(yù)后，組織大小和結(jié)構(gòu)均有所改善，說(shuō)明藥物對(duì)衰老模型的組織損傷有一定的修復(fù)作用.

凋亡蛋白Bax的表達(dá)量增多，一方面直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡，另一方面可抑制原癌基因BCL-2的表達(dá)，間接促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在多種衰老組織中均發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)[5].本研究發(fā)現(xiàn)在D-半乳糖致衰老過(guò)程中，肝和脾組織Bax蛋白的表達(dá)都有明顯增加.Lee等人發(fā)現(xiàn)隨著大鼠年齡的增加，其腎組織Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞也不斷增多[6].此外，在睪丸、腦和卵巢等組織中隨著動(dòng)物模型的衰老，Bax蛋白的表達(dá)都明顯增加[7-9].本研究證實(shí)高濃度黨參可以干預(yù)衰老模型肝脾組織Bax蛋白的表達(dá)及通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡起到抗衰老作用，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了我們前期在分子水平研究黨參抗衰老作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)[10].

血管形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,受多種因子的正負(fù)調(diào)控，VEGF是其中作用最強(qiáng)的正調(diào)控因子之一，它通過(guò)其特異性受體-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合刺激新生血管的形成[11].很多研究證實(shí)在機(jī)體衰老過(guò)程中，大部分組織中的血管生成會(huì)受到抑制[12-13].本研究證實(shí)在D-半乳糖致衰老模型肝組織中VEGF的表達(dá)明顯低于正常肝組織.而高劑量黨參可以干預(yù)此過(guò)程，VEGF的表達(dá)比衰老組織有明顯增加.因此，促進(jìn)血管生成是黨參抗衰老作用的機(jī)制之一.

肝脾相關(guān)是中醫(yī)學(xué)五臟相關(guān)理論的重要組成，《素問(wèn)》中提到“肝生筋,筋生心，心生血,血生脾”，肝脾在生理、病理上息息相關(guān)[14].本研究發(fā)現(xiàn)肝脾兩臟器的組織病理和分子表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組中都有明顯的一致性.衰老組小鼠肝脾組織中VEGF表達(dá)下降，而Bax蛋白表達(dá)卻增加，高劑量黨參干預(yù)組這一表達(dá)關(guān)系又被逆轉(zhuǎn).有研究報(bào)道衰老所致VEGF的減少會(huì)使腎小管上皮細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力減弱，促凋亡蛋白表達(dá)的增加，從而促進(jìn)腎臟的凋亡[15].這說(shuō)明在衰老肝脾組織中血管生成的抑制與促凋亡蛋白的表達(dá)也有密切聯(lián)系，是抗衰老作用的潛在靶點(diǎn)之一.

綜上所述，黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老模型組小鼠的肝脾組織具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)血管生成，抑制促凋亡蛋白生成有關(guān).因此，VEGF通路和Bax蛋白促凋亡因子將是黨參抗衰老治療的研究靶點(diǎn).

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(責(zé)任編輯俞詩(shī)源)

Effects of the aqueous extract of Codonopsis pilosulaonthehistolomorphstructureandtheexpressionofBaxandVEGFinliverandspleenofagingmouseinducedbyD-galactose

WANG Jing,WANG Yong,LI Hai-long,YANG Ya-li

(School of Midical Laboratory,Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China)

To investigate the effects of Codonopsis pilosula(CPPS) on the liver and spleen histolomorph structure and the expression of Bax and VEGF in liver and spleen of mouse induced by D-galactose,100 mouse(Kunming) are divided into normal control group,aging model group and low/middle/high dose of CPPS inerventional groups randomly.After treatment for 42 days,the changes of the liver coefficient and spleen coefficient are recorded,the morphologic changes of these tissues are observed,and the changes in the expression of Bax and VEGF in liver and spleen are also determined by immunohistochemical method.Results show that the liver coefficient and spleen coefficient of aging model group are significantly decreased(P<0.05),and markedly swelled,surface is rough and presenting bright red.The positive expression of Bax protein is increased significantly in liver and spleen of aging model group,while positive expression of VEGF protein is decreased significantly(P<0.05).Compared with aging model group,the organ coefficients in the high dose of CPPS interventional group are significantly increased(P<0.05),the liver swollen is significantly mitigated,and surface is smooth.The positive expression of Bax protein is decreased significantly in liver and spleen of high dose of CPPS interventional group,while the positive expression of VEGF protein is increased significantly(P<0.05).All results indicate that CPPS can stabilize the histolomorph structure,inhibit the excessive apoptosis of cells,and promote angiogenesis,which can protect the liver and spleen of aging mouse induced effectively.

Codonopsis pilosula;aging;tissuehistolomorph;Bax;VEGF

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.04.016

2016-03-03;修改稿收到日期:2016-04-12

甘肅省高等學(xué)校科研項(xiàng)目(2013A-087)；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)青年教師科研基金資助項(xiàng)目(ZQ2015-20)

王晶(1982—)，女，甘肅天水人，副教授，博士.主要研究方向?yàn)槔蒙镄酒M(jìn)行藥物的篩選、疾病機(jī)理研究.E-mail:252993594@qq.com

*通訊聯(lián)系人，男，副教授.主要研究方向?yàn)椴±矸ㄡt(yī)解剖學(xué).E-mail:99773960@qq.com

R339.38

A

1001-988Ⅹ(2016)04-0072-06