顧棟樺，付琳琳，平金良

CAV1腳手架樣結(jié)構(gòu)域多肽抑制HEp2細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

顧棟樺，付琳琳，平金良

目的研究CAV1腳手架樣結(jié)構(gòu)域（CSD）多肽對(duì)喉鱗癌細(xì)胞株HEp2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制。方法CSD多肽和亂序多肽由人工合成得到，并在N'末端用生物素標(biāo)記，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CSD多肽在HEp2細(xì)胞中的內(nèi)化情況，細(xì)胞生長(zhǎng)能力用MTT法檢測(cè)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)HEp2細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡；免疫印跡法檢測(cè)HEp2細(xì)胞中Erk1/2蛋白的表達(dá)及磷酸化程度。結(jié)果免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示CSD多肽能夠較好的進(jìn)入HEp2細(xì)胞內(nèi)；用CSD多肽處理細(xì)胞能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，使更多的細(xì)胞處于G0/G1細(xì)胞靜止期，并能夠增加HEp2細(xì)胞的凋亡率；CSD多肽不影響HEp2細(xì)胞中Erk1/2蛋白的表達(dá)，但能明顯減少Erk1/2蛋白的磷酸化水平。結(jié)論CSD多肽能夠抑制HEp2細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且促進(jìn)其細(xì)胞凋亡；Erk1/2蛋白的磷酸化水平下降可能是其重要的分子機(jī)制。

Caveilin-1；細(xì)胞生長(zhǎng)；多肽；鱗狀細(xì)胞癌

Caveolin-1（CAV1）是一種細(xì)胞膜蛋白，是構(gòu)成細(xì)胞膜上一種小凹結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵成分。目前研究發(fā)現(xiàn)CAV1在細(xì)胞膜上的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并參與調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為。CAV1蛋白具有一個(gè)腳手架樣結(jié)構(gòu)域（CSD），依賴這個(gè)結(jié)構(gòu)可以和許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白結(jié)合，抑制蛋白的酪氨酸激酶活性［1］。本研究用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)研究人工合成的CSD多肽對(duì)喉鱗癌細(xì)胞株 HEp2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并探討CSD多肽做為抗腫瘤藥物的可行性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1材料與試劑CSD多肽序列由上海翱博生物科技有限公司合成，氨基酸序列為DGI WKA SFT TFT VTK YWF YR，N端連接生物素標(biāo)記，另外以同樣的氨基酸構(gòu)成亂序排列的亂序多肽WFADGI SKT VRKYWFTFT YT做為陰性對(duì)照。多肽用細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM （Sigma公司，美國(guó)）稀釋溶解至終濃度4.0 M后處理培養(yǎng)細(xì)胞。堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素（Biotin）小鼠單克隆抗體（工作濃度1：300）購(gòu)于美國(guó)Jackson Im-

1.2方法

1.2.1免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)多肽的細(xì)胞滲透能力細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中放置24 mm×24 mm蓋玻片，把處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HEp2細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至蓋玻片上，細(xì)胞密度為70%時(shí)，加入CSD多肽，孵育6h后取出蓋玻片，用冷丙酮固定10 min，用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素（Biotin）小鼠單克隆抗體37℃孵育2 h，PBS沖洗后加入NBT/BCIP顯色。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%匯合時(shí)，加入多肽處理6 h后，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用冷檸檬酸緩沖液固定30 min，溴化丙啶染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，增殖指數(shù)（PI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。實(shí)驗(yàn)組分為CSD多肽組、亂序肽組及未處理組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞體外生長(zhǎng)細(xì)胞消化后，按1 000個(gè)/孔密度接種于96孔板中，分為CSD多肽組、亂序肽組及未處理組。在培養(yǎng)的1、2、3、4、5、6、7 d加入MTT 20l/孔，繼續(xù)閉光培養(yǎng)4 h，棄上清加入150 l/孔二甲基亞砜溶解結(jié)晶，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Molecular Devices公司）上讀取吸光值（A），測(cè)定波長(zhǎng)490 nm?？瞻讓?duì)照孔設(shè)為不含細(xì)胞的完全培液。每組設(shè)4孔，結(jié)果取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間為橫軸，A490為縱軸做細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.4免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞呈生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)，用多肽處理，分組同前，處理48h后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）變性電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過(guò)夜，用PBS洗滌后，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，最后用ECL法試劑盒按產(chǎn)品說(shuō)明書步驟顯色。條帶用 Pro Analyzer4.0軟件進(jìn)行積分吸光度（IA）分析，以 -actin作為內(nèi)參。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，CSD多肽組、亂序肽組與未處理組數(shù)據(jù)分析采用檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡

2　結(jié)果

2.1CSD多肽在 HEp2細(xì)胞內(nèi)滲透能力用CSD多肽處理HEp2細(xì)胞6 h后，用免疫細(xì)胞學(xué)檢測(cè)生物素標(biāo)記的 SCD多肽，經(jīng)NBT/BCIP顯色，顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)HEp2細(xì)胞胞質(zhì)中內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)紫色顆粒（圖1）。

2.2CSD多肽對(duì) HEp2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響用多肽處理HEp2細(xì)胞后，用MTT法生成的生長(zhǎng)曲線來(lái)看（圖2），未處理組和亂序多肽組的HEp2細(xì)胞在第5天開始進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期；而用CSD多肽處理的HEp2細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，從第2天開始其A490值（0.79±0.13）比未處理組（1.67±0.43）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=3.38，＜0.05），亂序肽組和未處理組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.34，＞0.05）。

2.3CSD多肽對(duì) HEp2細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響與未處理組相比，CSD多肽組更多的細(xì)胞處于生長(zhǎng)靜止期（G0/G1期）（=5.02，＜0.05），而且S期和G2/M期的細(xì)胞比例低于未處理組（=4.06、4.28，均＜0.05），亂序肽組和未處理組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。CSD多肽組的細(xì)胞凋亡率明顯高于未處理組（=4.93，＜0.05），而未處理組和亂序肽組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.17，＞0.05）。見表1。

2.4CSD多肽對(duì)HEp2細(xì)胞Erk1/2蛋白磷酸化的影響用多肽處理24h后，CSD多肽組磷酸化ERK1/2蛋白明顯低于未處理組，用 -actin作為內(nèi)參校正后，CSD多肽組磷酸化ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量為未處理組的61.29%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=2.94，＜0.05）；未處理組和亂序肽組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.42，＞0.05）。見圖3。

3　討論

CAV1是 caveolae的主要功能蛋白，其基因位于7號(hào)染色體q31.1，這個(gè)區(qū)域是許多腫瘤容易發(fā)生丟失的脆性位點(diǎn)，形成的蛋白大小為21～24 kD，其N端第14位氨基酸殘基具有酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，C端具有棕櫚?；稽c(diǎn)，第82 ～101氨基酸序列為CAV1的重要功能區(qū)域，具有CSD，依賴這個(gè)結(jié)構(gòu)可以和許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白（如EGFR、G蛋白等）結(jié)合，抑制其酪氨酸激酶活性，并調(diào)節(jié)其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［1］。

近年來(lái)的研究結(jié)果表明許多腫瘤中存在著 CAV1基因表達(dá)及功能的異常，雖然CAV1在不同腫瘤中的作用報(bào)道不一，但在一部分腫瘤中，CAV1表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用，例如很多腫瘤細(xì)胞株的CAV1表達(dá)處于低水平狀態(tài)［2］，增加CAV1基因的表達(dá)水平可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［3-4］。而且一些腫瘤中，如乳腺癌［5］、肝癌［6］及腺泡狀橫紋肌肉瘤［7］等腫瘤組織中，CAV1表達(dá)水平明顯減少，并且CAV1低表達(dá)的患者預(yù)后更差。Jung等［8］的研究中，CAV1陰性的頭頸部鱗癌更易發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，并且預(yù)后不良。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)HEp2細(xì)胞高表達(dá)CAV1基因后，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能力能明顯被抑制［9］，說(shuō)明CAV1在喉鱗癌細(xì)胞中可能起著抑癌基因的作用。

圖1　免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)（NBT/BCIP顯色，×400）

圖2　細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖3　免疫印記法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

CAV1蛋白的腳手架結(jié)構(gòu)是它發(fā)揮生物學(xué)功能的重要結(jié)構(gòu)，Tahir等［10］用CSD肽處理前列腺癌細(xì)胞，能夠有效地減少腫瘤新生血管的生成、抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，用合成的CSD多肽能夠順利滲入HEp2細(xì)胞內(nèi)。用CSD多肽處理HEp2細(xì)胞，能明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，更多的細(xì)胞處于生長(zhǎng)靜止期，并且細(xì)胞凋亡率也明顯上升。結(jié)果說(shuō)明利用CAV1的CSD氨基酸序列體外合成的多肽能夠發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，并且抑制HEp2細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)凋亡。

細(xì)胞的生長(zhǎng)受許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的重要環(huán)節(jié)［11］，目前研究表明CAV1能夠與上皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）結(jié)合，并能夠抑制期下游Erk1/2蛋白的磷酸化程度［1］。本研究結(jié)果顯示用CSD多肽處理HEp2細(xì)胞后，細(xì)胞 Erk1/2蛋白的磷酸化水平明顯下降，提示CSD多肽抑制HEp2細(xì)胞生長(zhǎng)可能與降低 Erk1/2蛋白磷酸化水平以及相關(guān)的生長(zhǎng)信號(hào)通路被抑制有關(guān)。

綜上所述，體外合成的CSD多肽能夠有效進(jìn)入HEp2細(xì)胞內(nèi)，并且能夠抑制HEp2細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，CSD多肽還能抑制Erk1/2蛋白的磷酸化水平，其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)能力可能和 Erk1/2蛋白相關(guān)的生長(zhǎng)信號(hào)通路被抑制有關(guān)，CSD多肽的抑制腫瘤的功能及具體的分子機(jī)制還有待深入研究。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.049

R739.6；R392

A

1671-0800（2016）07-0937-03

湖州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012YSB19、2013GYB11）

313000浙江省湖州，湖州市中心醫(yī)院

顧棟樺，Email：donghuagu @sohu.communoResearch公司，兔抗人Erk1/2多克隆抗體（工作濃度1：1 000）、兔抗人磷酸化Erk1/2多克隆抗體（工作濃度1：1000）購(gòu)自美國(guó)cell signaling公司，鼠抗人 -actin單克隆抗體（工作濃度1：1000）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（工作濃度1：2 000）購(gòu)于上海鼎國(guó)公司，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)（NBT/BCIP）購(gòu)于瑞士Roche公司，ECL法試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。細(xì)胞株及培養(yǎng)條件：人喉鱗癌細(xì)胞HEp2細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC公司，細(xì)胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下用含10%胎牛血清（hyclone公司，美國(guó)）的無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%細(xì)胞密度時(shí)傳代。

2016-03-22（本文編輯：陳志翔）